Abstract
Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cel lichamen van deze afferente neuronen bevinden zich in de sensorische ganglia. Sensorische ganglia innerveren een specifiek orgaan of deel van het lichaam. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen. De nervus ganglia bevinden zich in de schedel en innerveren het gezicht, en de bovenste luchtwegen. Vagale afferente vezels van de nodose ganglia zich over de gehele darmen, hart en longen. De nodose neuronen onder controle van een divers scala aan functies, zoals: ademhaling, irritatie van luchtwegen en hoest reflexen. Zo begrijpen en hun functie te manipuleren, is het essentieel om de luchtwegen specifieke neuronale subpopulaties identificeren en te isoleren. Bij de muis, worden de luchtwegen blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof, Fast Blue voor retrograde traceren van luchtweg-specifieke nodosus neurons. De nodose ganglia worden gescheiden en fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sortering wordt gebruikt om kleurstof positieve cellen te verzamelen. Vervolgens wordt hoogwaardige ribonucleïnezuur (RNA) geëxtraheerd uit kleurstof positieve cellen voor de volgende generatie sequencing. Deze methode luchtwegen specifieke neuronale genexpressie bepaald.
Introduction
Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cellichamen van deze afferente neuronen zijn in sensorische ganglia, zoals de dorsale wortel, trigeminale of knobbelige ganglia. Elke sensorische ganglion innerveert specifieke gebieden van het lichaam en bevat cellen die afzonderlijke organen en weefsels innerveren binnen dat gebied. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen, terwijl de trigeminale ganglia liggen in de schedel, bevattende neuronen dat het gezicht, ogen, meninges of bovenste luchtwegen 1 innerveren, 2. De nodose ganglia van de vagus zenuw in de hals onder de schedel en bevat cellichamen die zenuwvezels uitstrekken door het gehele maagdarmkanaal, hart en onderste luchtwegen en longen 3. Bij mensen staat de knobbelige ganglion alleen is echter in de muis is gefuseerdde jugularis ganglion, die ook innerveert de longen 4. Deze gefuseerde ganglion wordt vaak de jugulaire / nodose complex vagale ganglion of gewoon knobbelige ganglion 5. Hier wordt aangeduid als de knobbelige ganglion.
Afferente vezels van de nodose gegevens doorgeven van de ingewanden naar de kern van de solitaire zenuwvezelstreng (NTS) in de hersenstam. Zintuiglijke dit unieke ganglion stuurt een verscheidenheid aan functies, zoals darmmotiliteit 6, 7 hartslag, ademhaling 8,9 en irriterend geactiveerde respiratoire respons 10,11. Met deze verscheidenheid aan functies en geïnnerveerde organen, is het essentieel te richten en te isoleren orgaan-specifieke subpopulaties van de knobbelige ganglion om afzonderlijke zenuwbanen bestuderen. Echter, gezien de geringe omvang van de nodose en het beperkte aantal neuronen die het bevat dit is geen sinecure. Elke muis knobbelige ganglion bevat ongeveer 5.000 neuronen 12naast een uitgebreide populatie ondersteunen satellietcellen. Van de 5000 nodose neuronen, slechts 3-5% innervate de luchtwegen. Daarom is elke functionele, morfologische of moleculaire veranderingen binnen de luchtweg-zenuwcellen, als gevolg van respiratoire stimulatie of pathologieën, gaan verloren in de dicht op elkaar gepakte knobbelige ganglion.
Om dit probleem op te lossen, werd een werkwijze ontwikkeld voor het identificeren en isoleren van neuronen die de luchtwegen innerveren. De luchtwegen werden blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof de volgende innerverende nodose neuronen te identificeren. Fast Blue werd opgepikt door neuronen en reist snel hun cellichamen waar het wordt bewaard tot acht weken 13-15. Eenmaal geïdentificeerd, een zachte, maar efficiënte, dissociatie protocol werd gebruikt om kleurstof etikettering en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden voor fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sorteren. Gesorteerde cellen worden gebruikt om hoge kwaliteit ribonucleïnezuur (RNA) extract genexpressie of f bepalenof andere stroomafwaartse moleculaire analyse. Dit protocol biedt een nuttige en robuuste techniek voor het isoleren van sensorische neuronen die een weefsel van belang innerveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Duke University.
1. intranasale toediening van Fast Blue
Voor Fast Blue, het beheer van de kleurstof ten minste 2 dagen voor euthanasie de muis. De kleurstof zal aanhouden tot acht weken.
- Verdoven van de muis met licht inhalatie-anesthesie (2,5% sevofluraan) tot ademhaling begint te vertragen.
- Gebruik een 200 ul pipet met gefilterd tips langzaam druppelen 40 pl kleurstofoplossing (0,4 mM Fast Blue, 1% dimethylsulfoxide, DMSO, in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) in het neusgat, pauzeren soms de muis waarborgen wordt aanzuigen de oplossing (Figuur 1A).
- Houd de muis verticaal, hoofd omhoog, en zachtjes masseren van de borst te zorgen voor de kleurstof verspreidt door de longen.
2. Voorbereidingen op Dissection and Analysis Day
- Bereid 10 ml0; Ganglia Dissociatie Solution (GADS) door het combineren van de bestanddelen zoals gespecificeerd in Tabel 1.
- RNA-extractie uit te voeren in een speciale lab omgeving. Voor het begin van het experiment te reinigen oppervlakken met 70% ethanol, 10% bleekmiddel en RNase decontaminatie reagens. Dit omvat de RNA-centrifuge, elke tube racks, en pipetten. Zorg ervoor dat er speciale filter tip dozen voor slechts RNA gebruik. Gebruik deze apparatuur en het gebied niet voor DNA voorbereiding, omdat dit de monsters verontreinigen.
- Meng verse 70%, en 80% ethanol met RNase-vrij water. Bereid 1 ml per monster voor gebruik in RNA-extractie.
| Ingrediënt | Bedrag |
| Geavanceerde DMEM / f12 | 9,5 ml |
| glutamine | 100 gl |
| HEPES (10 mM) | 100 gl |
| N2 supplement | 100 gl |
| B27 (geen vitamine A) | 200 gl |
| NGF (50 ug / ml) | 10 gl |
Tabel 1. mengsel van reagentia voor ganglia Dissociatie Solution (GADS).
3. Dissection Procedure
- Vul 1,5 ml buizen met 500 ul GADS, een voor elke experimentele monster, een voor een positieve sorterend controlesignaal en een voor een negatieve sorterend controlesignaal. Store buizen op ijs gedurende dissectie.
- Ontleden de knobbelige ganglion en maak twee gedeeltelijke bezuinigingen op dissociatie te vergemakkelijken, zet het dan in de experimentele monsterbuis. Raadpleeg de volgende Jove protocol voor dissectie van de nodose ganglia 16 en DRG 17.
- Ontleden en gedeeltelijk ongelabelde ganglia, zoals de dorsale wortel ganglia (DRG) gesneden, het sorteren controles. Gebruik twee ganglia voor de positieve controle en twee Ganglieen voor de negatieve controle.
- Om voldoende nodose neuronen voor een succesvolle sortering te verkrijgen, te combineren ganglia van 5 muizen in een experimentele monster buis met gads.
4. Sensorische ganglia Dissociatie
- Pipet uit 500 ul Gads, waardoor ganglia in de buis. Was ganglia eens door toevoeging van 1 ml PBS, wacht ganglia om zich te vestigen op de bodem van de buis, dan pipet uit PBS.
- Voeg 1 ml GADS en 22 ul enzym digestie (collagenase I / II en protease mix, 2,5 mg / ml in H2O) aan elke buis.
- Voeg 20 ul Fast Blue (5,26 mM) aan de positieve controle buis.
- Zet de buizen in een waterbad of verwarmingsblok reeds bij 37 ° C.
Opmerking: De tijd van ganglia digestie afhankelijk van de leeftijd van de spijsvertering enzym. Binnen 1 maand na oplossen van het enzym digestie, verteren 30 min, binnen 2-6 maanden verteren 45 min. Als het enzym dan 6 maanden oud, verteren ganglia fof 60 min. - Elke 15 min schudden buizen kort en flick ze ganglia zorgen, worden gedekt door de oplossing.
- Terwijl ganglia worden verteerd, bereid dichtheidsgradiënten met een deeltjes- oplossing (colloïdale silicadeeltjes bekleed met polyvinylpyrrolidon).
- Meng 12% deeltje oplossing Gads, 500 ul per monster.
- Meng 28% deeltje oplossing Gads, 500 ul per monster.
- Langzaam en voorzichtig voeg 400 ul 12% geconcentreerde oplossing boven 400 ul 28% 's oplossing dichtheid in een nieuwe 1,5 ml buis voor elk monster. Sta niet toe dat de twee lagen te mengen. Twee verschillende lagen moet zichtbaar zijn in de buis; een donkerder dan de andere.
- Terwijl ganglia worden verteerd, labelen nieuwe 1,5 ml collectie buizen voor het sorteren van (een Fast Blue positieve en één Fast Blue negatief buis per sorteren monster). Afhankelijk van de sorteerinrichting eisen moeten deze buizen afneembare deksels zodat niet interferE met de cel sorter.
- Na de juiste spijsvertering tijd, verwijder gads bij de spijsvertering enzym en wassen ganglia tweemaal met 1 ml PBS. Voeg 200 ul vers GADS aan elke buis.
- Gebruik een pipet 200 ul, ingesteld op 100 gl volume en ganglia pipet op en neer meerdere malen cellen splitsen. Herhaal dit totdat er geen intact stukje weefsel wordt gezien. Vermijd het creëren van bubbels in de oplossing.
- Pass gescheiden cellen door een 70 um cel zeef.
- Voeg nog een 100 ul gads naar de originele dissociatie buis te halen eventuele resterende verdwaalde cellen links en laat de extra oplossing door de cel zeef. Met behulp van een nieuwe pipet tip, het verzamelen van alle resterende-cel met vloeistof die door de zeef is gepasseerd en klampte zich vast aan het gaas. Het eindvolume van de cellen gesuspendeerd in 300 pl GADS.
- laag voorzichtig 300 ul van cellen bovenop de eerder dichtheidsgradiënt. Vermijd bubbels en mengen van cells met de dichtheid lagen.
- Centrifugeer 10 minuten bij 2900 xg bij kamertemperatuur.
- Terwijl cellen in de centrifuge, meng lysis buffer (1 ml per experimentele monster) als volgt: 10 pl 2-mercaptoethanol in 1 ml buffer RLT (van RNA extractie kit).
- Voeg 300 ul lysisbuffer naar Fast Blue positieve verzameling buis en 600 pi naar Fast Blue negatieve collectie buis (buizen label uit stap 4.7). Dit volume hangt af van het aantal cellen verwachting te ontvangen. Voor <2.000 cellen, voeg 300 ul, voor> 7000 cellen toe te voegen 600 ul. Dit zal de sortering sheath vloeistof niet significant Verdun de lysisbuffer.
- Zodra centrifugeren is voltooid, verwijder voorzichtig en gooi de top 700 ul laag. Deze laag bevat de meeste celresten die anderszins verstoren celsortering.
- Voeg 700 ul vers gads om de resterende cel bevattende oplossing en pipette boven en beneden een paar keer om te mengen.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2900 xg om de cellen te pelleteren.
- Terwijl cellen in de centrifuge, meng sorteren GADS (500 ul per monster) door het toevoegen van 5 gl DNase (10 mg / ml) tot 1 ml GADS.
- Zodra centrifugeren wordt gedaan, verwijder voorzichtig en gooi supernatant, waardoor de cel pellet.
- Resuspendeer celpellet in 200-300 gl sorteren gads door op en neer pipetteren met een pipet 1000 ul ingesteld op 200 gl meerdere malen. Leg monsters op het ijs. De cellen zijn nu klaar om te worden gesorteerd.
5. Fluorescentie Activated Cell (FAC) sorteren
Opmerking: Dit gedeelte vereist operationele kennis van een FACS sorter of de hulp van geschoold personeel.
- Voeg 1 ul propidiumjodide (PI) voorraadoplossing (50 ug / ml) aan elk monster te testen voor cellevensvatbaarheid. Split negatieve controle in 2 tubes, één met PI en één zonder. PI bindt DNA alleen in dode cellen. Alsna de eerste soort is er geen dode cellen label, het gebruik van PI is niet noodzakelijk.
- Transport cellen om flowcytometrie instrument, bijv., BD FACS AriaII loopt Diva 8-software, op ijs.
- Omdat de cel grootte is variabel in deze populatie, gebruik maken van een groot mondstuk (100 pm) voor het sorteren. Om de hoeveelheid stress de cellen ervaring verlagen en de levensvatbaarheid van de cellen te gebruiken lage druk (20 psi).
- Gebruik de FACS sorter software om de analyse percelen, voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing (SSC), Fast Blue en PI, indien nodig.
- Om opnieuw te schorten cellen, zachtjes vortex het monster kort voordat deze in de sorter.
- Begin met de negatieve controle, geen Fast Blauw of PI, de gate drempel (Figuur 2A) ingesteld. Dit zal de hoeveelheid autofluorescentie in de celpopulatie te bepalen. Optioneel: Voer het negatieve monster met PI vast te stellen of er sprake is van een populatie van dode cellen.
- Sorteer de positieve controle monster (incubated met Fast Blue), een vergoeding parameters in te stellen.
- Zodra de poorten en parameters zijn ingesteld, begint het sorteren van de proefmonsters. Monsters worden gesorteerd in de voorbereide verzamelbuizen bevattende RNA lysisbuffer.
- Blijf gesorteerde monsters op ijs tot de celsortering voltooid.
- Begin RNA-extractie stap onmiddellijk na de cellen worden gesorteerd.
6. RNA-extractie
- Vortex gesorteerd cellen in lysisbuffer gedurende 1 min gehomogeniseerd.
- Voeg 1 volume van 70% ethanol en mix door en neer te pipetteren meerdere malen.
- Transfer tot 700 ul van het monster op een spinkolom. Centrifugeer gedurende 15 seconden bij 8000 x g. Gooi het doorstroomkanaal.
- Herhaal dit tot het totale volume van het monster gecentrifugeerd kolom gevoerd.
- Voeg 350 ul Buffer RW1 verderspelen RNA zuiveringsproces, waaronder DNase behandelingsstap volgens protoco de fabrikantl voor cellen.
- Zodra RNA werd geëxtraheerd, test de RNA kwaliteit met een microfluïdische elektroforese volgens specificaties van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze methode wordt luchtweg-zenuwcellen gemerkt door intranasaal indruppelen Fast Blue (Figuur 1A). Na twee dagen, Fast Blue gemerkte cellen blijken in het nodose ganglia (Figuur 1C). Deze cellen maken op een 3 - 5% van de totale bevolking van de neuronale nodose ganglia. Andere retrograde kleurstoffen die zijn gebruikt voor dit doel omvatten Dil (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat) en Fluorogold. Lung blootstelling aan Dil labels nodosus neuronen. Echter, duurt langer DII naar het ganglion bereiken, 7-14 dagen na instillatie 18,19, werd daarom een actief vervoerd kleurstof gebruikt. Fluorogold is een actief getransporteerde kleurstof die ook is gebruikt luchtwegen neuronen 14,20 labelen. Onze ervaring is echter, zodra deze kleurstof bereikte de cellichamen in de knobbelige ganglion werd snel opgepikt door satelliet cellen en neuronen niet (gegevens niet getoond). SnelBlue is een alternatieve actief vervoerd fluorescerende kleurstof die met succes, en snel, labels DRG bij ratten 21 en luchtweg-innerveren nodose neuronen 13,14. De Fast Blue aanpak lijkt dus meer robuust en reproduceerbaar.
De ontleding van de knobbelige ganglion is eerder beschreven 16 en zijn plaats is beknopt weergegeven in figuur 1B. Spijsvertering begint direct na de nodose ganglia zijn weggesneden. Om neuronen klonteren samen voorkomen en zorgen voor een schonere soort, gebruik dan een zachte spijsvertering enzym, duidelijk vuil en voeg RNase aan de ganglia sorteren oplossing. Meerdere enzym digestie mengsels werden getest op effectiviteit. Een milde spijsvertering enzym mix 22 werd berecht, maar voor volwassen ganglion spijsvertering was niet sterk genoeg cellen uit elkaar te breken in een tijdig. Als alternatief kan een eerder gebruikte 23 combinatie van papaïne, proteaseEn collagenase enzymmengsel, bleek te agressief en veroorzaakt ongewenste celdood (gegevens niet getoond). De digestie geschetste protocol, met de gespecificeerde enzymmengsel, bleek het ideaal voor een tijdige digestie met hoge cellevensvatbaarheid zijn.
Vorige methoden handleiding cel oppakken met een glazen pipet om gelabelde cellen te scheiden van niet-gelabelde cellen 24 gebruikt. Deze techniek is beter geschikt voor single cell analyse van een klein aantal cellen. Echter, met een maximale snelheid van 48 cellen / hr deze techniek onpraktisch als geheel populaties van honderden of duizenden cellen kunnen worden opgehaald. Wanneer het doel is om hoge kwaliteit RNA te isoleren, wordt een tijd variabele sleutel. Het is belangrijk om RNA-extractie beginnen zo snel mogelijk degradatie voorkomen. FAC sorteren maakt verzameling van de gehele bevolking in gelabelde ~ 45 min en RNA-extractie wordt onmiddellijk na gestart.
o: keep-together.within-page = "1"> Bij het sorteren neuronen is het belangrijk om zoveel puin uit gebroken neuronale processen. Een dichtheidsgradiënt werd gebruikt om het vuil te verwijderen van het gedissocieerde monsters. Het is belangrijk te centrifugeren op een voldoende hoog kracht opdat C-fiber neuronen, met een kleine radius, ~ 5 micrometer 24 worden gedwongen door de gradiënt.
Figuur 2A en B tonen de negatieve en positieve controles gebruikt om het sorteerproces poorten stellen. Zoals te zien is in figuur 2C, de gedissocieerde Fast Blue nodose gemerkte cellen sorteren in twee populaties. Het aantal cellen verzameld van dit monster zijn weergegeven in Figuur 2D. Sorteerefficiëntie voor deze methode is 73-85%. Bij het sorteren van neuronen van de voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing parameters niet specifiek toe te voegen. Aangezien neuronen zijn niet bolvormig deze parameters waren niet in staat om betrouwbaar te rapporteren cel grootte.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Voor hoge kwaliteit RNA yield, moeten de cellen direct worden gesorteerd in de lysisbuffer en RNA moet onmiddellijk worden gehaald na sortering Een microfluïdische elektroforese-systeem werd gebruikt om het te testen. kwaliteit van RNA (figuur 3). de 18S en 28S pieken worden bepaald via gelelectroforese gebruikt om een RNA integriteit nummer (RIN) te berekenen. voor RNA sequencing het monster moet RIN meer dan 7. Dit RNA monster nu worden gesequenced worden .
Figuur 1. Fast Blue Labeling van Airway zenuwcellen in de nodose ganglia van de nervus vagus. A) Een weergave van Fast Blue intranasale instillatie in de longen. Onder lichte sevofluraananesthesie, pipet 40 ul van Fast Blue in PBS met 1% DMSO in de neusgaten van een muis, zorg ervoor dat de muis is opzuigen in de vloeistof.
Figuur 2. Fluorescentie Activated Cell (FAC) sorteren Gates voor Fast Blue positieve cellen. Voor het instellen van het sorteren van poorten gebruiken de negatieve (A) en positief (B) regelt de Fast Blue positieve populatie vast te stellen. De negatieve controle (A) gedissocieerd DRG cellen thbij niet de longen innerveren. De positieve controle (B) gedissocieerd DRG cellen die zijn geïncubeerd met Fast Blue in vitro, nadat ze zijn ontleed. Vanwege de niet-bolvormige gedissocieerde neuronen, de voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing parameters niet helpen hier de celpopulatie. C) Een vertegenwoordiger soort gedissocieerde knobbelige ganglia cellen van muizen waarvan de luchtwegen zijn blootgesteld aan Fast Blue. D) de cellen voor (C). Meer dan 1000 Fast Blue (FB) cellen werden verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Beoordeling van RNA Kwaliteit en Toewijzing van RNA Integrity Number (RIN) Met behulp van een microfluïdische elektroforese-systeem. Met behulp van een uitverkorenrophoresis systeem de kwaliteit van RNA wordt berekend uit de 18S en 28S pieken gefotografeerde beeld op gel. De lagere piek vertegenwoordigt gedegradeerde RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor luchtweg-zenuwcellen gericht in de nodose ganglia van de nervus vagus. Eenmaal gelabeld, worden de ganglia voorzichtig los om optimaal te behouden cel aantallen en de levensvatbaarheid. Deze neuronen zijn dan FAC gesorteerd direct in lysis buffer en RNA geëxtraheerd. De betekenis van dit protocol is de mogelijkheid te richten, isoleren en bewaren van de kwaliteit van een organoleptische celpopulatie. Genexpressie wordt in dit kleine populatie van neuronen en orgaan-specifieke functies en neurale netwerken zijn geïdentificeerd.
De kritische stappen in dit protocol zijn onder andere snelle progressie door de dissociatie en de daaropvolgende celsortering. Het is belangrijk om de sorteertijd zodat het begint onmiddellijk na dissociatie plannen. Het is ook essentieel dat de RNA-extractie reagentia vers, de 70% en 80% ethanol oplossingen worden vers en alle buizen en uitrusting voor RNA-extractiezijn schoon en RNase vrij.
Dit protocol kan zodanig zijn dat cellen individueel worden gesorteerd in putjes voor enkele cel RNA-extractie en sequentie worden gewijzigd. Het kan ook worden gebruikt om cellen uit andere sensorische ganglia, zoals dorsale wortel ganglia (DRG's) te isoleren. Inktinjectie verschillende lichaamsdelen die terug naar DRG's is eerder beschreven 17. Dit protocol kan ook worden gemodificeerd om cellen voor functionele analyse verzamelen. In plaats van het sorteren cellen in lysisbuffer, worden de cellen gesorteerd in neuronale kweekmedium, GADS. Deze cellen worden vervolgens gekweekt en gebruikt voor functionele studies zoals calcium imaging of elektrofysiologie.
Als de Fast Blue positieve populatie kleiner is dan het verwachte resultaat, aanschaf nieuw enzym digestie. De leeftijd van het enzym digestie samenhangt met de efficiëntie van de spijsvertering. De spijsvertering enzym moet worden gebruikt binnen 1 jaar na aankoop. In het geval dat het aantal cellen hoog is,RNA wordt geëxtraheerd en getest op kwaliteit. Wanneer het RNA wordt afgebroken is dit een indicatie dat de reagentia niet vers of besmet zijn. In dit geval moet u grondig te reinigen van alle RNA-extractie gebieden, pipetten, rekken, en iets dat zal in contact met het monster buizen komen. Maak verse RNase en DNase vrij 70% en 80% ethanol. Het water en ethanol gebruikt om deze oplossingen te maken moet ook gescheiden van andere lab supplies worden gehouden en die uitsluitend worden gebruikt voor RNA-extractie.
FAC sorteren is een snelle en efficiënte werkwijze voor het isoleren Fast Blue positieve cellen echter één beperking is dat de celdichtheid dient 1-2.000.000 cellen per ml buffer. Dit protocol duwt de limiet van huidige cel sorter modellen. Het aantal cellen in de knobbelige ganglion klein. Met een opbrengst cel voldoende is voor de cel sorteerder te krijgen, worden cellen van vijf dieren samengevoegd. De sorteerinrichting volume beschreven is 200-300 gl en heeft minder dan 100.000 cellen gesuspendeerd. Tzijn vertaalt tot een concentratie van ongeveer 450.000 cellen per ml, onder de aanbevolen dichtheid. Een alternatief voor het gebruik van een celsorteerder is het uitkiezen van een fluorescentiemicroscoop en glazen pipet 24. Deze techniek is langzamer en is gebruikt voor het verzamelen van 30-100 cellen tegelijk. Daarom dit protocol biedt een snellere high-throughput-methode vergeleken met bestaande methoden.
De toekomstige toepassingen van deze protocollen zijn vermogen om de transcriptionele profiel van een specifieke populatie van luchtweg-bezenuwde zenuwen bepalen. De hoge kwaliteit RNA verzameld met dit protocol kan worden gebruikt als een matrijs voor cDNA-synthese en de volgende generatie sequencing en andere technieken om de transcriptoom van de verzamelde neuronen karakteriseren. Op deze wijze kan worden bepaald welke genen of routes zijn specifiek voor deze neuronen. Deze informatie zal helpen om de functionele rol van deze neuronen spelen in normale fysiologische omstandigheden toe te lichten. Zodra basicexpressie patronen zijn vastgesteld, kan het systeem worden aangevochten door fysische en chemische stimuli of met ziekteverwekkers om hun effecten op de genregulatie in long-zenuwcellen te bepalen. Tenslotte door het identificeren welke genen gereguleerd zijn de nieuwe farmacologische targets te identificeren en beginnen de effecten van therapeutische onderzoeken om te interfereren met acute en chronische veranderingen van zenuwfunctie in luchtwegaandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteund door NIH-subsidie R01HL105635 te SEJ. De auteurs willen graag bedanken Diego V. Bohórquez voor technisch advies. We danken ook R. Ian Cumming voor technische bijstand en het uitvoeren van de flowcytometrie in het Duke Human Vaccin Instituut Onderzoek flowcytometrie Shared Resource Facility (Durham, NC). Flowcytometrie werd uitgevoerd in het Regionaal Biocontainment Laboratory van Duke, die gedeeltelijke ondersteuning voor de bouw van de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) ontvangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
