Summary
Использование репортерных мышей в сочетании с целой Закрепить и секции окрашивания, микроскопии и в анализах естественных условиях облегчает анализ механизмов , лежащих в основе нормального кучность дыхательных путей. Здесь мы опишем, как эти методы способствовали анализу сигналов Wnt в процессе развития трахеи.
Introduction
Развитие дыхательных путей инициируется эмбрионального 9 -й день (E9) с появлением Nkx2.1 положительных клеток в брюшную эндодермальной нежелезистый 1,2. Разделение трубки пищеводного-трахеи будет решать по E11.5 , когда трубки могут быть выделены в качестве отдельных лиц, каждая из которых окружена мезенхимальной ткани 3. Wnt сигнализации играет ключевую роль в спецификации дыхательных путей , как удаление Wnt2 и Wnt2b, выраженное висцеральной мезенхимы и удаление -катенина из энтодермальной эпителия дыхательных путей приводит к недоразвитие легких 4,5. Наши предыдущие исследования установили , что удаление WLS, опосредствующего секреции рецепторов груза всех лигандов Wnt, из результатов энтодермальных дыхательных путей у гипоплазии легких, дефекты развития легочных сосудов и неправильному паттернировании трахеи мезенхимы 6,7. Эти данные подтверждают важность эпителиально-мезенхимальной CROсс говорить в дифференцировке клеток и спецификации, как это также было показано в других исследованиях 8,9.
Изучение самых ранних стадий развития легких полагается на генетические, в пробирке и методов бывших естественных условиях , которые позволили нам лучше понять механизмы вождения дыхательной идентичности 10-16. Целые культуры эксплантов легких на воздухе жидкости интерфазы широко используется для изучения влияния факторов роста на ранних стадиях легочной ветвящегося морфогенеза 10,17,18. В то время как этот метод используется в качестве считывания морфологических изменений, таких как ветвящегося морфогенеза и характером экспрессии генов модуляции, она ограничена изучением ранней стадии процесса развития, поскольку сама культура не поддерживает развитие сосудистой сети 17. Развитие трахеи хряща требует более длительного времени инкубации, которые могут быть не совместимы с этой техникой культуры.
Для Analyzе роль сигналов Wnt при формировании дыхательных путей, мы адаптировали стандартные методы, чтобы удовлетворить потребности наших эмбриональных исследований. Мы изменили объемы, время окрашивания, обработка для езды на велосипеде в парафин и сроки для очистки ткани трахеи-легкие. Основная цель оптимизации методов, описанных в настоящем исследовании, был анализ самых ранних стадий развития трахеи у мышей, которые происходят от E11 до E14.5. Используя репортер мышей линии Axin2LacZ мы точно определенные сайты в / β-катенина активности Wnt в развивающихся трахеи мезенхимы. Мы также адаптировать процедуры окрашивания лектин для всей горе трахеи ткани. Таким образом, мы смогли визуализировать мезенхимальные сгущения и прогнозировать участки, где хондрогенез будут иметь место. Окрашивание всей монтировки и секций эмбриональной ткани , полученные от мышей WlsShhCre, в сочетании с передовыми методами микроскопии, позволили раскрыть роль Wnt лигандов , производимых TRAcheal эпителий трахеи кучность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животных содержали в свободных от патогенов условиях. Мыши были обработаны в соответствии с протоколами, утвержденными CCHMC Институциональные уходу и использованию животных комитета (Цинциннати, Огайо, США). Мыши, используемые на протяжении этих исследований были сохранены в смешанном фоне.
1. Всего горе X-галактозидазы Окрашивание
- Эвтаназии беременных женщин на E11.5 к E14.5, с помощью CO 2 ингаляции. Поместите животных в CO 2 камеры, зарядить камеру с CO 2. Поддерживать животных в камере в течение не менее 5 мин. Выполните вторичный метод эвтаназии путем смещения шейных позвонков.
- Чистый брюшной области с этанолом (EtOH) 70% и выполняют лапаротомию с одной брюшной срединный разрез. Используйте хирургические ножницы и стандартный шаблон (прямые) зубчатые щипцов.
- Изолировать рога матки с помощью пинцета и тонких ножниц и сразу же поместить ткань в чашку Петри, содержащую охлажденный раствор PBS. Поддержание ткани на льду до производствадля изоляции эмбрионов.
- Изолировать эмбрионы из рогов матки. Рассеките эмбриональных тканей трахеи легких с использованием рассекает микроскопом. Использование тонких кончик пинцетом и ножницы для удержания и прокол ткани матки и concepti высвобождая эмбрионов.
- Удалите оставшиеся эмбриональные мембраны. При помощи игольчатых лезвий отрезать головы эмбрионов и нижней части тела ниже диафрагмы. Найдите печень в качестве ориентира.
- После выделения грудной области эмбриона, перейти к удалению боковые стороны стенки тела, позвоночника и сердца с помощью лезвия иглы. Будьте осторожны при удалении сердца, чтобы избежать травм трахеи ткани. И, наконец, осторожно, отделить пищевод от трахеи, потянув за пищевод с помощью игольчатых лопаток. Поддержание ткани в растворе PBS на льду.
- Место ткани в 4 мл флаконы с завинчивающейся пробкой с использованием стекла или передачи пипетки. Закрепить трахеальной ткани легких в 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 30 мин. После фиксации,полоскание ткани с PBS. В то время как полоскание, готовят X-гал окрашивание раствора (добавление 5 мМ K 3 Fe (CN) 6, (100 мкл 0,5 М маточного) 5 мМ K 4 Fe (CN) 6 (100 мкл 0,5 М маточного) 2 мМ MgCl 2, ( 20 мкл 1 М маточного) 0,01% NaDOC (50 мкл 2% акций), 0,02% NP 4 O (100 мкл 2% акций), 1 мг / мл X-Gal (500 мкл 20 мг / мл стоковый) и 9,13 мл дистиллированной воды, чтобы довести до конечного объема 10 мл).
- Удалите все оставшиеся PBS и добавьте 2 мл X-гал окрашивающего раствора в стеклянный флакон. Поместите ампул в лоток на качалке. Пятно ткани от 1 до 2 ч в X-гал красящим раствором. Инкубируйте ткани в X-гал растворе в течение 4 ч для дальнейшей обработки и вложения.
- Остановить реакцию путем промывки тканей в 3% диметилсульфоксиде-PBS. Полоскание в PBS, 3 раза в течение 5 мин каждую стирку и хранить в 70% этаноле.
- Наполните чашки Петри с 1% раствора агарозы / PBS. Разрешить агарозы, чтобы затвердеть. С помощью пипетки переноса стекла, поместите ткань на агарозном соованные пластины, заполненные раствором PBS. Сфотографировать тотальных используя рассекает микроскопа. Выберите соответствующий фильтр для светлого поля.
- Для того, чтобы лучше различать участки X-гал образцов процесса окрашивания для парафин и секционирования. Место образцы в тонких кассет экрана.
- Для обработки образцов для парафин использовать автоматизированный процессор и настроить короткий цикл следующим образом: шесть изменений алкоголя: 5 мин первое изменение и 3 мин на каждого оставшегося изменения. Три изменения ксилола: 5 мин Первое изменение и 3 мин Следующие два изменения. Предыдущие этапы выполняются при 30 ° С. И, наконец, выполнить три изменения парафина при 62 ° C: 25 мин, 8 мин и 5 мин.
- Orient образцы для встраивания с ткани лежал на дне лодки. Встраивание Аккуратно добавить парафин, чтобы заполнить вложение лодку. Немедленно охладить на холодной плите не встраивание станции до парафиновых затвердевает. Удалить блок от вложения лодки. Используя микротом, генерировать 6 мкм Sections. секции для монтажа на предварительно подготовленные горками и сухие слайды на слайде теплее набора при 42 ° С в течение 1 ч.
- Выпекать слайды на ночь в духовке при температуре 56 ° С. Поместите слайды в стойках. Deparaffinize скользит с тремя заменами 100% ксилола, 10 мин каждый. С помощью окрашивания блюда, заполненные 200 мл ксилола.
- Увлажняет слайды, используя градуированную серию EtOH (100%, 70%, 50% и 30%, 1 мин на шаг) для PBS, прежде чем counterstaining с Nuclear Fast Red от 10 до 30 сек. Промыть слайды с водопроводной водой три раза в течение 5 минут каждый раз, чтобы удалить избыток ядерного Fast Red.
- Высушить слайды в серии градуированных этанола (50%, 70% и 100% этиловом спирте) перед стиркой в трех сменах ксилола (20 провалы каждое изменение) и крышку с проскальзывание на основе ксилола монтажа средств массовой информации.
2. лектин Окрашивание
- Проанализируйте E13.5 и E14.5 трахеи легочной ткани, как описано в пунктах 1.1 до 1.4. Использование TRANSFER стекла пипеток место ткани в завинчивающейся крышкой флаконах. Фикс трахеи легочной ткани с 2 мл2% раствор ПФА в течение ночи при температуре 4 ° С. После фиксации ополоснуть образцы в PBS три раза в течение 10 минут каждого мытья.
- Подготовка блокирующего буфера, обычно конечного объема 10 мл раствора. Добавить 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (1%) до 8 мл ФБС. Разрешить БСА распустить. Добавить 0,2 мл козьей сывороткой (2%) 0.03ml Тритона Х-100 (0,3%). Довести конечный объем до 10 мл PBS. Образцы Блочные в течение 1 ч в 0,5 мл блокирующего буфера при комнатной температуре.
- Удалить блокирующий буфер с помощью пипетки передачи и заменить лектина раствора, содержащего 50 мкг / мкл лектина, 10% сыворотки козьего и PBS. С помощью 250 мкл раствора лектина на один образец. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С. Убедитесь в том, чтобы покрыть стеклянный пузырек, содержащий ткань с алюминиевой фольгой. После инкубации с раствором лектина, полоскание образцы в PBS три раза в течение 10 мин.
- Место эксплантов в агарозном покрытием чашки Петри, содержащие достаточное количество PBS для покрытия образцов. Сфотографировать тотальных с помощью флуоресцентного-рассекает микроскоп. Выберите appropетел фильтр для обнаружения флуоресценции. Lectin PNA обычно связан с GFP.
3. Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание и конфокальной микроскопии
- Изолировать трахеи легочной ткани, передать 4 мл стеклянные флаконы с завинчивающейся пробкой и зафиксировать в течение ночи в 4% PFA. E11.5 ткань может быть зафиксирована в 2% PFA. Хранить в метаноле 100%. Образцы могут храниться до нескольких месяцев при -20 ° С.
- Удалить метанола с помощью пипетки передачи и проницаемыми образцов с использованием Bleach Дента (4 части метанола, 1 часть ДМСО и 1 часть 30% H 2 O 2) в течение 2 ч. Сода ткани в серии градуированных метанола, разбавленного в PBS следующим образом: 100% метанола, 75% метанола, 50% метанола, 25% метанола, 100% PBS. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре в течение каждой стадии гидратации.
- Блок ткани в 0,5% блокирующего реагента , разведенного в PBS (см Материалы для деталей) в течение двух часов при комнатной температуре при перемешивании.
- Развести первичных антител в блокирующемраствор (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) и инкубировать образцов в течение ночи при температуре 4 ° С. Образцы Wash с PBS пять раз при комнатной температуре. Выполнение каждого мытья в течение 1 часа.
- Применение вторичного антитела в разведении 1: 500 в 0,5% блокирующего раствора. Тщательно выбрать вторичные антитела для предотвращения связывания между вторичными антителами. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С в темном помещении. Wash образцы три раза в течение 20 мин при комнатной температуре. Высушить образцов в серии градуированных метанола, разбавленного в PBS следующим образом: 25% метанола, 50% метанол 75% метанола, 100% метанола, 10 мин каждый шаг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что образцы остаются покрыты алюминиевой фольгой и свести к минимуму воздействие света. Ткань Теперь можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель, пока не фотографировали. - Образцы Передача на заказ стадии пластины, удалить метанол и ясно , с приблизительно 200 мкл прозрачного раствора Мюррея 19,20 (2 части бензилбензоат, 1 часть бензиловый спирт) немедленно BEFруды изображений. Фотографируйте с помощью конфокальной микроскопии. Обработки и анализа изображения с помощью программного обеспечения визуализации.
4. пролиферации клеток
- Вводят E11.5 беременных мышей внутрибрюшинно с раствором BrdU в концентрации 100 мкг / BrdU г массы тела. Жертвоприношение женщина, как описано в разделе 1 протокола и выделения эмбрионов на E12.5 или E13.5. С помощью лезвия ножа, акцизные головки и нижнюю часть тела ниже грудной полости.
- Поместите грудную ткань в 4 мл флаконы с завинчивающейся пробкой и зафиксировать в 1 мл 4% PFA в течение ночи. Вымойте образцы с PBS дважды в течение 5 мин и обезвоживают образцов через серию Этанол, разведенной в дистиллированной воде до 70% этанола следующим образом: 30%, 50% и 70% этанола, в течение 5 минут каждый шаг.
- Место образцы среднего размера экрана кассет. Процесс ткани для парафин с использованием и автоматизированного процессора. Настройка цикла следующим образом: шесть изменений алкоголя в течение 8 мин каждая, три изменения ксилола в течение 6 минут каждая, три грhanges парафина, в течение 25 мин, 9 мин и 8 мин.
- Встраивание в парафин ориентируя ткани в нужном положении, чтобы генерировать поперечные 6 мкм или продольные разрезы, как описано в разделе 1. Место разделов на слайдах и позволяют ткани придерживаться слайд на слайд теплее набора при 42 ° С в течение 1 ч.
- Выпекать слайды, на боку, на ночь в духовке при температуре 56 ° C. Поместите слайды в пластиковых стойках. Де-paraffinize слайды путем погружения в трех сменах 100% ксилола, 10 мин на изменение. С помощью 200 мл ксилола, чтобы полностью погрузить в воду слайдов. Увлажняет слайды, используя градуированную серию EtOH (100%, 70%, 50% и 30%, 5 мин на стадии при перемешивании) в PBS (5 мин).
- Выполнить поиск антигена с использованием 10 мМ цитратного буфера, рН 6. Для приготовления 100 мл цитратной буферной смеси 18 мл 0,1 М раствором лимонной кислоты моногидрат и 82 мл 0,1 М цитрат натрия.
- Место образцы в пластиковых Коплин банок, заполненных раствором антигена и поиска информации микроволновой печи в течение 6,5 мин при высокой мощности. Добавить диспропашных воду в Коплин банку для компенсации испарившейся-цитратном буфере и повторного нагрева при 40% мощности в течение 6 мин.
- Заполните Коплин банку вверх с водой, и снова разогреть на 40% мощности в течение 6 мин. раз Микроволновая печь может варьироваться в зависимости от используемой микроволновой печи.
- Разрешить слайды остыть в течение 20 мин при комнатной температуре перед стиральными слайдами в дистиллированной воде в течение 1 мин, а затем PBS в течение 5 мин. После PBS вымыть, блок слайдов в течение 2 ч в блокирующем растворе, содержащий TBS (2,425 г трис-основани и 8.765 г NaCl, разбавленный в 1 л дистиллированной воды) 10% Донки сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина.
- Добавьте первичные антитела, разбавленного в блокирующем растворе (TBS, содержащем 10% Donkey сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина). BrdU (митоз маркер), Nkx2.1 (эпителий дыхательных путей), Sox9 (клетки, которые будут приводить к хряща) и αSMA (гладкомышечные клетки). Инкубируйте слайды в течение ночи при температуре 4 ° С. Используйте метод наложения для сохранения антител. Применить 180 мкл антител к уплотнительной прокладки, а затем прикрепить слайд, как будто покровнымпинг.
- Отделить прокладку путем погружения слайды в дистиллированной воде. После удаления прокладки, моют несвязанного первичное антитело, выполнив шесть 5 мин промывок с использованием TBS, содержащим 0,1% Tween-20.
- Инкубируйте слайды с вторичным антителом, разведенным в блокирующем растворе при разведении 1: 200, в течение 1 ч при комнатной температуре. Выберите вторичные антитела тщательно, чтобы предотвратить нежелательное связывание между ними. Удалить несвязанного вторичные антитела, выполнив три пятиминутного промывок с TBS, содержащим 0,1% Tween.
- Промыть слайдов в 0,1 М Трис-основание дважды в течение 5 мин, а затем 0,05 М Трис-основание в два раза в течение 5 мин. Слайды могут быть оставлены в 0,05 М Трис-основание в то время как coversliping помощью монтажных сред с или без DAPI (1,5 мкг / мл). Храните слайды в папке слайдов при 4 ° C и защищать от света, покрывая папку с алюминиевой фольгой.
- Визуализируйте окрашивания и фотографии с использованием автоматического флуоресцентного микроскопа. Количество меченых-клеток и общее количество клеток в поле зрения, сфотографированных на20X и 40X для определения соотношения пролиферирующих клеток к общему количеству клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
/ Β-катенин активности Wnt
Весь монтаж Lac-Z окрашивания был обнаружен в трахеи-легочной ткани эмбрионов , выделенных из репортером Axin2 Lac -Z мышей 11. Сайты окрашивания указывают / β-катенина активности Wnt. Анализ сечений всей монтирования окрашиванием установлено, что Wnt / β-катенин активность присутствовала в мезенхиме трахеи и в мезенхиме периферийных областях развивающихся легких. В WlsShhCre эмбрионов ( в котором выделение Wnt лигандов из эпителия дыхательных путей была аннулирована) Lac-Z окрашивания почти отсутствует (рис 1).
Мезенхимальных сгущения в трахеи мезенхимы
Важным шагом в хондрогенезе это процесс, с помощью которого мезенхимальные клетки суждено дать гISE хрящ конденсируются. Эти плотные скопления клеток известны как мезенхимальных сгустков. Для того, чтобы проверить, является ли отсутствие хряща наблюдается в WlsShhCre мышей из-за отсутствия мезенхимных конденсатов, трахеи ткани легких от гестационного возраста E12.5 до E14.5 окрашивали ПНА лектина. На E13.5 и E14.5, флуоресценция была обнаружена в периодических полос в трахеи мезенхимы в местах, где будет формироваться хрящи. Отсутствие обнаруживаемого флуоресценции в трахеи ткани WlsShhCre эмбрионов указывает на то, что энтодермальная Wnt сигнализации к трахеи мезенхимы необходим для мезенхимных конденсатов (рисунок 2).
спецификация дыхательных путей клеток
Всего монтаж иммунофлюоресценции трахеи легочной ткани определяли характер экспрессии Sox9, Nkx2.1 и αSMA на E11.5. В трахеи ткани, экспрессия Sox9 является пределоме изд к мезенхиме трахеи непрерывной полосой (стрелка на фигуре 3А и В) , в то время как в развивающихся легких Sox9 наблюдается на периферии дыхательного эпителия (стрелка головок на фигуре 3А, В и С). Nkx2.1 представляет особый характер экспрессии ограничен в эпителии трахеи легкого. Предотвращение секреции Wnt лигандов из эпителия вызывает пониженную экспрессию Sox9 в трахеи мезенхимы, но не влияет на экспрессию Sox9 в периферической эпителия легких. Выражение αSMA не легко обнаружить в трахеи мезенхимы, однако окрашивание было обнаружено на уровне гортани (желтая стрелка, рис 3) и желудка (рисунок 3).
пролиферации клеток в развивающемся трахеи
Пролиферации в эпителии и мезенхимытрахеи была обнаружена после мечения в естественных условиях ткани с BrdU. Разделы трахеи ткани окрашивались антителами, распознающих BrdU, Sox9 и αSMA. Профиль пролиферации в трахеи мезенхимы указывает на то, что уровни Sox9 окрашенных клеток, подвергающегося пролиферации выше, чем уровень αSMA окрашенных клеток, подвергающихся пролиферации. Эта модель распространения , кажется, вернулся в WlsShhCre трахеи (рисунок 4).
Рисунок 1: / β-катенин активность Wnt действует в трахеи мезенхимы ткани E13.5 трахеи легких, изолированный от Axin2-LacZ и WlsShhCre:. Мышей Axin2-LacZ, окрашивали X-Gal (А и В). Срезы ткани трахеи легких были контрастно с быстрым красным (A ', B'). Обратите внимание на отсутствие X-Galокрашивания в WlsShhCre; мышей Axin2-Lac-Z , демонстрирующих отсутствие Wnt / β-катенина активности (B '). E14.5 ткани у мышей Axin2 LacZ окрашивали X-гал изображает участки будущих хрящевых колец (С); Тем не менее, активность Axin2 была ограничена по периферии (стрелка головы) мезенхимных конденсатов (стрелка) (D). Масштабная линейка A, B и C = 500 мкм; B ', D' и D = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: мезенхимальные конденсация в развитии трахеи ткани E13.5 эксплантов трахеи-легочные окрашивали PNA лектина. Контроль трахеи ткани с изображением регионов были мезенхимальные клетки загущенные показано (стрелками А С). Нет мезенхимальные сгущения не были обнаружены в WlsShhCre мышей (B и стрелка в D). C и D изображают более низкое увеличение ткани трахеи-легкого , показанного на А и В. Шкала масштаба А и В = 1 мм; C и D = 2 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: паттерн экспрессии в prechondrogenic целом крепление трахеи Nkx2.1 и Sox9 окрашивание было обнаружено в E11.5 эксплантов.. Панель А изображает изображение контрольной ткани, в то время как панель В показывает оптический разрез управления 20 мкм ткани. Обратите внимание на отсутствие мезенхимальных экспрессии Sox9 в WlsShhCre ткани (стрелка С), бушельт поддержание периферического экспрессии Sox9 (в наконечник стрелы C). αSMA окрашивание обнаружено на низких уровнях в trachealmesenchyme из E11.5 ткани , но наблюдается в области гортани (желтый стрелолист в D и Е), желудок (S) , и оставшиеся сердечной ткани (КТ) (Е). Nkx2.1 выражается в эпителии развития трахеи и легких (D, E). Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Сотовый шаблон пролиферации в prechondrogenic мезенхимы Секции E13.5 эмбрионов окрашивали анти BrdU, Sox9 и αSMA антитела. Панели C и D являются увеличениями из A B соответственно. Пунктирные линии обозначают пределы трахеи эпителия. Примечание Sox9 окрашивали пролиферативный клетки (стрелолист С) и αSMA окрашивали пролиферативный клетки (Arrowhead в D). Т = трахея, Е = пищевод. Шкала бар А и В = 50 мкм, C и D = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
События, лежащие в основе морфогенеза дыхательных путей не полностью, в частности, процессы, необходимые для формирования паттерна проводящих дыхательных путей. Предыдущие исследования использовали методы исключая виво , в котором развивающиеся эксплантаты культивировали при воздушно-жидкостной интерфазе или встроенный в Матригель 21,22. Эти исследования показали, как факторы роста влияют на кучность развивающегося трахеи и образование хряща трахеи. Ограничение этих исследований является то, что архитектура ткани не надлежащим образом и , следовательно, они не могут вполне Повторим процесс хондрогенезе в естественных условиях.
Подход , который мы провели изучение роли сигнального пути Wnt в процессе проведения дыхательные пути паттернирования включены в естественных условиях исследования в сочетании с целыми методов окрашивания Mount, иммунофлуоресценции и визуализации. X-гал окрашивание всей горе ткани с последующим С.Е.ctioning и контр-окрашивание, представляет преимущества по сравнению с окрашиванием парафиновых срезов. Всего монтаж окрашивание позволяет прямое обнаружение мест, где Wnt / β-катенин активность действует. Кроме того, секционирования окрашенными эксплантов определены точные места в мезенхимы, где активность была расположена в дальнейшем ходе развития. Последнее лучше и точное считывание, чем обнаружение экспрессии β-галактозидазы фермента в парафиновых срезах. Хотя ферментативная активность может быть обнаружена в разделах, эта процедура потребует криосрезах, что не всегда будет легко создавать и не может сохранить архитектуру малых выборок. Ограничение в протоколе, описанном в данной статье, является то, что обработка образцов для парафин после окрашивания всей горе приведет к потере сигнала. Таким образом, образцы должны оставаться дольше в X-Gal раствор и его следует использовать более короткий цикл для парафин, чтобы получить хороший сигнал на участках.
С другой стороны, вся процедура иммунофлюоресценции крепление, модифицированный после методики , описанной Ahnfelt-Ronne 23, позволило трехмерному визуализации развития трахеи и легочной ткани, с определенным рисунком экспрессии белков , кодируемых ключевыми факторами транскрипции , такими как Nkx2.1 и Sox9. При желании, вся гора окрашивание может быть представлена в виде софокусных автоматизированного г стеков изображений, изображающие различные глубины ткани трахеи легких. В то время как визуализации малых эксплантов, очистка ткани должна быть выполнена в плиту. Мы использовали толстые металлическиевыполненное на заказ сценические пластины с оптическим дном, где образцы будут очищены и отображены. Это предотвращает потерю материала при передаче небольшой ткани после очистки шаг. В то время как вся гора иммунофлюоресценции является подходящим методом для окрашивания небольших тканей, мы признаем ограничения в технике. В частности, мы наблюдали разнородные представления антител, которые распознают антиген лучше в секциях, в отличие от всей горе. Эта проблема может препятствовать выполнению метода, если никаких альтернативных антител не доступны. Также возможно, что применение метанола и очистки с Мюррей ясно, может оказать негативное воздействие на сигнал, наблюдаемый. В будущем, мы будем тестировать другие неорганические клиринговые решения и корректировать протокол надлежащим образом для этой цели 24. Окончательное соображение состоит в том, что вся гора позволит изучение нескольких белков, выраженных в ткани в одно время.
Предыдущие отчеты показали полезностьPNA лектин окрашивания для обнаружения мезенхимальные сгущения в разделах трахеи ткани 21,25. В настоящем исследовании авторы сообщают методологию, с помощью которого проводили окрашивание во всей монтировки, что облегчает лучшую визуализацию областей трахею, где хрящ будет сформирован. При выполнении лектина ухода окрашивания должны быть помещены в использовании соответствующей концентрации лектина, чтобы не чрезмерно красителем, в качестве коммерчески доступного ПНК-лектин соединен с GFP. Автофлуоресценции ткани может скрывать результаты делая трудно различить полосы, соответствующие мезенхимальные сгущения.
И, наконец, в естественных условиях маркировки ткани с последующим BrdU секционирования и иммунофлуоресцентного окрашивания является возможным метод для определения пролиферации клеток , которая представляет преимущества по сравнению с типичным и статического окрашивания , такие как PPh3 или PCNA 26,27. Последний метод имеет ограничения, так как окрашивание будет варьироваться в зависимости отстадия клеточного цикла. Эта проблема устраняется с помощью нашего описанной методики. Сочетание маркировки в естественных условиях с последующим вложением, секционирования и иммунофлюоресценции позволили определить , что эпителиальные Wnt лиганды баланс дифференциальной пролиферации Sox9 и a-SMA , выражающую клетки , которые дают начало трахеи хряща и мышцы 7.
Таким образом, многократный-метод подход к изучению кучность развивающихся дыхательных путей позволяет проводить глубокий анализ роли передачи сигналов Wnt в проведении воздушной трассы морфогенез. Эти исследования были определены точные участки Wnt / бета-катенина в трахеи ткани, а также индуктивный и поучительную сигнализацию, представленную трахеи эпителием, который необходим для спецификации, дифференциальной пролиферации клонов трахеи мезенхимового клеток, а также формирование хряща. Наши будущие направления включают в себя оптимизацию всего монтирования для окрашивания недавно выявленных WLSгенов-мишеней, а также выполняя вся гора иммунофлуоресценции в сочетании с лектин окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"Авторы не имеют ничего раскрывать."
Acknowledgments
Мы признаем помощь Майк Muntifering и Мэтт Kofron с конфокальной микроскопии и Gail Маке с гистологическим процедурами. Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения-NHLBI (K01HL115447 к DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A.
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A.
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
