Abstract
الأعصاب الحسية الجسدية تنبيغ الحرارية والميكانيكية والكيميائية، والمحفزات الضارة الناجمة عن كل من وكلاء الذاتية والبيئية. توجد أجسام الخلايا من هذه الخلايا العصبية وارد في العقد الحسية. العقد الحسية يعصب جهاز معين أو جزء من الجسم. على سبيل المثال، توجد العقد الجذرية الظهرية (DRG) في العمود الفقري وتوسيع العمليات في جميع أنحاء الجسم والأطراف. وتقع العقد مثلث التوائم في الجمجمة وعصب الوجه والمجاري التنفسية العليا. afferents العصب الحائر من العقد العقداء تمتد في جميع أنحاء الأمعاء والقلب والرئتين. الخلايا العصبية العقداء تسيطر مجموعة متنوعة من الوظائف مثل: معدل التنفس، وتهيج الشعب الهوائية، وردود الفعل السعال. وهكذا، لفهم والتعامل مع وظيفتها، فمن الأهمية بمكان لتحديد وعزل مجرى الهواء محددة العصبية الفرعية من السكان. في الماوس، ويتعرض الشعب الهوائية إلى الصبغة الكاشفة الفلورسنت، الوجبات الأزرق، للبحث عن المفقودين إلى الوراء ل-مجرى الهواء محددة كثير العقد العصبيةالصورة. ونأت العقدة العقداء ويستخدم مضان خلية المنشط (FAC) الفرز لجمع الخلايا إيجابية الصبغة. بعد ذلك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية (RNA) من صبغ خلايا إيجابية لتسلسل الجيل القادم. باستخدام هذا الأسلوب الهوائية يتحدد التعبير الجيني العصبية محددة.
Introduction
الأعصاب الحسية الجسدية تنبيغ الحرارية والميكانيكية والكيميائية، والمحفزات الضارة الناجمة عن كل من وكلاء الذاتية والبيئية. وتقع الهيئات خلية من هذه الأعصاب وارد في العقد الحسية، مثل الجذر الظهري، مثلث التوائم، أو العقد عقدي. كل العقدة الحسية يعصب مناطق محددة من الجسم، وتحتوي الخلايا التي يعصب أعضاء وأنسجة منفصلة داخل تلك المنطقة. على سبيل المثال، توجد العقد الجذرية الظهرية (DRG) في العمود الفقري وتوسيع العمليات في جميع أنحاء الجسم والأطراف، بينما تقع العقد مثلث التوائم في الجمجمة، والتي تحتوي على الخلايا العصبية التي يعصب الوجه والعينين، السحايا أو العليا الهوائية 1، 2. يقع العقد العقيدي من العصب المبهم في الرقبة تحت الجمجمة ويحتوي على أجسام الخلايا التي تمتد الألياف العصبية في جميع أنحاء الجهاز الهضمي والقلب، وانخفاض الهوائية والرئتين 3. في البشر العقدة العقداء تقف وحدها، ولكن في الماوس وتنصهر ذلكمع العقدة الوريد، والتي يعصب أيضا الرئتين 4. وغالبا ما تسمى هذه العقدة تنصهر الوداجي / معقدة كثير العقد، العقدة العصب الحائر، أو ببساطة العقدة العقداء 5. هنا، ويشار إليها باسم العقدة العقداء.
الألياف وارد في كثير العقد تمرير المعلومات من الأحشاء لنواة السبيل المفرد (NTS) في الدماغ. المدخلات الحسية لهذه العقدة فريدة يسيطر على مجموعة متنوعة من الوظائف، مثل الأمعاء على الحركة 6، 7 معدل ضربات القلب والتنفس 8،9، واستجابات الجهاز التنفسي تنشيط إزعاج 10،11. مع هذا التنوع في الوظائف وأجهزة معصب، فمن الأهمية بمكان لاستهداف وعزل القطعان-جهاز معين من العقدة العقداء من أجل دراسة مسارات العصبية الفردية. ومع ذلك، ونظرا لصغر حجم كثير العقد وعدد محدود من الخلايا العصبية التي يتضمنها هذا ليس بالأمر الهين. كل فأر كثير العقد العقدة يحتوي على ما يقرب من 5000 الخلايا العصبية 12بالإضافة إلى السكان واسعة من دعم الخلايا الأقمار الصناعية. من 5000 الخلايا العصبية العقداء، فقط 3-5٪ يعصب الشعب الهوائية. ولذلك، فإن أي تغييرات وظيفية، المورفولوجية أو الجزيئية في الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب، بسبب تحفيز الجهاز التنفسي أو أمراض، سوف تضيع في العقدة العقداء المزدحمة بالسكان.
لحل هذه المشكلة، تم تطوير طريقة لتحديد وعزل الخلايا العصبية التي يعصب الشعب الهوائية. تعرضت الشعب الهوائية إلى الصبغة الكاشفة الفلورسنت لتحديد اللاحقة الخلايا العصبية التعصيب كثير العقد. اختير سريع الأزرق من قبل الخلايا العصبية، ويسافر بسرعة إلى الهيئات المحمولة الخاصة بهم حيث يتم الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع 13-15. وبمجرد تحديدها، وكان يستخدم لطيف، وكفؤ، بروتوكول التفكك للحفاظ على وضع العلامات صبغ وبقاء الخلية لفلوري خلية المنشط (FAC) وحدة الفرز. تستخدم الخلايا الترتيب لاستخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية (RNA) لتحديد التعبير الجيني أو وأو غيرها من التحليل الجزيئي المصب. يوفر هذا البروتوكول تقنية مفيدة وقوية لعزل الخلايا العصبية الحسية التي يعصب على الأنسجة من الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ديوك.
1. إدارة الطريق الأنفي من الأزرق سريع
للأزرق سريع، إدارة الصبغة لا يقل عن 2 أيام قبل القتل الرحيم الماوس. سوف الصبغة تستمر لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع.
- تخدير الفأر مع التخدير استنشاق خفيفة (2.5٪ سيفوفلوران) حتى التنفس يبدأ في التباطؤ.
- استخدام ماصة 200 ميكرولتر مع نصائح تصفيتها لغرس ببطء 40 ميكرولتر من محلول الصبغة (0.4 ملي سريع الأزرق، 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد، والمياه المالحة DMSO، في الفوسفات، PBS) في الأنف، والتوقف من حين لآخر لضمان الفأر هو الشفط الحل (الشكل 1A).
- عقد الماوس عموديا، يصل رئيس، وتدليك بلطف الصدر لضمان ينتشر صبغ جميع أنحاء الرئتين.
2. الاستعدادات على تشريح وتحليل يوم
- إعداد 10 مل0؛ العقد التفكك الحل (GADS) من خلال الجمع بين المكونات كما هو محدد في الجدول 1.
- أداء استخراج الحمض النووي الريبي في منطقة مختبر مخصصة. قبل البدء في التجربة، وتنظيف الأسطح مع الايثانول 70٪، 10٪ التبييض، وريبونوكلياز إزالة التلوث كاشف. ويشمل ذلك أجهزة الطرد المركزي RNA، أي رفوف أنبوب، والماصات. تأكد من وجود مخصصة صناديق مرشح نصيحة لاستخدام الحمض النووي الريبي فقط. لا تستخدم هذه المعدات والمنطقة لإعداد الحمض النووي، حيث سيؤدي ذلك إلى تلوث العينات.
- مزيج جديدة 70٪، و 80٪ من الإيثانول مع ريبونوكلياز خالية من المياه. إعداد 1 مل لكل عينة لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي.
| عنصر | كمية |
| المتقدم DMEM / F12 | 9.5 مل |
| الجلوتامين | 100 ميكرولتر |
| HEPES (10 ملم) | 100 ميكرولتر |
| ملحق N2 | 100 ميكرولتر |
| B27 (أي فيتامين أ) | 200 ميكرولتر |
| نيسان الخليج (50 ميكروغرام / مل) | 10 ميكرولتر |
الجدول 1. الكاشف خليط لالعقد التفكك الحل (GADS).
3. إجراء تشريح
- ملء أنابيب 1.5 مل مع 500 ميكرولتر GADS، واحد لكل العينة التجريبية، واحد لمراقبة فرز إيجابية، واحد لمراقبة فرز السلبية. مخزن أنابيب على الجليد في جميع أنحاء تشريح.
- تشريح خارج العقدة العقداء وجعل اثنين من التخفيضات الجزئية لتسهيل التفكك، ثم وضعها في أنبوب العينة التجريبية. يرجى الرجوع إلى بروتوكول إن الرب التالية لتشريح العقد العقيدي 16 و 17 DRG.
- تشريح وقطع جزئيا غير المسماة العقد، مثل العقد الجذرية الظهرية (DRG)، لعناصر الفرز. استخدام اثنين من العقد لمراقبة إيجابية واثنين من gangliوللسيطرة سلبية.
- للحصول على الخلايا العصبية كثير العقد كافية للفرز ناجحة، والجمع بين العقد من 5 الفئران في واحدة أنبوب العينة التجريبية التي تحتوي على GADS.
4. الحسية العقد التفكك
- ماصة من 500 GADS ميكرولتر، وترك العقد في الأنبوب. غسل العقد مرة واحدة عن طريق إضافة 1 مل PBS، انتظر العقد لتستقر في قاع الأنبوب، ثم ماصة من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1 مل GADS و 22 ميكرولتر من انزيم الهضم (كولاجيناز I / II ومزيج الأنزيم البروتيني، 2.5 ملغ / مل في H 2 O) إلى كل أنبوب.
- إضافة 20 ميكرولتر سريع الأزرق (5.26 ملم) لأنبوب السيطرة إيجابي.
- وضع الأنابيب في كتلة حمام الماء أو تدفئة بالفعل تعيين عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: المرة من الهضم العقد يعتمد على عمر انزيم الهضم. في غضون شهر 1 من حل انزيم الهضم، الهضم لمدة 30 دقيقة، في 2-6 أشهر هضم لمدة 45 دقيقة. إذا الانزيم أكثر من 6 أشهر من العمر، هضم العقد وأو 60 دقيقة. - وتغطي كل 15 دقيقة أنابيب هزة لفترة وجيزة ونفض الغبار لهم لضمان العقد من الحل.
- في حين يتم هضمها العقد، وإعداد التدرجات كثافة باستخدام محلول الجسيمات (جزيئات السيليكا الغروية المغلفة مع بوفيدون).
- مزيج 12 حل الجسيمات٪ في GADS، 500 ميكرولتر لكل عينة.
- مزيج 28 حل الجسيمات٪ في GADS، 500 ميكرولتر لكل عينة.
- ببطء وبعناية إضافة 400 ميكرولتر 12٪ محلول كثافة فوق 400 ميكرولتر 28٪ محلول الكثافة في أنبوب 1.5 مل الطازجة لكل عينة. لا تسمح طبقتين لخلط. وينبغي أن يكون طبقتين متميزتين مرئية في أنبوب. واحدة أغمق من جهة أخرى.
- في حين يتم هضمها العقد، تسمية الأنابيب الجديدة 1.5 مل جمع للفرز (واحد أزرق ايجابية واحدة سريعة أنبوب سلبي أزرق سريع في فرز عينة). تبعا لاحتياجات المنشأة والفرز، ويجب أن يكون هذه الأنابيب أغطية للانفصال وذلك لعدم INTERFERالبريد مع فارز الخلية.
- بعد وقت الهضم المناسب، وإزالة GADS مع انزيم الهضم ويغسل العقد مرتين مع 1 مل برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من GADS جديدة إلى كل أنبوب.
- استخدام ماصة 200 ميكرولتر، لتعيين 100 حجم ميكرولتر، والعقد ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر الخلايا عن بعضها البعض. كرر حتى لا ترى قطعة سليمة من الأنسجة. تجنب خلق فقاعات في الحل.
- تمر خلايا فصلها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون.
- إضافة 100 ميكرولتر GADS آخر لأنبوب تفارق الأصلي لالتقاط أي الخلايا الضالة الذين تبقوا وتمرير حل إضافي من خلال مصفاة الخلية. باستخدام طرف ماصة جديدة، وجمع أي سوائل التي تحتوي على الخلايا المتبقية التي مرت من خلال مصفاة وتمسكوا شبكة. الحجم النهائي للخلايا معلقة في GADS 300 ميكرولتر.
- طبقة بعناية 300 ميكرولتر من الخلايا على أعلى درجة الكثافة التي سبق. تجنب فقاعات وخلط جملتعلمي اللغة اإلنكليزية مع الطبقات كثافة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2900 x ج في RT.
- في حين أن الخلايا هي في أجهزة الطرد المركزي، مزيج تحلل العازلة (1 مل لكل عينة تجريبية) على النحو التالي: 10 ميكرولتر 2-المركابتويثانول في 1 مل العازلة RLT (من RNA عدة الاستخراج).
- إضافة 300 العازلة تحلل ميكرولتر لسريع أنبوب جمع إيجابي الأزرق و 600 ميكرولتر سريع أنبوب جمع السلبي الأزرق (أنابيب وصفت من الخطوة 4.7). هذا الحجم يعتمد على عدد من الخلايا المتوقع أن يتم جمعها. ل<2000 الخلايا، إضافة 300 ميكرولتر، ل> 7000 الخلايا تضيف 600 ميكرولتر. وهذا يضمن الفرز السائل غمد لا يخفف إلى حد كبير من تحلل العازلة.
- مرة واحدة اكتمال الطرد المركزي، وإزالة بعناية وتجاهل الطبقة ميكرولتر كبار 700. تحتوي هذه الطبقة معظم الحطام الخلية التي سوف تتداخل خلاف مع فرز الخلايا.
- إضافة 700 GADS جديدة ميكرولتر إلى الخلية المتبقية تحتوي على حل والماصةالشركة المصرية للاتصالات صعودا وعدة مرات وصولا الى المزيج.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2900 x ج لتكوير الخلايا.
- في حين أن الخلايا هي في أجهزة الطرد المركزي، خلط فرز GADS (500 ميكرولتر لكل عينة) وذلك بإضافة 5 ميكرولتر الدناز (10 ملغ / مل) إلى 1 مل GADS.
- مرة واحدة ويتم الطرد المركزي، وإزالة بعناية وتجاهل طاف، وترك بيليه الخلية.
- اعادة تعليق بيليه خلية في 200-300 GADS ميكرولتر الترتيب بواسطة pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة 1000 ميكرولتر المقرر أن 200 ميكرولتر عدة مرات. وضع العينات على الجليد. الخلايا هي الآن جاهزة للفرز.
5. الإسفار خلية المنشط (FAC) الفرز
ملاحظة: هذا القسم يتطلب معرفة التشغيلية لفارز FACS أو المساعدة من الموظفين المهرة.
- إضافة 1 ميكرولتر يوديد propidium (PI) حل سهم (50 ميكروغرام / مل) لكل عينة لاختبار لبقاء الخلية. تقسيم السيطرة السلبية إلى 2 الأنابيب، واحدة مع PI واحد دون. PI يربط الحمض النووي فقط في الخلايا الميتة. إذابعد أنواع القليلة الأولى هناك أي خلايا ميتة لتسمية، ليست هناك حاجة لاستخدام PI.
- خلايا النقل في التدفق الخلوي الصك، على سبيل المثال، دينار بحريني FACS AriaII تشغيل المغنية 8 البرمجيات، على الجليد.
- منذ حجم الخلية هو متغير في هذه الفئة من السكان، واستخدام فوهة كبيرة (100 ميكرون) للفرز. لتقليل مقدار الضغط تجربة الخلايا وزيادة قابلية الخلية تستخدم ضغط منخفض (20 رطل).
- استخدام البرنامج فارز FACS لإعداد المؤامرات التحليل، مبعثر إلى الأمام، الجانب مبعثر (SSC)، الأزرق سريع، وPI، إذا لزم الأمر.
- لاعادة تعليق الخلايا، دوامة برفق لفترة وجيزة عينة قبل تحميله في فارز.
- بادئ ذي بدء سيطرة سلبية، لا الأزرق السريع أو PI، لتعيين عتبة باب (الشكل 2A). هذا وسوف يحدد مبلغ تألق ذاتي في خلية السكان. اختياري: تشغيل العينة سلبية مع PI لتحديد ما إذا كان هناك عدد من الخلايا الميتة.
- فرز عينة مراقبة إيجابية (المؤتمر الوطني العراقيubated مع الأزرق السريع)، لتعيين المعلمات التعويض.
- مرة واحدة يتم تعيين بوابات والمعلمات، تبدأ فرز العينات التجريبية. يتم فرز العينات في أنابيب جمع مستعدة تحتوي على العازلة RNA تحلل.
- الاحتفاظ بعينات فرزها على الجليد حتى الفرز خلية كاملة.
- تبدأ الخطوة استخراج الحمض النووي الريبي على الفور بعد أن يتم فرز الخلايا.
6. استخراج الحمض النووي الريبي
- دوامة الخلايا مرتبة في تحلل العازلة لمدة 1 دقيقة إلى التجانس.
- إضافة إلى حجم 1 من 70٪ من الإيثانول ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
- نقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
- كرر حتى يتم تمرير الحجم الكلي للعينة من خلال عمود الدوران.
- إضافة 350 ميكرولتر العازلة RW1 ومواصلة عملية تنقية الحمض النووي الريبي، بما في ذلك خطوة العلاج الدناز، وفقا لprotoco الشركة المصنعةلتر بالنسبة للخلايا.
- مرة واحدة وقد تم استخراج الحمض النووي الريبي، اختبار الحمض النووي الريبي الجودة باستخدام نظام الكهربائي ميكروفلويديك وفقا لمواصفات الشركة الصانعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه الطريقة، وصفت الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب خلال غرس الأنف سريع الأزرق (الشكل 1A). بعد يومين، تظهر سريعة خلايا الأزرق المسمى في العقد العقيدي (الشكل 1C). هذه الخلايا تشكل 3-5٪ من مجموع السكان الخلايا العصبية من العقد عقدي. الأصباغ الوراء الأخرى التي تم استخدامها لهذا الغرض وتشمل الجاذبة (1،1'-dioctadecyl-3،3،3 "، بيركلورات 3'-tetramethylindocarbocyanine) وFluorogold. تعرض الرئة إلى تسميات الجاذبة كثير العقد الخلايا العصبية. ومع ذلك، الجاذبة يستغرق وقتا أطول للوصول إلى العقدة، 7 - بعد 14 يوما تقطير 18،19، واستخدمت بالتالي لصبغ نقلها بنشاط. Fluorogold هو صبغ نقلها بنشاط التي استخدمت أيضا لتسمية الخلايا العصبية الهوائية 14،20. في تجربتنا، ومع ذلك، وصلت مرة واحدة هذه الصبغة في أجسام الخلايا في العقدة العقداء التقطت بسرعة من قبل الخلايا الأقمار الصناعية وليس الخلايا العصبية (لا تظهر البيانات). بسرعةالأزرق هو البديل نقل بنشاط صبغة الفلورسنت أن بنجاح، وبسرعة، والعلامات DRG في الفئران 21 والهوائية-التعصيب الخلايا العصبية كثير العقد 13،14. النهج أزرق سريع، وبالتالي، يبدو أكثر قوة وقابلة للتكرار.
تشريح العقدة العقداء وقد وصفت سابقا 16 ويتضح موقعها لفترة وجيزة في الشكل 1B. يبدأ الهضم على الفور بعد أن تم رفعه في العقد العقداء. لمنع الخلايا العصبية من تكتل معا والسماح لنوع أنظف، واستخدام انزيم الهضم لطيف، قم بإلغاء تحديد أي حطام وإضافة ريبونوكلياز إلى العقد الفرز الحل. تم اختبار عدة يمزج انزيم الهضم للفعالية. وقد حاول مزيج انزيم الهضم خفيفة 22، ومع ذلك، كان لعملية الهضم العقدة الكبار يست قوية بما فيه الكفاية لتحطيم الخلايا في الوقت المناسب. بدلا من ذلك، تستخدم في السابق 23 مزيج من غراء، البروتيني وإنزيم كولاجيناز الخليط، وثبت أن تكون عدوانية جدا وتسبب موت الخلايا غير مرغوب فيه (لا تظهر البيانات). بروتوكول الهضم المذكورة، مع مزيج انزيم معين، وجدت لتكون مثالية لعملية الهضم في الوقت المناسب مع بقاء الخلية عالية.
وقد استخدمت الأساليب السابقة خلية اليدوية قطف مع ماصة الزجاج لفصل الخلايا المسمى من خلايا غير المسماة 24. هذا الأسلوب هو أكثر ملاءمة للتحليل خلية واحدة من عدد قليل من الخلايا. ومع ذلك، مع معدل الحد الأقصى من 48 خلية / ساعة هذا الأسلوب هو غير عملي عندما تحتاج إلى جمع كل السكان من مئات أو آلاف من الخلايا. عندما يكون الهدف هو عزل عالية الجودة RNA، يصبح الوقت متغير رئيسي. من المهم أن يبدأ استخراج الحمض النووي الريبي في أسرع وقت ممكن لمنع تدهور. FAC الفرز يسمح جمع من السكان المسمى بأكمله في ~ 45 دقيقة، وبدأ استخراج الحمض النووي الريبي بعد ذلك مباشرة.
س: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> عند فرز الخلايا العصبية من المهم لمسح الكثير من الحطام من العمليات العصبية كسر. تم استخدام التدرج الكثافة لازالة الانقاض من العينات فصلها. من المهم أن أجهزة الطرد المركزي في قوة عالية بما فيه الكفاية لضمان أن الخلايا العصبية C-الألياف، والتي لديها دائرة نصف قطرها صغير، ~ 5 ميكرون 24، يضطر من خلال التدرج.
الشكل 2A وباء تظهر ضوابط السلبية والإيجابية المستخدمة لضبط بوابات الفرز. كما يمكن أن يرى في الشكل 2C، الأزرق السريع نأت المسمى خلايا العقداء نوع إلى اثنين من السكان. يتم سرد أرقام الهواتف المحمولة التي تم جمعها من هذه العينة في الشكل 2D. فرز الكفاءة لهذا الأسلوب هو 73-85٪. عندما يكون الترتيب الخلايا العصبية المعلمات مبعثر والتشرذم الجانب إلى الأمام لا تضيف خصوصية. منذ الخلايا العصبية ليست كروية لم تتمكن من تقديم تقرير موثوق حجم الخلية هذه المعايير.
والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> للالعائد RNA عالية الجودة، وتحتاج الخلايا ليتم فرزها مباشرة في المخزن المؤقت تحلل وRNA يجب أن يكون استخراجه مباشرة بعد الفرز تم استخدام نظام الكهربائي ميكروفلويديك لاختبار. نوعية من الحمض النووي الريبي (الشكل 3). ويتم تحديد قمم 18S و 28S عبر الكهربائي للهلام تستخدم لحساب عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين). لRNA تسلسل العينة يجب أن يكون أكبر من رين 7. هذا عينة الحمض النووي الريبي هو الآن على استعداد لتكون متسلسلة .
الشكل 1. سريع الأزرق وصفها من مجرى الهواء التعصيب الخلايا العصبية في العقداء العقد من عصب فاجوس. أ) تمثيل سريع تقطير الأنف الأزرق إلى الرئتين. تحت التخدير سيفوفلوران خفيفة، ماصة 40 ميكرولتر من الأزرق سريعة في برنامج تلفزيوني مع 1٪ DMSO في فتحتي الأنف على فأرة الحاسوب، والتأكد من الماوس الشفط في السائل.
الشكل 2. الإسفار المنشط خلية (FAC) الفرز أبواب سريع خلايا الأزرق إيجابي. لإعداد فرز بوابات استخدام سلبي (A) وإيجابي (ب) يسيطر على إنشاء سريع السكان إيجابي الأزرق. هو فصل سيطرة سلبية (أ) الخلايا DRG عشرفي لا يعصب الرئتين. هو فصل مراقبة إيجابية (ب) الخلايا DRG أن يتم تحضين مع الأزرق سريع في المختبر، بعد أن تم تشريح. ويرجع ذلك إلى شكل غير كروية من الخلايا العصبية فصلها، والمعلمات مبعثر والتشرذم الجانب آجلة لا تساعد في تحديد السكان الخلية. C) وهناك نوع تمثيلية من فصل كثير العقد خلايا العقد من الفئران الذين تعرضوا الهوائية إلى سريع الأزرق. D) و عدد خلايا ل(C). تم جمع أكثر من 1،000 الخلايا سريعة الأزرق (FB). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تقييم من الحمض النووي الريبي الجودة وتعيين من الحمض النووي الريبي النزاهة عدد (رين) عن طريق نظام ميكروفلويديك الكهربائي. باستخدام المنتخبنظام rophoresis يتم احتساب نوعية الحمض النووي الريبي من قمم 18S و 28S على صورة جل في الصورة. تمثل أقل الذروة RNA المتدهورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستهداف الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب في العقد العقيدي من العصب المبهم. مرة واحدة وصفت، وفصل في العقد بلطف للحفاظ على النحو الأمثل أعداد الخلايا وقدرتها على البقاء. هذه الخلايا العصبية هي ثم فرزها القوات المسلحة الكونغولية مباشرة إلى تحلل العازلة ويتم استخراج الحمض النووي الريبي. وتكمن أهمية هذا البروتوكول هو القدرة على استهداف وعزل، والحفاظ على نوعية سكانية محددة الخلايا الحسية. يوصف التعبير الجيني في هذه الفئة من السكان صغيرة من الخلايا العصبية، ويتم تحديد مهام جهاز معين والشبكات العصبية.
وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التقدم السريع من خلال عملية التفكك والفرز خلية لاحق. ومن المهم أن جدولة وقت الفرز بحيث يبدأ مباشرة بعد التفكك. ومن الأهمية بمكان أيضا أن جميع الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي الطازجة، مصنوعة من 70٪ و 80٪ حلول الإيثانول النقي، وجميع الأنابيب والمعدات اللازمة لاستخراج الحمض النووي الريبينظيفة وريبونوكلياز مجانا.
هذا البروتوكول يمكن تعديلها بحيث يتم فرز الخلايا بشكل فردي إلى لوحات جيدة لواحد استخراج خلايا الحمض النووي الريبي والتسلسل. ويمكن أيضا أن تستخدم لعزل الخلايا من العقد الحسية الأخرى، مثل العقد الجذرية الظهرية (DRGs). وقد تم حقن صبغة من أجزاء الجسم المختلفة للبحث عن المفقودين إلى DRGs سابقا ووصف 17. ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تعديلها لجمع الخلايا لتحليل وظيفي. بدلا من فرز الخلايا في تحلل العازلة، يتم فرز الخلايا في مستنبت الخلايا العصبية، GADS. هذه الخلايا هي ثم تربيتها وتستخدم للدراسات وظيفية مثل التصوير الكالسيوم، أو الكهربية.
إذا كان السكان إيجابي الأزرق السريع هو أصغر من النتيجة المتوقعة، وشراء انزيم الهضم الجديد. يرتبط ارتباطا عمر انزيم الهضم إلى كفاءة الهضم. يحتاج انزيم الهضم لاستخدامها داخل 1 سنة من تاريخ الشراء. في الحالة التي يكون فيها عدد الخلايا عالية،يتم استخراج الحمض النووي الريبي ونوعية اختبار. إذا تدهور الحمض النووي الريبي وهذا هو إشارة إلى أن الكواشف ليست جديدة، أو تم ملوثة. في هذه الحالة، يجب التأكد من نظافة شاملة في جميع مناطق استخراج الحمض النووي الريبي، الماصات، ورفوف، وشيء من شأنها أن تأتي في اتصال مع أنابيب العينات. جعل ريبونوكلياز الطازجة والدناز الحرة 70٪ و 80٪ من الإيثانول. وينبغي أيضا أن تظل في الماء والايثانول يستخدم لجعل هذه الحلول منفصل من مستلزمات معامل أخرى وتستخدم فقط لاستخراج الحمض النووي الريبي.
FAC الفرز هو وسيلة سريعة وفعالة لعزل خلايا إيجابية الزرقاء سريعة، ومع ذلك، الحد واحد هو أن كثافة الخلية يجب أن يكون 1-2000000 الخلايا في عازلة مل. هذا البروتوكول يدفع الحد من نماذج خلية فارز الحالية. عدد الخلايا في العقدة العقداء صغير. للحصول على العائد خلية كافية لفارز الخلية، ويتم تجميع الخلايا من خمسة حيوانات. حجم الفرز وصفها هو 200-300 ميكرولتر ويحتوي على أقل من 100،000 الخلايا مع وقف التنفيذ. تيترجم له إلى تركيز من حوالي 450،000 الخلايا لكل مل، وأقل كثافة الموصى بها. بديل واحد لاستخدام فارز الخلية هو انتقاء مع الفلورسنت المجهر والزجاج ماصة 24. هذا الأسلوب هو أبطأ، واستخدمت لجمع 30-100 الخلايا في وقت واحد. لذلك، هذا البروتوكول يوفر طريقة الإنتاجية العالية أسرع بالمقارنة مع الطرق القائمة.
وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول القدرة على تحديد الشخصية النسخي من مجموعة سكانية محددة من الأعصاب الهوائية-التعصيب. الحمض النووي الريبي عالية الجودة التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول يمكن استخدامها كقالب لتخليق [كدنا] والقادم التسلسل جيل، وغيرها من التقنيات لتوصيف Transcriptome على الخلايا العصبية التي تم جمعها. في هذه الطريقة، فإنه يمكن تحديد الجينات التي أو مسارات محددة لهذه الخلايا العصبية. وستساعد هذه المعلومات لتوضيح الدور الوظيفي الذي تلعبه هذه الخلايا العصبية في ظروف فسيولوجية طبيعية. مرة واحدة الأساسيةتم إنشاء أنماط التعبير، ونظام يمكن الطعن من قبل المؤثرات الفيزيائية والكيميائية أو عن طريق الجراثيم لتحديد آثارها على تنظيم الجينات في الخلايا العصبية الرئة التعصيب. وأخيرا، من خلال تحديد التي تنظم الجينات يمكننا تحديد أهداف الدوائية الجديدة والبدء في التحقيق في الآثار المترتبة على علاجات للتدخل مع التغيرات الحادة والمزمنة في وظيفة الأعصاب في أمراض الشعب الهوائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01HL105635 إلى SEJ. فإن الكتاب أود أن أشكر دييغو خامسا Bohórquez للحصول على المشورة الفنية. كما نشكر ر إيان كومينغ للحصول على المساعدة الفنية وأداء التدفق الخلوي في مرفق دوق لقاح الإنسان معهد بحوث التدفق الخلوي الموارد المشتركة (دورهام بولاية نورث كارولاينا). التدفق الخلوي أجريت في مختبر الاحتواء البيولوجي الإقليمي في جامعة ديوك الذي حصل على دعم جزئي للبناء من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
