Abstract
Somatosensoriske nerver transducerer termiske, mekaniske, kemiske og skadelige stimuli forårsaget af både endogene og miljømæssige midler. Cellelegemerne af disse afferente neuroner er beliggende inden for sensoriske ganglier. Sensoriske ganglier innerverer et specifikt organ eller del af legemet. For eksempel er det dorsalrodsganglier (DRG), der ligger i rygsøjlen og udvide processer i hele kroppen og lemmer. Trigeminus ganglier er placeret i kraniet og innerverer ansigtet, og øvre luftveje. Vagus afferenter af de knudrede ganglier udstrække sig gennem tarmen, hjerte og lunger. De knudrede neuroner styre en bred vifte af funktioner såsom: respirationsfrekvens, luftvejsirritation, og hoste reflekser. Således at forstå og manipulere deres funktion, er det afgørende at identificere og isolere luftvejs specifikke neuronale delpopulationer. Hos mus, der luftvejene udsat for et fluorescerende sporstof farvestof, Fast Blue, til retrograd sporing af luftvejs-specifik knudrede neurons. De knudrede ganglier dissocieres og fluorescens-aktiveret celle (FAC) sortering anvendes til at opsamle farvestof positive celler. Dernæst høj kvalitet ribonukleinsyre (RNA) udvundet fra farvestof positive celler til næste generation sekventering. Ved hjælp af denne metode luftveje specifikke neuronal genekspression bestemmes.
Introduction
Somatosensoriske nerver transducerer termiske, mekaniske, kemiske og skadelige stimuli forårsaget af både endogene og miljømæssige midler. Cellelegemerne af disse afferente nerver er placeret i sensoriske ganglier, såsom dorsale, trigeminal eller knudrede ganglier. Hver sensoriske ganglion innerverer specifikke områder af kroppen og indeholder celler, der innerverer separate organer og væv i regionen. For eksempel er det dorsalrodsganglier (DRG), der ligger i rygsøjlen og udvide processer i hele kroppen og lemmer, mens trigeminusganglier er placeret i kraniet, der indeholder neuroner, der innerverer ansigt, øjne, meninges eller øvre luftveje 1, 2. Den knudrede ganglier i vagusnerven ligger i nakken under kraniet og indeholder cellelegemer, som strækker sig nervefibre hele mave-tarmkanalen, hjerte og nedre luftveje og lunger 3. Hos mennesker den knudrede ganglion står alene, men i musen det er fusioneretmed jugularis ganglion, som også innerverer lungerne 4. Denne kondenserede ganglion kaldes ofte jugularis / knudrede kompleks, vagal ganglion, eller blot knudrede ganglion 5. Her er det benævnt knudrede ganglion.
Afferente fibre af knudrede videregive oplysninger fra indvoldene til kernen af det ensomme tarmkanalen (NTS) i hjernestammen. Sensorisk input til denne unikke ganglion styrer en bred vifte af funktioner, såsom tarmmotilitet 6, puls 7, respiration 8,9, og lokalirriterende-aktiverede respiratoriske responser 10,11. Med denne mangfoldighed af funktioner og innerverede organer, er det vigtigt at målrette og isolere organspecifikke subpopulationer af den knudrede ganglion for at studere individuelle nervebaner. Men i betragtning af den lille størrelse af knudrede og det begrænsede antal neuroner indeholder dette ikke er en triviel opgave. Hver mus knudrede ganglion indeholder ca. 5.000 neuroner 12foruden en lang population af støtte satellitceller. Af de 5.000 knudrede neuroner, kun 3 - 5% innerverer luftvejene. Derfor eventuelle funktionelle, morfologiske eller molekylære ændringer inden luftvejs-innerverer neuroner, på grund af respiratorisk stimulation eller patologier, vil gå tabt i den tæt pakkede knudrede ganglion.
For at løse dette problem blev der udviklet en metode til at identificere og isolere neuroner, der innerverer luftvejene. Luftvejene blev udsat for et fluorescerende sporstof farvestof til at identificere de efterfølgende innerverer knudrede neuroner. Fast Blue blev samlet op af neuroner og rejser hurtigt til deres celle organer, hvor det tilbageholdes i op til otte uger 13 - 15. Når identificeret, en blid, men effektiv, dissociation protokol blev anvendt til at bevare mærkning farvestof og cellelevedygtighed for fluorescerende aktiveret celle (FAC) sortering. Sorterede celler anvendes til at ekstrahere høj kvalitet ribonukleinsyre (RNA) til bestemmelse af genekspression eller feller anden nedstrøms molekylær analyse. Denne protokol giver en nyttig og robust teknik til at isolere sensoriske neuroner, der innerverer et væv af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Duke University.
1. intranasal administration af Fast Blue
For Fast Blue, administrere farvestoffet mindst 2 dage før euthanizing musen. Farvestoffet vil vare ved i op til otte uger.
- Bedøver musen med lys indånding anæstesi (2,5% sevofluran), indtil vejrtrækning begynder at bremse.
- Brug en 200 pi pipette med filtrerede tips til langsomt indpode 40 pi farveopløsning (0,4 mM Fast Blue, 1% dimethylsulfoxid, DMSO, i phosphatpufret saltvand, PBS) ind i næseboret, pauser lejlighedsvis at sikre musen opsugning opløsningen (Figur 1A).
- Hold musen lodret, hovedet op, og forsigtigt massere brystet for at sikre farvestoffet spredes i hele lungerne.
2. Præparater på Dissektion og Analyse Day
- Forbered 10 ml0; Ganglier Dissociation Solution (GADS) ved at kombinere ingredienserne som angivet i tabel 1.
- Udfør RNA ekstraktion i et dedikeret lab område. Inden du begynder eksperimentet, rene overflader med 70% ethanol, 10% blegemiddel, og RNase dekontaminering reagens. Dette omfatter RNA centrifuge, eventuelle rør stativer, og pipetter. Sørg er dedikerede filter tip bokse til kun RNA brug. Brug ikke dette udstyr og område til DNA-forberedelse, da dette vil forurene prøverne.
- Bland frisk 70%, og 80% ethanol med RNase-frit vand. Forbered 1 ml pr prøve, der skal anvendes i RNA-ekstraktion.
| Ingrediens | Beløb |
| Avanceret DMEM / f12 | 9,5 ml |
| glutamin | 100 pi |
| HEPES (10 mM) | 100 pi |
| N2 supplement | 100 pi |
| B27 (ingen vitamin A) | 200 pi |
| NGF (50 ug / ml) | 10 pi |
Tabel 1. reagensblanding for Ganglier Dissociation Solution (GADS).
3. Dissektion Procedure
- Fyld 1,5 ml rør med 500 pi GADs, en for hver eksperimentel prøve, en for en positiv sortering kontrol, og en for en negativ sortering kontrol. Opbevar rør på is hele dissektion.
- Dissekere ud knudrede ganglion og lave to partielle snit til at lette dissociation, og derefter sætte det i den eksperimentelle prøveglas. Der henvises til følgende JOVE protokol for dissektion af knudrede ganglier 16 og DRG 17.
- Dissekere og delvist skåret ikke-mærkede ganglier, såsom dorsalrodsganglierne (DRG), til sortering kontroller. Brug to ganglier for den positive kontrol og to Ganglia for den negative kontrol.
- Fremskaffes tilstrækkelige knudrede neuroner for vellykket sortering, kombinere ganglier fra 5 mus i én eksperimentel prøve rør indeholdende gads.
4. Sensory Ganglier Dissociation
- Pipette out 500 pi gads, efterlader ganglier i røret. Vask ganglier gang ved tilsætning af 1 ml PBS, vent ganglier at sedimentere til bunden af røret, så pipette ud PBS.
- Tilsæt 1 ml gads og 22 pi fordøjelse enzym (collagenase I / II og protease mix, 2,5 mg / ml i H2O) til hvert rør.
- Tilsæt 20 pi Fast Blå (5,26 mM) til den positive kontrol røret.
- Sætte rørene i et vandbad eller varmeblok allerede indstillet til 37 ° C.
Bemærk: Tidspunktet for ganglier fordøjelse afhænger af alder af fordøjelsen enzym. Inden for 1 måned efter opløsning af fordøjelsen enzym, fordøje i 30 minutter, inden 2 - 6 måneder fordøje i 45 min. Hvis enzymet er over 6 måneder gammel, fordøje ganglier feller 60 min. - Hver 15 min rysterør kortvarigt og flick dem for at sikre ganglier er dækket af opløsningen.
- Mens ganglier bliver fordøjet, forberede densitetsgradienter bruger partikel opløsning (kolloide silicapartikler overtrukket med polyvinylpyrrolidon).
- Bland 12% partikel opløsning i Gads, 500 pi per prøve.
- Bland 28% partikel opløsning i Gads, 500 pi per prøve.
- Langsomt og forsigtigt tilsættes 400 pi 12% densitet opløsning oven på 400 pi 28% densitet opløsning i en frisk 1,5 ml rør for hver prøve. Lad ikke de to lag for at blande. To forskellige lag skal være synlige i røret; en mørkere end den anden.
- Mens ganglier bliver fordøjet, mærke nye 1,5 ml opsamlingsrør til sortering (en Fast Blue positivt og et Fast Blue negativ rør pr sortering prøve). Afhængigt af sorteringsanlægget krav, skal disse rør har aftagelige låg, således at ikke interfere med cellesorteringsapparatet.
- Efter passende fordøjelse tid, fjerne gads med fordøjelsen enzym og vask ganglier to gange med 1 ml PBS. Tilsæt 200 pi friske gads til hvert rør.
- Brug en 200 pi pipette, sat til 100 pi volumen, og pipette ganglier op og ned flere gange for at bryde cellerne fra hinanden. Gentag, indtil der ikke intakt stykke væv ses. Undgå at skabe bobler i opløsningen.
- Passere dissocierede celler gennem en 70 um cellefilter.
- Tilføj yderligere 100 ul gads til den oprindelige dissociation røret for at afhente eventuelle resterende omstrejfende celler tilbage og videregive den ekstra løsning gennem cellen si. Ved hjælp af en ny pipettespids, indhente alle resterende celleholdige væske, der har passeret gennem sien og holdt fast ved masken. Det endelige volumen af celler suspenderet i GADs er 300 pi.
- lag forsigtigt de 300 pi celler på toppen af den tidligere foretagne densitetsgradient. Undgå bobler og blanding af calen med massefylde lag.
- Centrifuger i 10 minutter ved 2.900 xg ved stuetemperatur.
- Mens cellerne er i centrifugen, bland lysepuffer (1 ml pr eksperimentel prøve) som følger: 10 pi 2-mercaptoethanol i 1 ml buffer RLT (fra RNA-ekstraktion kit).
- Tilsæt 300 pi lysisbuffer til Fast Blue positive opsamlingsrøret og 600 pi til Fast Blue negativ samling rør (rør mærket fra trin 4.7). Dette volumen afhænger af antallet af celler, der forventes at blive indsamlet. For <2.000 celler, tilsættes 300 pi, for> 7.000 celler tilsættes 600 pi. Dette vil sikre sortering sheathvæske ikke væsentligt fortynde lysisbuffer.
- Når centrifugering er færdig, forsigtigt fjerne og kassere det øverste 700 pi lag. Dette lag indeholder hovedparten af cellerester, der ellers vil forstyrre cellesortering.
- Tilføj 700 pi friske gads til den resterende celle indeholdende opløsning og pipettete op og ned flere gange for at blande.
- Centrifuger i 15 min ved 2900 xg til pelletering celler.
- Mens cellerne er i centrifugen, bland sortering gads (500 pi per prøve) ved tilsætning af 5 pi DNase (10 mg / ml) til 1 ml gads.
- Når centrifugering er gjort, forsigtigt fjerne og kassere supernatanten forlader cellepelleten.
- Resuspender cellepelleten i 200 - 300 pi sortering gads ved pipettering op og ned med en 1.000 pi pipette sat til 200 pi flere gange. Sæt prøver på is. Celler er nu klar til at blive sorteret.
5. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortering
Bemærk: Dette afsnit kræver en operationel viden om en FACS sorter eller bistand af faglært personale.
- Tilsæt 1 pi propidiumiodid (PI) stamopløsning (50 ug / ml) til hver prøve for at teste for cellelevedygtighed. Split negativ kontrol i 2 rør, et med PI og en uden. PI binder DNA kun i døde celler. Hvisefter de første par slags er der ingen døde celler at mærke, er ikke nødvendigt at anvende PI.
- Transport celler til flowcytometri instrument, f.eks., BD FACS AriaII kører Diva 8-software, på is.
- Da cellen størrelse er variabel i denne population, bruge en stor dyse (100 um) til sortering. At reducere mængden af stress i celler erfaringer og øge cellernes levedygtighed anvende lavt tryk (20 psi).
- Brug FACS sorteringsanlæg software til at oprette analysen plots, frem scatter, side scatter (SSC), Fast Blue, og PI, hvis det er nødvendigt.
- For at re-suspendere celler, forsigtigt vortex prøven kortvarigt, inden du lægger det ind i sorteringsanlæg.
- Begynd med den negative kontrol, ingen Fast Blue eller PI, for at indstille gate tærskel (figur 2A). Dette vil bestemme mængden af autofluorescens i cellepopulationen. Valgfrit: Kør negativ prøve med PI for at identificere, om der er en population af døde celler.
- Sorter positive kontrolprøve (incubated med Fast Blue), at indstille kompensation parametre.
- Når portene og parametre er indstillet, begynder sortering de eksperimentelle prøver. Prøver sorteres i de fremstillede opsamlingsrør indeholdende RNA lysisbuffer.
- Hold sorterede prøver på is indtil cellesortering er fuldført.
- Begynd RNA ekstraktionstrin umiddelbart efter cellerne er sorteret.
6. RNA-ekstraktion
- Vortex sorterede celler i lysepuffer i 1 minut for at homogenisere.
- Tilsæt 1 volumen på 70% ethanol og mix ved pipettering op og ned flere gange.
- Overfør op til 700 pi af prøven til et spin-søjle. Centrifuger i 15 sek ved 8000 x g. Kassér gennemløbet.
- Gentag, indtil det totale volumen af prøven sendes gennem spin-søjle.
- Tilføj 350 pi Buffer RW1 og fortsætte RNA oprensningsprocessen, herunder DNase behandlingstrin, ifølge producentens protocol for celler.
- Når RNA er blevet ekstraheret, teste RNA kvalitet ved anvendelse af en mikrofluid elektroforese ifølge producentens specifikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under anvendelse af denne metode, er luftvejs-innerverer neuroner mærket ved intranasalt bibringe Fast Blue (figur 1A). Efter to dage, synes Fast Blue mærkede celler i knudrede ganglier (figur 1C). Disse celler udgør 3 - 5% af den samlede neuronale population af knudrede ganglier. Andre retrograde farvestoffer, der er blevet brugt til dette formål omfatter Dil (1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat) og Fluorogold. Lunge eksponering for DII etiketter knudrede neuroner. Men Dii tager længere tid at nå frem til ganglion,, 7 - 14 dage efter, instillation 18,19, blev derfor en aktivt transporteret farvestof anvendes. Fluorogold er en aktivt transporteret farvestof, er også blevet anvendt til at mærke luftvejs neuroner 14,20. Det er vores erfaring, men når dette farvestof nåede celle organer i knudrede ganglion det blev hurtigt samlet op af satellit celler og ikke neuroner (data ikke vist). HurtigBlue er en alternativ transporteres aktivt fluorescerende farvestof, der med succes, og hurtigt, etiketter DRG i rotter 21 og luftvejs-innerverer knudrede neuroner 13,14. Den Fast Blue tilgang synes derfor mere robust og reproducerbar.
Dissektion af den knudrede ganglion er tidligere blevet beskrevet 16 og dens placering er kort illustreret i figur 1B. Fordøjelsen begynder umiddelbart efter knudrede ganglier er blevet skåret. For at forhindre neuroner fra sammenklumpning sammen og giver mulighed for en renere sortere, bruge en mild fordøjelse enzym, fjerne eventuelle rester og tilføje RNase til ganglier sortering løsning. Flere fordøjelse enzym blandinger blev testet for effektivitet. En mild fordøjelse enzym blanding 22 blev forsøgt, men for voksne ganglion fordøjelsen det ikke var stærk nok til at bryde ud celler i tide. Alternativt en tidligere anvendt 23 kombination af papain, proteaseOg collagenase enzymblanding, viste sig at være alt for aggressiv og forårsagede uønskede celledød (data ikke vist). Den skitserede fordøjelse protokol, med den angivne enzymblandingen, viste sig at være det ideelle for en rettidig fordøjelse med høj cellelevedygtighed.
Tidligere metoder har brugt manuel celle plukke med et glas pipette til at adskille mærkede celler fra umærkede celler 24. Denne teknik er bedre egnet til enkelt-celle-analyse af et lille antal celler. Men med en maksimal hastighed på 48 celler / t denne teknik er upraktisk, når hele populationer af hundredvis eller tusindvis af celler skal indsamles. Når målet er at isolere høj kvalitet RNA, tid bliver en central variabel. Det er vigtigt at begynde RNA-ekstraktion så hurtigt som muligt for at forhindre nedbrydning. FAC sortering tillader samling af hele mærket befolkningen i ~ 45 min og RNA ekstraktion startes umiddelbart efter.
o: holde-together.within-side = "1"> Når sorteringen neuroner er det vigtigt at fjerne så meget snavs fra brudte neuronale processer. En densitetsgradient blev anvendt til at fjerne snavs fra de dissocierede prøver. Det er vigtigt at centrifugere ved en høj nok kraft til at sikre, at C-fiber neuroner, som har en lille radius, ~ 5 um 24, tvinges gennem gradienten.
Figur 2A og B viser de negative og positive kontroller bruges til at indstille sortering porte. Som det kan ses i figur 2C, den dissocierede Fast Blue mærkede knudrede celler sortere i to populationer. De celleantal indsamlet fra denne prøve, er anført i figur 2D. Sorteringseffektivitet for denne fremgangsmåde er 73 - 85%. Når sortering neuroner de fremadrettede scatter og side scatter parametre ikke tilføje specificitet. Da neuroner ikke er sfæriske disse parametre var ude af stand til pålideligt at rapportere cellestørrelse.
ent "FO: keep-together.within-side =" 1 "> For høj kvalitet RNA udbytte, skal sorteres direkte i lysepuffer celler og RNA skal udsuges umiddelbart efter sortering Mikrofluidapparat elektroforese system blev anvendt til at teste. kvaliteten af RNA (figur 3). de 18S og 28S toppe bestemmes via gelelektroforese anvendes til at beregne et RNA integritet nummer (RIN). til RNA-sekventering af prøven bør RIN være større end 7. Denne RNA-prøve er nu klar til at blive sekventeret .
Figur 1. Fast Blue Mærkning af Airway innerverer neuroner i knudrede ganglier i vagusnerven. A) En repræsentation af Fast Blue intranasal instillation i lungerne. Under lys sevofluran anæstesi, pipette 40 pi Fast Blue i PBS med 1% DMSO i næseborene med musen, og sørg musen opsugning i væsken.
Figur 2. Fluorescens Aktiveret Cell (FAC) Sortering Gates for Fast Blå Positive Cells. At oprette sortering porte bruger negative (A) og positiv (B) styrer at etablere Fast Blue positive population. Den negative kontrol (A) dissocierede DRG celler thved ikke innerverer lungerne. Den positive kontrol (B) dissocieres DRG-celler, der er inkuberet med Fast Blue in vitro, efter at de er blevet dissekeret. På grund af den ikke-sfæriske form af dissocierede neuroner, vil forward scatter og side scatter parametre ikke hjælpe definere cellepopulationen. C) Et repræsentativt slags dissocieret knudrede gangliaceller af mus hvis luftvejene har været udsat for Fast Blue. D) Den celletal for (C). Over 1.000 Hurtig Blå (FB) celler blev opsamlet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Vurdering af RNA Kvalitet og tildeling af RNA Integritet Number (RIN) Ved hjælp af en Mikrofluid Elektroforese System. Brug en udvalgtrophoresis systemet kvaliteten af RNA beregnes ud fra de 18S og 28S toppe på den afbilledet gel billedet. Den lavere peak repræsenterer nedbrudt RNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at målrette luftvejs-innerverer neuroner i knudrede ganglier i vagusnerven. Når mærket er de ganglier forsigtigt dissocieres til optimalt at bevare celleantal og levedygtighed. Disse neuroner er derefter FAC sorteret direkte i lysebuffer og RNA ekstraheres. Betydningen af denne protokol er evnen til at målrette, isolere, og bevare kvaliteten af en specifik sensorisk celle population. Genekspression er beskrevet i denne lille population af neuroner, og organspecifikke funktioner og neurale netværk identificeres.
De kritiske skridt i denne protokol omfatter hurtig progression gennem dissociation og efterfølgende celle sortering. Det er vigtigt at planlægge sortering tid, således at den begynder umiddelbart efter dissociation. Det er også kritisk, at alle de RNA-ekstraktionsmetoder reagenser er friske, ethanolopløsninger 70% og 80% er lavet frisk, og alle rør og udstyr til RNA-ekstraktioner ren og RNase-frit.
Denne protokol kan modificeres således, at cellerne er sorteret individuelt i brøndplader til enkelt celle RNA-ekstraktion og sekventering. Den kan også anvendes til at isolere celler fra andre sensoriske ganglier, såsom dorsale rodganglier (DRG). Dye injektion af forskellige kropsdele til sporing tilbage til DRG har været beskrevet tidligere 17. Denne protokol kan også modificeres til at indsamle celler til funktionel analyse. I stedet for sortering celler i lysisbuffer cellerne sorteret i neuronal dyrkningsmedium, GADS. Disse celler dyrkes derefter og anvendes til funktionelle undersøgelser såsom calcium imaging, eller elektrofysiologi.
Hvis Fast Blue positive befolkning er mindre end det forventede resultat, købe nye fordøjelse enzym. Alder fordøjelsen enzymet er korreleret til effektiviteten af fordøjelsen. Fordøjelsen enzym skal bruges inden for 1 år efter køb. I det tilfælde, hvor celleantallet er høj,RNA ekstraheres og kvaliteten testes. Hvis RNA nedbrydes dette er en indikation af, at reagenserne ikke er friske, eller er blevet forurenet. I dette tilfælde, skal du sørge for at rengøre alle RNA udvindingsområder, pipetter, stativer, og noget, der vil komme i kontakt med prøverør. Foretag frisk RNase og DNase gratis 70% og 80% ethanol. Den bruges til at gøre disse løsninger vand og ethanol bør også holdes adskilt fra andre lab forsyninger og udelukkende anvendes til RNA ekstraktion.
FAC sortering er en hurtig og effektiv fremgangsmåde til isolering Fast Blue positive celler dog én begrænsning er, at celledensiteten bør være 1 til 2 millioner celler per ml buffer. Denne protokol skubber grænsen for nuværende cellesorteringsapparat modeller. Antallet af celler i knudrede ganglion er lille. For at få en celle udbytte tilstrækkelig til cellesorteringsapparatet cellerne fra fem dyr puljet. Den beskrevne sortering volumen er 200 - 300 pi og har færre end 100.000 suspenderede celler. Thans oversætter til en koncentration på omkring 450.000 celler per ml, under den anbefalede tæthed. Et alternativ til at bruge en cellesorterer er at håndplukke med et fluorescerende mikroskop og glaspipette 24. Denne teknik er langsommere og har været anvendt til at indsamle 30 - 100 celler ad gangen. Derfor er denne protokol giver en hurtigere high-throughput metode sammenlignet med eksisterende fremgangsmåder.
De fremtidige anvendelser af denne protokol omfatter evnen til at bestemme den transkriptionelle profil af en specifik population af luftvejs-innerverer nerver. Den høje kvalitet RNA opsamlet ved hjælp af denne protokol kan bruges som en skabelon for cDNA-syntese og næste generation sekventering, og andre teknikker til karakterisering af transkriptomet af de indsamlede neuroner. På denne måde kan det afgøres, hvilken gener eller veje er specifikke for disse neuroner. Denne information vil medvirke til at belyse den funktionelle rolle disse neuroner spille i normale fysiologiske betingelser. Når grundlæggendeekspressionsmønstre er etableret, kan systemet blive udfordret af fysiske og kemiske stimuli eller patogener for at bestemme deres virkninger på genregulering i lunge-innerverer neuroner. Endelig ved at identificere hvilke gener reguleres vi kan identificere nye farmakologiske mål og begynde at undersøge virkningerne af terapeutika at interferere med akutte og kroniske forandringer af nervefunktion i luftvejssygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støttet af NIH give R01HL105635 til SEJ. Forfatterne vil gerne takke Diego V. Bohórquez for teknisk rådgivning. Vi takker også R. Ian Cumming til teknisk bistand og udføre flowcytometri på Duke menneskelige Vaccine Institute Research flowcytometri Shared Resource Facility (Durham, NC). Flowcytometri blev udført i det regionale biologisk indeslutning Laboratory ved Duke som fik delvis støtte til byggeri fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
