Abstract
nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi neuroni afferenti si trovano all'interno dei gangli sensoriali. gangli sensoriale innervano un organo specifico o porzione del corpo. Per esempio, i gangli della radice dorsale (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere processi in tutto il corpo e degli arti. I gangli del trigemino si trovano nel cranio e innervano la faccia, e le vie respiratorie superiori. afferenze vagali dei gangli nodose si estendono per tutto l'intestino, cuore e polmoni. I neuroni nodose controllano una gamma diversificata di funzioni quali: frequenza respiratoria, irritazione delle vie respiratorie, tosse e riflessi. Così, per capire e manipolare la loro funzione, è fondamentale per identificare e isolare vie aeree specifiche sotto-popolazioni neuronali. Nel topo, le vie aeree sono esposti a un colorante tracciante fluorescente, Fast Blue, per il tracciamento retrograda di specifiche vie aeree nodose neuroneS. I gangli nodose sono dissociate e la fluorescenza delle cellule attivate (FAC) l'ordinamento viene utilizzato per raccogliere le cellule positive colorante. Successivamente, l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) viene estratto dalle cellule positive dye per la prossima generazione di sequenziamento. Utilizzando questo metodo vie aeree specifica espressione genica neuronale è determinata.
Introduction
nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi nervi afferenti si trovano nei gangli sensoriali, come la radice dorsale, trigemino, o gangli nodoso. Ogni ganglion sensoriale innerva regioni specifiche del corpo e contiene cellule che innervano organi e tessuti separati all'interno di tale regione. Per esempio, i gangli delle radici dorsali (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere i processi in tutto il corpo e gli arti, mentre i gangli del trigemino si trova nel cranio, che contiene neuroni che innervano il viso, gli occhi, le meningi e vie aeree superiori 1, 2. Il gangli nodose del nervo vago è situata nel collo sotto il cranio e contiene corpi cellulari che si estendono fibre nervose in tutto il tratto gastrointestinale, cuore e basse vie aeree e dei polmoni 3. Nell'uomo il ganglio nodoso sta da solo, tuttavia, nel topo è fusacon il ganglio giugulare, che innerva anche i polmoni 4. Questo ganglio fuso viene spesso chiamata la giugulare / nodoso complesso, ganglio vagale, o semplicemente nodoso ganglio 5. Qui, viene indicato come il ganglio nodoso.
fibre afferenti del nodosi passano informazioni dai visceri al nucleo del tratto solitario (NTS) nel tronco cerebrale. Input sensoriale a questo ganglio unico controlla una gamma diversificata di funzioni, come la motilità intestinale 6, frequenza cardiaca 7, la respirazione 8,9, e le risposte respiratorie irritanti attivato 10,11. Con questa diversità di funzioni e organi innervati, è fondamentale per indirizzare e isolare sottopopolazioni organo-specifiche del ganglio nodoso al fine di studiare percorsi neuronali individuali. Tuttavia, date le dimensioni del nodose e il numero limitato di neuroni che contiene questo non è un compito banale. Ogni topo nodose ganglio contiene circa 5.000 neuroni 12oltre a una vasta popolazione di cellule di supporto satellite. Dei 5.000 neuroni nodose, solo 3-5% innervano le vie respiratorie. Pertanto, eventuali modifiche funzionali, morfologiche o molecolari all'interno dei neuroni delle vie aeree-innervano, grazie alla stimolazione delle vie respiratorie o patologie, andranno perduti nel ganglio nodoso densamente.
Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un metodo per identificare e isolare i neuroni che innervano le vie respiratorie. Le vie aeree sono stati esposti a un colorante tracciante fluorescente per identificare le successive neuroni innervano nodoso. Fast Blue è stato preso dai neuroni e viaggia rapidamente alle loro corpi cellulari dove viene conservata per un massimo di otto settimane 13 - 15. Una volta identificato, un dolce, ma efficace, il protocollo di dissociazione è stato utilizzato per preservare l'etichettatura tintura e la vitalità delle cellule per cellulare attivato fluorescente (FAC) di smistamento. Cellule separate vengono utilizzati per estrarre l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) per determinare l'espressione genica o Fo altra analisi molecolare valle. Questo protocollo fornisce una tecnica utile e robusto per isolare i neuroni sensoriali che innervano un tessuto di interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Duke University.
1. intranasale Amministrazione di Fast Blue
Per Fast Blue, amministrare il colorante almeno 2 giorni prima eutanasia il mouse. Il colorante persisterà fino a otto settimane.
- Anestetizzare il mouse con l'anestesia per inalazione di luce (2,5% sevoflurano) fino a quando inizia a rallentare la respirazione.
- Utilizzare una pipetta 200 ml con punte filtrati per infondere lentamente 40 ml di soluzione colorante (0.4 mm Fast Blue, 1% dimetilsolfossido, saline DMSO, in tampone fosfato, PBS) nella narice, fermandosi di tanto in tanto per garantire il mouse è aspirando la soluzione (Figura 1A).
- Tenere il mouse verticalmente, testa alta, e massaggiare delicatamente il petto per garantire il colorante si diffonde in tutto i polmoni.
2. Preparati sulla dissezione e analisi Giorno
- Preparare 10 ml0; gangli dissociazione Solution (GADS) mediante la combinazione di ingredienti come specificato nella tabella 1.
- Eseguire l'estrazione di RNA in una zona laboratorio dedicato. Prima di iniziare l'esperimento, superfici pulite con etanolo al 70%, 10% di candeggina, e RNasi reagente decontaminazione. Questo include la centrifuga RNA, eventuali portaprovette e pipette. Assicurarsi che ci sono scatole di punta filtro dedicato per solo uso di RNA. Non utilizzare questa apparecchiatura e l'area per la preparazione del DNA, in modo da contaminare i campioni.
- Mescolare fresco 70%, e l'80% di etanolo con acqua RNase-free. Preparare 1 ml per campione da utilizzare per l'estrazione di RNA.
| Ingrediente | Quantità |
| Avanzate DMEM / F12 | 9,5 ml |
| glutammina | 100 pl |
| HEPES (10 mM) | 100 pl |
| supplemento N2 | 100 pl |
| B27 (senza vitamina A) | 200 ml |
| NGF (50 ug / ml) | 10 microlitri |
Tabella 1. Miscela reagente per gangli dissociazione Solution (GADS).
3. Procedura Dissection
- Riempire provette da 1,5 ml con 500 microlitri GADS, uno per ciascun campione sperimentale, uno per un controllo di smistamento positivo, ed uno per un controllo di smistamento negativo. conservare le provette su ghiaccio durante la dissezione.
- Sezionare il ganglio nodoso e fare due tagli parziali per facilitare la dissociazione, poi metterlo nel tubo campione sperimentale. Si prega di fare riferimento al seguente protocollo di Giove per la dissezione dei gangli nodose 16 e 17 DRG.
- Sezionare e parzialmente tagliato gangli-etichettato, come il gangli spinali (DRG), per i controlli di ordinamento. Utilizzare due gangli per il controllo positivo e due gangliuna per il controllo negativo.
- Per ottenere neuroni nodose sufficienti per l'ordinamento di successo, unire gangli da 5 topi in un tubo campione sperimentale contenenti GADS.
4. sensoriale gangli Dissociazione
- Pipetta fuori 500 GADS microlitri, lasciando gangli nel tubo. Lavare gangli volta aggiungendo 1 ml di PBS, attendere gangli di depositarsi sul fondo del tubo, poi pipetta su PBS.
- Aggiungere 1 ml GADS e 22 pl di digestione enzimatica (collagenasi I / II e mix proteasi, 2,5 mg / ml in H 2 O) ad ogni provetta.
- Aggiungere 20 ml Fast Blue (5,26 mm) per la provetta di controllo positivo.
- Mettere le provette a bagnomaria o riscaldamento blocco già a 37 ° C.
Nota: Il tempo di digestione gangli dipende dall'età della digestione enzimatica. Entro 1 mese di dissolvere l'enzima digestione, digerire per 30 minuti, entro 2 - 6 mesi digerire per 45 min. Se l'enzima è più di 6 mesi di età, digerire gangli fo 60 min. - Ogni 15 min tubi Agitare brevemente e flick loro per garantire gangli sono coperti dalla soluzione.
- Mentre gangli vengono digeriti, preparare gradienti di densità utilizzando una soluzione di particelle (particelle di silice colloidale rivestite con polivinilpirrolidone).
- Mescolare soluzione particella% 12 in GADS, 500 microlitri per campione.
- Mescolare soluzione particella% 28 in GADS, 500 microlitri per campione.
- Lentamente e con attenzione aggiungere 400 microlitri soluzione di densità 12% sulla sommità della soluzione densità 400 microlitri 28% in una provetta da 1,5 ml fresco per ciascun campione. Non permettere che i due strati per mescolare. Due strati distinti devono essere visibili nel tubo; uno più scura dell'altra.
- Mentre gangli vengono digeriti, etichettare nuovi tubi da 1,5 ml di raccolta per l'ordinamento (un tubo Fast Blue positivo e uno negativo Fast Blue per campione di ordinamento). A seconda dei requisiti di smistamento impianto, questi tubi devono avere coperchi amovibili in modo da non interferireE Con il cell sorter.
- Dopo il tempo di digestione appropriata, rimuovere GADS con l'enzima digestione e lavare gangli due volte con 1 ml di PBS. Aggiungere 200 ml di GADS freschi ad ogni provetta.
- Utilizzare una pipetta 200 microlitri, impostato a 100 volumi microlitri, e pipetta gangli su e giù parecchie volte per rompere le cellule a parte. Ripetere l'operazione fino a quando si vede nessun pezzo di tessuto intatto. Evitare di creare bolle nella soluzione.
- Passare cellule dissociate attraverso un colino cella di 70 micron.
- Aggiungere altri 100 microlitri GADS al tubo di dissociazione originale per raccogliere tutte le cellule rimanenti randagi a sinistra e passare la soluzione aggiuntiva attraverso il filtro delle cellule. Utilizzando un nuovo puntale, raccogliere qualsiasi liquido cellule contenenti residuo che è passata attraverso il filtro e aggrappato alla maglia. Il volume finale di cellule sospese in GADS è di 300 microlitri.
- strato attentamente le 300 microlitri di cellule sulla parte superiore del gradiente di densità fatta in precedenza. Evitare di bolle e la miscelazione di cells con gli strati densità.
- Centrifugare per 10 minuti a 2.900 xg a temperatura ambiente.
- Mentre le cellule sono nella centrifuga, miscela tampone di lisi (1 ml per campione sperimentale) come segue: 10 microlitri 2-mercaptoetanolo in 1 ml Buffer RLT (dal kit di estrazione di RNA).
- Aggiungere 300 ml di tampone di lisi tubo di raccolta positivo Blu Veloce e 600 ml di tubo Fast Blue negativo di raccolta (tubi etichettati dal punto 4.7). Questo volume dipende dal numero di celle previste da raccogliere. Per <2.000 cellule, aggiungere 300 ml, per> 7.000 cellule aggiungono 600 ml. Ciò garantirà la selezione fluido di trasporto non diluire in modo significativo il tampone di lisi.
- Una volta che la centrifugazione, rimuovere con cautela ed eliminare lo strato superiore ml 700. Questo livello contiene la maggior parte dei detriti cellulari che altrimenti interferire con l'ordinamento delle cellule.
- Aggiungere 700 microlitri GADS freschi alla cella rimanente contenente soluzione e pipettaTE su e giù più volte per mescolare.
- Centrifugare per 15 minuti a 2.900 xg per far sedimentare le cellule.
- Mentre le cellule sono nella centrifuga, mescolare classificare GADS (500 microlitri per campione) aggiungendo 5 microlitri DNasi (10 mg / ml) per 1 ml GADS.
- Una volta che la centrifugazione è fatto, rimuovere con attenzione e scartare il surnatante, lasciando il pellet.
- Risospendere pellet cellulare in 200 - 300 ml di smistamento GADS pipettando su e giù con una pipetta 1000 ml impostata su 200 ml più volte. Mettere i campioni in ghiaccio. Le cellule sono ora pronti per essere ordinati.
5. fluorescenza cellulare attivato (FAC) Ordinamento
Nota: questa sezione richiede la conoscenza operativa di un sorter FACS o l'assistenza di personale specializzato.
- Aggiungere 1 ml soluzione madre ioduro di propidio (PI) (50 mg / ml) per ogni campione per verificare la vitalità cellulare. Split controllo negativo in 2 tubi, uno con e uno senza PI. PI lega il DNA solo nelle cellule morte. Sedopo le prime specie non ci sono le cellule morte per etichetta, non è necessario l'uso di PI.
- Cellule di trasporto di citometria a flusso strumento, ad es., BD FACS AriaII che esegue il software Diva 8, sul ghiaccio.
- Poiché la dimensione della cella è variabile in questa popolazione, utilizzare un ugello grande (100 micron) per l'ordinamento. Per ridurre la quantità di stress dell'esperienza cellule e aumentare la vitalità cellulare utilizzare bassa pressione (20 psi).
- Utilizzare il software selezionatrice FACS per impostare le trame analisi, scatter in avanti, lato scatter (SSC), Fast Blue, e PI, se necessario.
- Per ri-sospendere le cellule, Agitare delicatamente brevemente il campione prima di caricarla nel sorter.
- Iniziare con il controllo negativo, non Fast Blue o PI, per impostare la soglia di gate (Figura 2A). Questo determina la quantità di autofluorescenza nella popolazione di cellule. Opzionale: Eseguire l'esempio negativo con PI per identificare se c'è una popolazione di cellule morte.
- Ordina il campione di controllo positivo (incubated con Fast Blu), per impostare i parametri di compensazione.
- Una volta che i cancelli ed i parametri sono impostati, iniziare l'ordinamento dei campioni sperimentali. I campioni vengono ordinati nei tubi di raccolta preparati contenenti tampone di lisi RNA.
- I campioni ordinati in ghiaccio fino a quando l'ordinamento delle cellule è completa.
- Iniziare fase di estrazione di RNA subito dopo che le cellule sono ordinati.
6. RNA Estrazione
- Vortex cellule ordinati in tampone di lisi per 1 minuto per omogeneizzare.
- Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% e mescolare pipettando su e giù diverse volte.
- Trasferire fino a 700 ml di campione in una colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through.
- Ripetere finché il volume totale del campione attraverso la colonna di spin.
- Aggiungere 350 microlitri Buffer RW1 e continuare il processo di purificazione dell'RNA, comprendente la fase di trattamento DNasi, secondo protoco del produttorel per le cellule.
- Una volta RNA è stato estratto, per verificare la qualità RNA utilizzando un sistema di elettroforesi microfluidica secondo le specifiche del costruttore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando questo metodo, i neuroni delle vie respiratorie-innervano sono etichettati per via intranasale instillando Fast Blue (Figura 1A). Dopo due giorni, veloci cellule blu marcate appaiono nei gangli nodoso (Figura 1C). Queste cellule formano 3 - 5% della popolazione totale neuronale dei gangli nodose. Altri coloranti retrogrado che sono stati usati per questo scopo comprendono DII (1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine) e Fluorogold. l'esposizione del polmone per le etichette Dii nodose neuroni. Tuttavia, DII richiede più tempo per raggiungere il ganglio, 7 - 14 giorni dopo l'instillazione 18,19, è stato utilizzato un colorante quindi trasportato attivamente. Fluorogold è un colorante trasportato attivamente che è stato anche utilizzato per etichettare i neuroni delle vie aeree 14,20. Nella nostra esperienza, tuttavia, una volta raggiunto questo colorante i corpi cellulari nel ganglio nodoso è stato rapidamente ripreso da cellule satellite e non neuroni (dati non riportati). VeloceIl blu è un supplente attivamente trasportato colorante fluorescente che con successo, e rapidamente, etichette DRG nei ratti 21 e delle vie aeree, che innervano i neuroni nodose 13,14. L'approccio Blu veloce, quindi, appare più robusta e riproducibile.
La dissezione del ganglio nodoso è stata precedentemente descritta 16 e la sua posizione è brevemente illustrato in Figura 1B. La digestione inizia subito dopo i gangli nodose sono stati asportati. Per evitare che i neuroni da aggregazione insieme e consentire una sorta pulita, utilizzare un enzima digestione dolce, eliminare tutti i residui e aggiungere RNasi ai gangli di smistamento soluzione. Molteplici mix di enzimi digestivi sono stati testati per l'efficacia. Un delicato mix di digestione enzimatica 22 è stato provato, tuttavia, per la digestione ganglio adulti non era abbastanza forte per spezzare le cellule in modo tempestivo. In alternativa, un usato in precedenza 23 combinazione di papaina, proteasi, E la miscela di enzimi collagenasi, ha dimostrato di essere troppo aggressivo e ha causato la morte delle cellule indesiderabili (dati non riportati). Il protocollo di digestione delineato, con la miscela enzimatica specificato, è risultata essere l'ideale per una digestione tempestiva con la vitalità cellulare alta.
Metodi precedenti hanno utilizzato cellule raccolta manuale con una pipetta di vetro per separare cellule marcate dalle cellule senza etichetta 24. Questa tecnica è più adatto per l'analisi singola cella di un piccolo numero di cellule. Tuttavia, con una velocità massima di 48 cellule / hr questa tecnica è pratico quando necessario raccogliere intere popolazioni di centinaia o migliaia di cellule. Quando l'obiettivo è quello di isolare l'RNA di alta qualità, il tempo diventa una variabile chiave. È importante iniziare l'estrazione dell'RNA più rapidamente possibile per evitare la degradazione. FAC ordinamento consente la raccolta di tutta la popolazione etichettato in ~ 45 min e l'estrazione di RNA viene avviato immediatamente dopo.
o: keep-together.within-page = "1"> Quando si ordina neuroni è importante chiarire il più residui da processi neuronali rotti. Un gradiente di densità è stato utilizzato per eliminare i detriti dai campioni dissociate. È importante centrifugare a una forza abbastanza elevata da garantire che i neuroni C-fibre, che hanno un piccolo raggio, ~ 5 micron 24, sono costretti attraverso il gradiente.
Figura 2A e B mostrano i controlli negativi e positivi utilizzati per impostare le porte di ordinamento. Come si vede nella figura 2C, la dissociato Fast Blue etichettato cellule nodoso sorta in due popolazioni. I numeri di cellule raccolte da questo campione sono elencati nella Figura 2D. Ordinamento efficienza per questo metodo è del 73 - 85%. Quando si ordina neuroni i parametri di dispersione e di dispersione lato anteriore non hanno aggiunto specificità. Dal momento che i neuroni non sono sferiche questi parametri sono stati in grado di segnalare in modo affidabile le dimensioni delle cellule.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Per la resa RNA di alta qualità, le cellule devono essere ordinati direttamente nel tampone di lisi e l'RNA deve essere estratto immediatamente dopo la cernita Un sistema di elettroforesi microfluidica è stato utilizzato per testare la. qualità del RNA (Figura 3). I picchi 18S e 28S sono determinati mediante elettroforesi su gel utilizzato per calcolare un numero integrità dell'RNA (RIN). per RNA sequenziando il campione RIN deve essere maggiore di 7. Questo campione di RNA è ora pronto per essere sequenziato .
Figura 1. Fast Blue Etichettatura di Airway Innervazione neuroni nel nodoso gangli del nervo vago. A) Una rappresentazione di Fast intranasale instillazione blu nei polmoni. In anestesia sevoflurano luce, pipetta 40 ml di Fast Blue in PBS con 1% DMSO nelle narici di un mouse, assicurandosi che il mouse sia aspirazione nel fluido.
Figura 2. Fluorescenza cellulare attivato (FAC) ordinamento Gates per Fast cellule blu positive. Per impostare l'ordinamento porte utilizzano il negativo (A) e positivo (B) controlla per stabilire la popolazione Fast Blue positivo. Il controllo negativo (A) si dissocia cellule DRG °a non innervano i polmoni. Il controllo positivo (B) è dissociato cellule DRG che vengono incubate con Fast Blue in vitro, dopo che sono stati sezionati. A causa della forma non sferica di neuroni dissociati, i parametri di dispersione e di dispersione lato a termine non potranno aiutare a definire la popolazione di cellule. C) Una sorta rappresentante dissociate nodose cellule dei gangli di topi le cui vie respiratorie sono stati esposti a Fast Blu. D) La conteggio delle cellule per (C). Oltre 1.000 blu (FB), le cellule sono state raccolte veloci. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Valutazione della Qualità e RNA Assegnazione di RNA Integrity Number (RIN) Utilizzo di un sistema di Microfluidic elettroforesi. L'utilizzo di un elettoSistema rophoresis la qualità di RNA viene calcolata dai picchi 18S e 28S l'immagine del gel nella foto su. Il picco inferiore rappresenta RNA degradato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare i neuroni delle vie aeree, che innervano nei gangli nodoso del nervo vago. Una volta etichettato, i gangli vengono delicatamente dissociate per conservare in modo ottimale il numero di cellule e la vitalità. Questi neuroni sono poi FAC allineati direttamente nel tampone di lisi e RNA viene estratto. Il significato di questo protocollo è la possibilità di individuare, isolare e preservare la qualità di una specifica popolazione di cellule sensoriali. L'espressione genica è descritto in questa piccola popolazione di neuroni, e vengono identificate le funzioni di organo-specifiche e le reti neurali.
I passaggi critici in questo protocollo sono rapida progressione attraverso il processo di dissociazione e la successiva separazione delle cellule. È importante programmare il tempo di smistamento tale che inizia immediatamente dopo la dissociazione. E 'anche fondamentale che tutti i reagenti di estrazione di RNA sono freschi, le soluzioni di etanolo al 70% e 80% sono fatti freschi, e tutti i tubi e attrezzature per l'estrazione di RNAsono pulite e RNasi gratuito.
Questo protocollo può essere modificato in modo tale che le cellule sono ordinati singolarmente in pozzetti per singola estrazione di RNA cellulare e sequenziamento. Può anche essere utilizzata per isolare cellule da altri gangli sensoriali, come gangli della radice dorsale (DRG). Dye iniezione di diverse parti del corpo per risalire al DRG è stato descritto in precedenza 17. Questo protocollo può anche essere modificato per raccogliere le cellule per l'analisi funzionale. Invece di smistamento cellule in tampone di lisi, le cellule vengono ordinati in terreno di coltura neuronale, GADS. Queste cellule sono poi coltivate e utilizzate per studi funzionali come l'imaging di calcio, o di elettrofisiologia.
Se la popolazione Fast Blue positivo è minore del risultato atteso, acquistare nuovi digestione enzimatica. L'età della digestione enzimatica è correlata alla efficienza della digestione. La digestione enzimatica deve essere utilizzato entro 1 anno dall'acquisto. Nel caso in cui il numero di cellule è alto,RNA viene estratto e la qualità provata. Se l'RNA è degradata questa è un'indicazione che i reagenti non sono freschi, o sono stati contaminati. In questo caso, assicurarsi di pulire accuratamente tutte le aree di estrazione di RNA, pipette, rastrelliere, e tutto ciò che entreranno in contatto con i tubi del campione. Fare RNase fresco e DNasi libera il 70% e l'80% di etanolo. L'acqua e l'etanolo usato per fare queste soluzioni dovrebbero essere tenuti separati dagli altri rifornimenti di laboratorio e utilizzati esclusivamente per l'estrazione di RNA.
FAC smistamento è un metodo veloce ed efficace per isolare veloci cellule positive blu, tuttavia, un limite è che la densità cellulare dovrebbe essere 1 a 2 milioni di cellule per ml di tampone. Questo protocollo spinge il limite di modelli cell sorter correnti. Il numero di cellule nel ganglio nodoso è piccola. Per ottenere una resa di cellule sufficiente per il cell sorter, le cellule provenienti da cinque animali sono messe in comune. Il volume di ordinamento descritto è 200 - 300 ml ed ha meno di 100.000 cellule in sospensione. Tsuoi traduce in una concentrazione di circa 450.000 cellule per ml, sotto la densità consigliata. Un'alternativa all'utilizzo di un cell sorter è quello di selezionare accuratamente con una fluorescenza microscopio e vetro pipetta 24. Questa tecnica è più lento ed è stato utilizzato per raccogliere 30 - 100 cellule per volta. Pertanto, questo protocollo offre un metodo high-throughput più veloce rispetto ai metodi esistenti.
Le future applicazioni di questo protocollo includono la possibilità di determinare il profilo trascrizionale di una popolazione specifica di nervi delle vie aeree-innervano. L'RNA di alta qualità raccolti con questo protocollo può essere usato come stampo per la sintesi di cDNA e la generazione sequenziamento successivo, e altre tecniche per caratterizzare la trascrittoma dei neuroni raccolti. In questo modo, si può determinare quali geni o percorsi sono specifiche di questi neuroni. Queste informazioni aiuteranno a chiarire il ruolo funzionale di questi neuroni giocano in condizioni fisiologiche normali. Una volta di basepattern di espressione sono stati stabiliti, il sistema può essere messo in discussione da stimoli fisici e chimici o da agenti patogeni per determinare i loro effetti sulla regolazione genica nei neuroni che innervano polmone. Infine, identificando i geni che sono regolati siamo in grado di identificare nuovi bersagli farmacologici e iniziare a studiare gli effetti delle terapie di interferire con i cambiamenti acute e croniche di funzione del nervo nelle malattie delle vie respiratorie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Supportato da NIH concedere R01HL105635 a SEJ. Gli autori desiderano ringraziare Diego V. Bohórquez consulenza tecnica. Ringraziamo anche R. Ian Cumming per l'assistenza tecnica e l'esecuzione della citometria a flusso al Duke Vaccine umana Research Institute citometria a flusso Shared Resource Facility (Durham, NC). La citometria a flusso è stato eseguito nel Laboratorio biocontenimento regionale presso la Duke, che ha ricevuto il supporto parziale per la costruzione dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
