Abstract
Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Neuronen innerhalb der sensorischen Ganglien. Sensorischen Ganglien ein spezifisches Organ oder Teil des Körpers innervieren. Zum Beispiel werden die Spinalganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im gesamten Körper und Gliedmaßen. Die Trigeminalganglien sind im Schädel und innervate das Gesicht befindet, und der oberen Atemwege. Vagal Afferenzen der nodose Ganglien erstrecken sich in den Darm, Herz und Lunge. Die nodose Neuronen steuern, um eine Vielfalt von Funktionen wie: Atemfrequenz, Reizung der Atemwege und Husten Reflexe. Somit, um ihre Funktion zu verstehen und zu manipulieren, ist es entscheidend Atemweg spezifischen neuronalen Subpopulationen zu identifizieren und zu isolieren. Bei der Maus werden die Atemwege zur retrograden Tracing von Atemwegsspezifischen nodose Neuron zu einem fluoreszierenden Tracer-Farbstoff, Fast Blue, ausgesetzts. Die nodose Ganglien dissoziiert und Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung verwendet wird Farbstoff-positiven Zellen zu sammeln. Als nächstes wird aus positiven Zellen Farbstoff für die Sequenzierung der nächsten Generation extrahiert hoher Qualität Ribonukleinsäure (RNA). Mit dieser Methode Atemwegs spezifische neuronale Genexpression bestimmt wird.
Introduction
Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Nerven in sensorischen Ganglien, wie die Spinalgan, trigeminal oder nodose ganglia befindet. Jedes sensorische ganglion innervates spezifischen Regionen des Körpers und enthält Zellen, die getrennte Organe und Gewebe innerhalb dieser Region innervieren. So werden zum Beispiel die Dorsalwurzelganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im ganzen Körper und Gliedmaßen, während die Trigeminalganglien im Schädel befinden, enthält Neuronen, die das Gesicht, Augen, Hirnhaut oder der oberen Atemwege 1 innervate, 2. Die nodose Ganglien des Nervus vagus im Hals unterhalb des Schädels und enthält Zellkörper , die Nervenfasern im gesamten Magen - Darm - Trakt, Herz erstrecken und unteren Atemwege und Lungen 3. Beim Menschen steht das Ganglion nodosum allein, jedoch in der Maus, um es fusioniert istmit dem Ganglion jugulare, die auch die Lunge 4 innervates. Das fusionierte Ganglion wird oft die Gurgel / nodose Komplex, Vagus - Ganglion oder einfach Ganglion nodosum 5 genannt. Hier wird bezeichnet als das Ganglion nodosum.
Afferenzen der nodose passieren Informationen von den Eingeweiden zum Kern des einsamen-Darm-Trakt (NTS) im Hirnstamm. Sensorischen Input zu diesem einzigartigen Ganglion steuert eine Vielfalt von Funktionen, wie Darmmotilität 6, Herzfrequenz 7, Atmung 8,9 und Reizaktivierte Atmungsreaktionen 10,11. Bei dieser Vielfalt der Funktionen und innervated Organe ist es entscheidend, organspezifische Subpopulationen des Ganglion nodosum, um einzelne zu studieren neuronalen Bahnen zu zielen und zu isolieren. Es können jedoch die geringe Größe des nodose und die begrenzte Anzahl von Neuronen gegebenen enthält dieses keine triviale Aufgabe. Jede Maus Ganglion nodosum enthält ungefähr 5.000 Neuronen 12zusätzlich zu einer umfangreichen Bevölkerung von Satellitenzellen zu unterstützen. Von den 5.000 nodose Neuronen, nur 3 bis 5% innervate die Atemwege. Daher werden alle funktionalen, morphologische oder molekulare Veränderungen im Atemweg-innervating Neuronen, durch Atemstimulation oder Pathologien, in der dicht gepackten Ganglion nodosum verloren.
Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung Neuronen entwickelt, die die Atemwege innervate. Die Atemwege wurden mit einem fluoreszierenden Markierungsfarbstoff ausgesetzt, um die nachfolgenden innervating nodose Neuronen zu identifizieren. Fast Blue wurde von Neuronen und wandert schnell in ihre Zellkörper aufgenommen , wo es für bis zu acht Wochen 13 zurückgehalten wird - 15. Einmal identifiziert, eine sanfte, aber wirksame, Dissoziation Protokoll verwendet wurde, Farbstoffmarkierung und die Lebensfähigkeit von Zellen fluoreszenzaktivierte Zell (FAC) Sortierung zu erhalten. Sortierte Zellen werden verwendet, um hohe Qualität Ribonukleinsäure (RNA) extrahieren Genexpression oder f, um zu bestimmenoder andere Downstream-Genanalyse. Dieses Protokoll stellt eine nützliche und robuste Technik zur Isolierung von sensorischen Neuronen, die ein Gewebe von Interesse innervate.
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Protocol
Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Duke University genehmigt.
1. Die intranasale Verabreichung von Fast Blue
Für Fast Blue, zur Verwaltung der Farbstoff mindestens 2 Tage vor der Maus euthanizing. Der Farbstoff wird für bis zu acht Wochen andauern.
- Anesthetize die Maus mit Licht Inhalationsanästhesie (2,5% Sevofluran), bis zu atmen beginnt zu verlangsamen.
- Verwenden, um eine 200 & mgr; l-Pipette mit Filterspitzen zu langsam 40 ul Farbstofflösung vermitteln (0,4 mM Fast Blue, 1% Dimethylsulfoxid, DMSO, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) in das Nasenloch, Pausieren gelegentlich die Maus, um sicherzustellen, Absaugen der Lösung (1A).
- Halten Sie die Maus vertikal, Kopf hoch, und sanft die Brust massieren der Farbstoff breitet sich in der Lunge zu gewährleisten.
2. Vorbereitung auf Dissection und Analyse Tag
- Bereiten Sie 10 ml0; Ganglia Dissoziationslösung (GADS) , indem die Inhaltsstoffe kombiniert , wie in Tabelle 1 angegeben.
- Führen Sie die RNA-Extraktion in einem speziellen Labor-Bereich. Vor Versuchsbeginn, saubere Oberflächen mit 70% Ethanol, 10% Bleiche und RNase Dekontamination Reagens. Dazu gehört auch die RNA-Zentrifuge, alle Rohrgestelle und Pipetten. Stellen Sie sicher, es gibt nur spezielle Filterspitze Boxen für die RNA-Einsatz. Verwenden Sie dieses Gerät und Bereich nicht für die DNA-Präparation, da dies die Proben kontaminieren.
- Mischen Sie frische 70% und 80% Ethanol mit RNase-freiem Wasser. Vorbereitung 1 ml pro Probe in die RNA-Extraktion verwendet werden.
| Zutat | Menge |
| Erweiterte DMEM / f12 | 9,5 ml |
| Glutamin | 100 ul |
| HEPES (10 mM) | 100 ul |
| N2 Ergänzung | 100 ul |
| B27 (kein Vitamin A) | 200 ul |
| NGF (50 ug / ml) | 10 ul |
Tabelle 1 Reagenzmischung für Ganglia Dissoziationslösung (gads).
3. Dissection Verfahren
- Füllen Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 500 ul gads, eine für jede Versuchsprobe, eine für eine positive Sortierkontrolle und eine für eine negative Sortierkontrolle. Shop Röhrchen auf Eis im gesamten Dissektion.
- Präparieren Sie die Ganglion nodosum und zwei Teilschnitte machen Dissoziation zu erleichtern, ist es dann in der Versuchsprobenröhrchen setzen. Bitte beachten Sie die folgende JoVE Protokoll für die Präparation der nodose Ganglien 16 und DRG 17.
- Sezieren und teilweise nicht-markierten ganglia, wie die Spinalganglien (DRG) geschnitten, für die Sortiersteuerung. Verwenden Sie zwei Ganglien für die positive Kontrolle und zwei Ganglieine für die Negativkontrolle.
- Um genügend nodose Neuronen für eine erfolgreiche Sortierung zu erhalten, kombinieren Glien von 5 Mäusen in einem experimentellen Verfahren Probenröhrchen mit gads.
4. Sensorische Ganglia Dissociation
- Pipette aus 500 ul gads, Ganglien in der Röhre zu verlassen. Waschen Sie Ganglien einmal mit 1 ml PBS Zugabe warten Ganglien auf den Boden des Rohres zu regeln, dann Pipette aus PBS.
- 1 ml GADS und 22 & mgr; l Verdauungsenzym (Kollagenase I / II und Protease - Mischung, 2,5 mg / ml in H 2 O) in jedes Röhrchen.
- In 20 ul Fast Blue (5,26 mM) mit dem positiven Steuerrohr.
- Setzen Sie die Röhrchen in einem Wasserbad oder Heizblock bereits bei 37 ° C eingestellt.
Anmerkung: Der Zeitpunkt des ganglia Verdauung von dem Alter des Aufschlusses Enzyms abhängt. Innerhalb von 1 Monat nach der Verdauung Enzym löst, verdauen für 30 Minuten innerhalb von 2 - 6 Monate für 45 min verdauen. Wenn das Enzym über 6 Monate alt ist, verdauen Ganglien foder 60 min. - Alle 15 min schütteln Röhrchen kurz und schnippen sie Ganglien, um sicherzustellen, werden von der Lösung bedeckt.
- Während Ganglien verdaut werden, Dichtegradienten mit einer Partikellösung (kolloidalen Silicapartikel, beschichtet mit Polyvinylpyrrolidon) herzustellen.
- Mischen Sie 12% Partikellösung in Gads, 500 & mgr; l pro Probe.
- Mischen Sie 28% Partikellösung in Gads, 500 & mgr; l pro Probe.
- Langsam und vorsichtig für jede Probe 400 ul 12% Dichte Lösung oben auf 400 & mgr; l 28% Dichte Lösung in einem frischen 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen. Sie nicht zulassen, dass die beiden Schichten zu vermischen. Zwei verschiedene Schichten sollte in dem Röhrchen sichtbar sein; ein dunkler als der andere.
- Während Ganglien verdaut werden, beschriften neue 1,5-ml-Sammelröhrchen für die Sortierung (ein Fast Blue positive und eine Fast Blue negativen Röhrchen pro Sortier Probe). Je nach den Anforderungen Sortieranlage müssen diese Rohre haben abnehmbaren Deckel, um nicht zu interferierene mit dem Zellsortierer.
- Nach der entsprechenden Verdauungszeit, entfernen gads mit Verdauungsenzym und waschen Ganglien zweimal mit 1 ml PBS. In 200 ml frisches gads in jedes Röhrchen.
- Verwenden Sie eine 200 ul-Pipette auf 100 & mgr; l Volumen und Pipette Ganglien nach oben und unten mehrmals Zellen auseinander zu brechen. Wiederholen, bis kein intaktes Stück Gewebe zu sehen ist. Vermeiden Blasen in der Lösung.
- Pass dissoziierten Zellen durch eine 70 um Zelle Sieb.
- Fügen Sie weitere 100 ul gads auf die ursprüngliche Dissoziation Röhre alle verbleibenden Streu Zellen links zu holen und die zusätzliche Lösung durch die Zelle Sieb passieren. Unter Verwendung einer neuen Pipettenspitze sammeln jegliches verbleibende zellhaltigen Flüssigkeit, die durch das Sieb passiert hat und auf das Netz geklammert. Das Endvolumen der in GADS suspendierten Zellen beträgt 300 & mgr; l.
- die 300 & mgr; l der Zellen auf der Oberseite der bisherigen Dichtegradienten sorgfältig Schicht. Vermeiden Blasen und Mischen von cells mit den Dichteschichten.
- Zentrifuge für 10 min bei 2900 xg bei RT.
- Während Zellen in der Zentrifuge sind, Lyse-Puffer (1 ml pro Versuchsprobe) mischen wie folgt: 10 & mgr; l 2-Mercaptoethanol in 1 ml Puffer RLT (von RNA-Extraktions-Kits).
- In 300 ul Lysepuffer Fast Blue positive Sammelröhrchen und 600 & mgr; l Fast Blue negativen Sammelröhrchen (Röhrchen aus Schritt markiert 4.7). Dieses Volumen hängt von der Anzahl der Zellen zu erwarten gesammelt werden. Für <2.000 Zellen, fügen Sie 300 ul für> 7.000 Zellen 600 ul hinzufügen. Dadurch wird die Sortier Hüllflüssigkeit gewährleisten nicht wesentlich den Lysepuffer verdünnt.
- Sobald Zentrifugation abgeschlossen ist, sorgfältig entfernen und die oberen 700 ul Schicht verwerfen. Diese Schicht enthält die Mehrheit der Zelltrümmer, die sonst mit Zellsortierung stören.
- In 700 ul frisch gads auf die verbleibende Zelle enthaltende Lösung und pipettierente nach oben und unten mehrmals zu mischen.
- Zentrifuge für 15 min bei 2900 xg Zellen zu pelletieren.
- Während Zellen in der Zentrifuge befinden, Mischungs GADs (500 ul pro Probe) das Sortieren durch Zugabe von 5 ul DNase (10 mg / ml) zu 1 ml GADS.
- Sobald Zentrifugation durchgeführt wird, sorgfältig entfernen und Überstand verwerfen, das Zellpellet zu verlassen.
- Re-suspend Zellpellet in 200 bis 300 & mgr; l Sortierung gads durch Pipettieren nach oben und unten mit einem 1000 ul Pipette auf 200 & mgr; l mehrmals. Legen Sie Proben auf Eis. Zellen sind nun bereit, sortiert werden.
5. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung
Hinweis: Dieser Abschnitt operative Kenntnisse in einer FACS-Sorter oder die Hilfe von Fachpersonal erfordert.
- 1 & mgr; l Propidiumjodid (PI) Stammlösung (50 ug / ml) zu jeder Probe für die Lebensfähigkeit der Zellen zu testen. Split negative Kontrolle in zwei Röhren, eines mit PI und eine ohne. PI bindet DNA nur in tote Zellen. Obnach den ersten paar Arten gibt es keine toten Zellen zu markieren, wird die Verwendung von PI nicht benötigt.
- Transport - Zellen - Zytometrie Instrument fließen, z. B., BD FACS AriaII Diva 8 - Software ausgeführt wird , auf dem Eis.
- Da die Größe der Zellen in dieser Population variabel ist, verwenden Sie eine große Düse (100 & mgr; m) zum Sortieren. Zur Verringerung der Menge an Stress Erfahrung, um die Zellen und erhöhen die Lebensfähigkeit der Zellen niedrigem Druck verwenden (20 psi).
- Verwenden Sie die FACS-Sorter Software die Analyse Plots, Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung (SSC), Fast Blue einzurichten, und PI, wenn nötig.
- Um erneut zu suspendieren Zellen, Strudel sanft die Probe kurz bevor sie in den Sortierer geladen werden.
- Beginnen Sie mit der negativen Kontrolle, kein Fast Blue oder PI, der Gate - Schwelle (2A) zu setzen. Dadurch wird die Menge der Autofluoreszenz in der Zellpopulation zu bestimmen. Optional: Führen Sie die negative Probe mit PI zu erkennen, ob es eine Population von toten Zellen ist.
- Sortieren Sie die positive Kontrollprobe (incubated mit Fast Blue), Kompensationsparameter einzustellen.
- Sobald die Tore und die Parameter festgelegt sind, beginnen die experimentellen Proben zu sortieren. Proben werden in die vorbereiteten Sammelröhrchen, enthaltend RNA Lysepuffer sortiert.
- Halten Sie sortierten Proben auf Eis, bis die Zellsortierung abgeschlossen ist.
- Beginnen RNA-Extraktionsschritt unmittelbar nach Zellen sortiert werden.
6. RNA-Extraktion
- Vortex sortierten Zellen in Lysepuffer für 1 min zu homogenisieren.
- 1 Volumen 70% Ethanol und Mischung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals.
- Übertragung von bis zu 700 & mgr; l der Probe auf einer Spin-Säule. Zentrifuge für 15 sec bei 8.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Wiederholen, bis das Gesamtvolumen der Probe durch die Spin-Säule geleitet wird.
- In 350 & mgr; l Puffer RW1 und weiterhin die RNA-Reinigungsverfahren, einschließlich der DNase Behandlungsschritt nach der Protoco des Herstellersl für Zellen.
- Sobald RNA extrahiert wurde, testen Sie die RNA-Qualität eines mikrofluidischen Elektrophorese-System gemäß den Spezifikationen des Herstellers.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Verfahrens Atemweg-innervating Neuronen werden durch intranasal Einträufeln Fast Blue (1A) gekennzeichnet. Nach zwei Tagen erscheinen Fast Blue markierten Zellen in der nodose ganglia (Abbildung 1C). Diese Zellen machen 3 - 5% der gesamten neuronalen Population der nodose Ganglien. Andere retrograden Farbstoffe, die für diesen Zweck verwendet wurden, umfassen DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat) und Fluorogold. Lung Exposition gegenüber Dil Etiketten nodose Neuronen. Allerdings dauert Dil länger das Ganglion zu erreichen, 7 - 14 Tage nach dem Einträufeln 18,19, also ein aktiv transportiert Farbstoff verwendet wurde. Fluorogold ist ein aktiv transportiert Farbstoff, der auch 14,20 zu etikettieren Atemweg Neuronen verwendet wurde. In unserer Erfahrung jedoch einmal erreicht dieser Farbstoff die Zellkörper in dem Ganglion nodosum wurde schnell von Satellitenzellen und nicht Neuronen (Daten nicht gezeigt) aufgenommen. SchnellBlau ist eine alternative aktiv Fluoreszenzfarbstoff transportiert , die erfolgreich und schnell, DRG - Etiketten bei Ratten 21 und Atemwegs-innervating nodose Neuronen 13,14. Der Fast Blue Ansatz scheint daher robuster und reproduzierbar.
Die Präparation des Ganglion nodosum wurde zuvor 16 beschrieben und seine Lage ist in 1B kurz veranschaulicht. Die Verdauung beginnt unmittelbar nach der nodose Ganglien herausgeschnitten wurden. Um zu verhindern, Neuronen zusammenklumpen und ermöglichen eine saubere Art, verwenden Sie eine sanfte Verdauung Enzym, deaktivieren Sie alle Ablagerungen und fügen RNase zur Ganglien Sortierlösung. Mehrere Verdauung Enzymmischungen wurden auf ihre Wirksamkeit getestet. Eine milde Verdauung Enzymmischung 22 wurde jedoch versucht, für erwachsene Ganglion Verdauung nicht stark genug war , Zellen in einer angemessenen Art und Weise auseinander zu brechen. Alternativ dazu vorher eine 23 Kombination aus Papain verwendet, ProteaseUnd Kollagenase-Enzymgemisch, erwies sich als zu aggressiv und verursacht unerwünschten Zelltod (Daten nicht gezeigt) sein. Das skizzierte Verdauung Protokoll, mit dem angegebenen Enzymmischung wurde die ideal für eine rechtzeitige Verdauung zu sein, mit einer hohen Lebensfähigkeit der Zellen gefunden.
Frühere Verfahren haben die manuelle Zell Kommissionierung mit einer Glaspipette zu trennen markierten Zellen von nicht markierten Zellen 24 verwendet. Diese Technik eignet sich besser für Einzelzellanalyse einer kleinen Anzahl von Zellen. Jedoch mit einer maximalen Rate von 48 Zellen / hr dieses Verfahren ist unpraktisch, wenn ganze Populationen von Hunderten oder Tausenden von Zellen gesammelt werden müssen. Wenn das Ziel, qualitativ hochwertige RNA zu isolieren ist, wird Zeit eine wichtige Variable. Es ist wichtig, die RNA-Extraktion so schnell wie möglich zu beginnen Abbau zu verhindern. FAC Sortierung ermöglicht Sammlung der gesamten markierten Bevölkerung in ~ 45 min und RNA-Extraktion wird unmittelbar nach dem Start.
o: keep-together.within-page = "1"> Wenn Neuronen Sortierung ist es wichtig, so viel Schutt aus zerrütteten neuronalen Prozesse zu löschen. Ein Dichtegradient wurde verwendet, um den Schutt aus dem dissoziierten Proben zu löschen. Es ist wichtig , bei einer ausreichend hohen Kraft zu zentrifugieren , dass die C-Faser - Neuronen zu gewährleisten, die einen kleinen Radius aufweisen, ~ 5 & mgr; m 24, werden durch den Gradienten gezwungen.
2A und B zeigen die negative und positive Kontrollen verwendet , um die Weichen zu setzen. Wie in 2C, die dissoziierten Fast Blue markiert sort nodose Zellen in zwei Populationen zu erkennen. Die Zellzahlen aus dieser Probe gesammelt sind in Abbildung 2D aufgeführt. Sortierwirkungsgrad für diese Methode ist von 73 bis 85%. Wenn Neuronen die Vorwärtsstreuung und Seitenstreusortierparameter hinzufügen nicht Spezifität. Da Neuronen zuverlässig nicht sphärisch sind, waren diese Parameter nicht in der Lage Zellengröße zu melden.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Für hochwertige RNA-Ausbeute, müssen Zellen wurde sofort nach dem Sortieren ein Mikrofluidik-Elektrophorese-System zu testen extrahiert werden sollen direkt in den Lysepuffer und RNA sortiert werden die. Qualität der RNA (Abbildung 3). die 18S und 28S Spitzen über Gelelektrophorese bestimmt werden verwendet , um eine RNA Integrity Number (RIN). Für die RNA der Probe RIN sollte größer als 7 ist jetzt Diese RNA - Probe gestaltet werden können sequenziert werden , die Sequenzierung zu berechnen .
Abbildung 1. Fast Blue Markierung von Airway innervating Neurons in der nodose Ganglia des Vagus - Nerv. A) Eine Darstellung Fast Blue intranasale Instillation in die Lunge. Unter leichten Sevofluran-Narkose, Pipette 40 ul Fast Blue in PBS mit 1% DMSO in die Nase einer Maus, machen, dass die Maus in die Flüssigkeit abgesaugt.
Abbildung 2. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung Tore für Fast Blue positiven Zellen. So richten Tore Sortierung die negativen (A) und positive (B) steuert die Fast Blue positive Bevölkerung zu etablieren. Die negative Kontrolle (A) distanzierte DRG Zellen thbei innervate nicht über die Lunge. Die positive Kontrolle (B) DRG - Zellen distanzierte , die mit Fast Blue in vitro inkubiert werden, nachdem sie seziert wurden. Aufgrund der nicht-kugelförmige Gestalt von dissoziierten Neuronen helfen die Vorwärtsstreuung und Seitenstreuparameter nicht die Zellpopulation zu definieren. C) Eine repräsentative Art von nodose Ganglien Zellen von Mäusen distanzierte , deren Atemwege ausgesetzt waren , Blau. D) Die auf Fast Zellzahl für (C). Über 1000 Fast Blue (FB) Zellen wurden gesammelt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Bewertung der RNA - Qualität und Zuordnung der RNA Integrity Number (RIN) ein Mikrofluidik - Elektrophorese - System. Mit Hilfe eines Auserwähltenrophoresis System die Qualität der RNA wird aus den 18S und 28S Spitzen auf dem abgebildeten Gel Bild berechnet. Die untere Spitze repräsentiert degradierten RNA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Atemwegs-innervating Neuronen in der nodose Ganglien des Nervus vagus zu zielen. Einmal markiert, werden die Ganglien sanft distanzierte optimal Zellzahlen und die Lebensfähigkeit zu erhalten. Diese Neuronen sind dann FAC sortiert direkt in Lysepuffer und RNA extrahiert wird. Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Fähigkeit, zu zielen, zu isolieren, und die Qualität einer bestimmten Sinneszellpopulation zu erhalten. Genexpression wird in diesem kleinen Population von Neuronen beschrieben und organspezifische Funktionen und neuronale Netze identifiziert.
Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind schnelle Progression durch die Dissoziation und anschließender Zellsortierung. Es ist wichtig, die Sortierzeit solcher planen, dass es unmittelbar nach der Dissoziation beginnt. Es ist auch wichtig, dass alle RNA-Extraktionsreagenzien frisch sind, die 70% und 80% Ethanollösungen werden frisch zubereitet, und alle Schläuche und Geräte für die RNA-Extraktionfrei sind sauber und RNase.
Dieses Protokoll kann derart modifiziert werden, dass die Zellen einzeln in Well-Platten für Einzelzell-RNA-Extraktion und Sequenzierung sortiert. Es kann auch zu isolieren, Zellen von anderen sensorischen Ganglien, wie Dorsalwurzelganglien (DRGs) verwendet werden. Dye Injektion von verschiedenen Körperteilen zu DRGs Rückverfolgung wurde zuvor beschrieben 17. Dieses Protokoll kann auch zu sammeln Zellen für die funktionelle Analyse modifiziert werden. Stattdessen Zellen in Lysepuffer des Sortierens werden Zellen in neuronale Kulturmedium, GADS sortiert. Diese Zellen werden dann kultiviert und für funktionelle Untersuchungen, wie Calcium-Bildgebung oder Elektrophysiologie.
Wenn die Fast Blue positive Population kleiner als die erwartete Ergebnis ist, den Kauf neuer Verdauung Enzym. Das Alter des Verdauungsenzym wird auf die Effizienz der Verdauung korreliert. Die Verdauung Enzym muss innerhalb von 1 Jahr ab Kaufdatum verwendet werden. In dem Fall, dass die Zellenzahl hoch ist,RNA wird extrahiert und die Qualität getestet. Wenn die RNA abgebaut wird, ist dies ein Hinweis darauf, dass die Reagenzien nicht frisch sind oder verunreinigt worden sind. In diesem Fall sollten Sie gründlich zu reinigen alle RNA-Extraktion Flächen, Pipetten, Regale, und alles, was in Kontakt mit den Probenröhrchen kommen wird. Machen Sie frische RNase und DNase frei 70% und 80% Ethanol. Das Wasser und Ethanol verwendet, um diese Lösungen machen sollten auch getrennt von anderen Labormaterial und die nur für die RNA-Extraktion gehalten werden.
FAC Sortieranlage eine schnelle und effiziente Verfahren zur Isolierung von Fast Blue positive Zellen ist jedoch ist eine Einschränkung, dass die Zelldichte von 1 bis 2.000.000 Zellen pro ml Puffer sein sollte. Dieses Protokoll schiebt die Grenze der aktuellen Zellsortierer Modelle. Die Anzahl der Zellen in dem Ganglion nodosum ist gering. Um eine Zellausbeute ausreichend für die Zellsortierer, Zellen aus fünf Tieren erhalten werden gepoolt. Die Sortiervolumen beschrieben ist 200 bis 300 & mgr; l und hat weniger als 100.000 Zellen, suspendiert. Tseine entspricht einer Konzentration von etwa 450.000 Zellen pro ml, unter der empfohlenen Dichte. Eine Alternative einen Zellsortierer zur Verwendung mit einem Fluoreszenzmikroskop und Glaspipette 24 zu handpick. Diese Technik ist langsamer und wurde verwendet, 30 zu sammeln - 100 Zellen zu einem Zeitpunkt. Daher bietet dieses Protokoll eine schnellere Methode mit hohem Durchsatz im Vergleich zu bestehenden Methoden.
Die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls umfassen die Fähigkeit, die Transkriptionsprofil eines bestimmten Population von Atemwegs-innervating Nerven zu bestimmen. Die hohe Qualität RNA dieses Protokoll gesammelt Verwendung als Matrize für die cDNA-Synthese und die nächste Generation Sequenzierung und andere Techniken verwendet werden, um das Transkriptom der gesammelten Neuronen zu charakterisieren. Auf diese Weise kann es zu dieser Neuronen spezifisch bestimmt, welche Gene oder Wege werden. Diese Informationen werden dazu beitragen, die funktionelle Rolle diese Neuronen spielen in normalen physiologischen Bedingungen zu erläutern. Sobald GrundExpressionsmuster festgelegt sind, kann das System durch physikalische und chemische Reize oder durch Pathogene herausgefordert werden, um ihre Auswirkungen auf die Genregulation in Lungen innervating Neuronen zu bestimmen. Schließlich wird durch die Identifizierung, welche Gene reguliert werden können wir neue pharmakologische Ziele identifizieren und zu starten, um die Auswirkungen von Therapeutika zu untersuchen, mit akuten und chronischen Veränderungen der Nervenfunktion in Atemwegserkrankungen zu stören.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Unterstützt von NIH gewähren R01HL105635 zu SEJ. Die Autoren möchten sich Diego V. Bohórquez für technische Beratung danken. Wir danken auch R. Ian Cumming für die technische Unterstützung und die Durchflusszytometrie im Duke Humanimpfstoff Institut Forschung Durchflusszytometrie Shared Resource Facility-Durchführung (Durham, NC). Die Durchflusszytometrie wurde im Regional Biocontainment Laboratory an der Duke durchgeführt, die teilweise Unterstützung für den Bau von den National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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