Abstract
体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性ニューロンの細胞体は、感覚神経節内に配置されています。感覚神経節は、身体の特定の器官または一部を支配します。例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します。三叉神経節は、頭蓋骨に位置し、顔を支配し、上気道されています。節状神経節の迷走神経求心性神経は、腸、心臓、肺全体に延びています。呼吸数、気道の炎症、および咳反射：結節ニューロンは、以下のような機能の多様な配列を制御します。したがって、それらの機能を理解し、操作するために、気道特定のニューロンのサブ集団を同定し、単離することが重要です。マウスでは、気道は、気道固有の結節ニューロンの逆行性トレーシングのために、蛍光トレーサー染料、ファーストブルーにさらされています秒。結節神経節を解離し、蛍光活性化細胞（FAC）選別染料陽性細胞を収集するために使用されます。次に、高品質のリボ核酸（RNA）は、次世代配列決定のための色素陽性の細胞から抽出されます。この方法は、気道の特定の神経細胞の遺伝子発現を使用して決定されます。
Introduction
体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性神経の細胞体は、後根、三叉神経、または結節神経節のように、知覚神経節に位置しています。それぞれの感覚神経節は、身体の特定の領域を神経支配し、その領域内の別々の臓器や組織を神経支配する細胞が含まれています。三叉神経節は、顔、目、髄膜または上気道1を神経支配するニューロンを含む、頭蓋骨内に配置されている間、例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します2。迷走神経の節状神経節は、頭蓋骨下の首に位置し、消化管、心臓、および下気道や肺3を通して神経繊維を拡張する細胞体が含まれます。ヒトでは節状神経節は、しかし、マウスでそれが融合されて、一人で立っていますまた、肺4を神経支配頚神経節、と。この融合した神経節は、しばしば頸静/結節複雑、迷走神経節、あるいは単に節状神経節5と呼ばれています。ここでは、結節性神経節と呼ばれています。
結節の求心性線維は、脳幹内の孤束核（NTS）の核に内臓からの情報を渡します。このユニークな神経節への感覚入力は、このような腸運動性6、心拍数7、呼吸8,9、および刺激性活性化呼吸応答10,11として機能し、多様な配列を制御します。機能や神経支配器官のこのような多様性と、個々のニューロン経路を研究するために、節状神経節の臓器特異的亜集団を標的とし、単離することが重要です。しかし、結節のサイズが小さく、それが、これは簡単な作業ではありません含まれているニューロンの数が限られて与えられました。神経節結節各マウスは、およそ5,000のニューロン12が含まれています衛星細胞を支持する大規模な集団に加えました。 5000結節ニューロンの、唯一の三から五までパーセントの神経支配気道。そのため、呼吸器刺激や病理に対する気道-神経支配ニューロン内の任意の機能、形態学的または分子変化は、高密度に充填された節状神経節に失われます。
この問題を解決するために、この方法は、気道を神経支配するニューロンを同定および単離するために開発されました。気道は、その後の神経支配の結節ニューロンを同定するために蛍光トレーサー色素に曝露しました。ファーストブルーは、ニューロンによってピックアップし、それが最大8週間13のために保持され、それらの細胞体に素早く移動した- 15。一度同定、まだ効率的な、穏やかな分離プロトコルは、蛍光活性化細胞（FAC）ソートする色素標識および細胞生存率を維持するために使用しました。選別された細胞は、遺伝子発現またはfを決定するために、高品質のリボ核酸（RNA）を抽出するために使用されまたは他の下流の分子解析。このプロトコルは、関心のある組織を神経支配する感覚ニューロンを単離するのに有用で堅牢な技術を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物を対象とする手順は、デューク大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
ファーストブルーの1鼻腔内投与
ファーストブルーの場合、少なくとも2日間、マウスを安楽死前に染料を管理します。染料は、最大8週間持続します。
- 呼吸が遅くし始めるまで光吸入麻酔（2.5％セボフルラン）でマウスを麻酔。
- マウスを確保するために時折一時停止、ゆっくり鼻孔に染料溶液40μl（0.4mMのファーストブルー、1％ジメチルスルホキシド、DMSO、リン酸緩衝生理食塩水、PBS）を植え付ける濾過ヒントを200μlのピペットを使用して溶液を吸引され（ 図1A）。
- 、垂直方向にマウスを押したままヘッドアップ、そして優しく色素が肺全体に広がる確保するために胸をマッサージします。
解剖と分析日に2.準備
- 10ミリリットルを準備0; 表1に指定されている成分を組み合わせることによって神経節解離ソリューション（GADS）。
- 専用ラボエリア内のRNAの抽出を行います。実験を開始する前に、70％エタノール、10％の漂白剤、およびRNaseの汚染除去試薬と清浄な表面。これは、RNA遠心分離機、任意のチューブラック、およびピペットを含んでいます。専用のフィルターチップボックスはRNAのみでの使用のためにそこにあることを確認してください。これはサンプルを汚染するとして、DNA調製のために、この機器やエリアを使用しないでください。
- RNaseフリー水を用いて新鮮な70％、および80％エタノールを混合します。 RNAの抽出に使用されるサンプルごとに1 mlで調製します。
| 成分 | 量 |
| 高度なDMEM / F12 | 9.5ミリリットル |
| グルタミン | 100μlの |
| HEPES（10mMの） | 100μlの |
| N2サプリメント | 100μlの |
| B27（なしビタミンA） | 200μlの |
| NGF（50μg/ mlの） | 10μlの |
神経節解離ソリューション（GADS） 表 1. 試薬混合物。
3.解剖手順
- 500μlのGADS、各実験試料について1、ポジティブソート制御のための1、および負の仕分け制御のための1つの1.5 mlチューブを埋めます。解剖を通してチューブを氷上に保管してください。
- 節状神経節を解剖し、解離を促進するために、二つの部分のカットを行い、その後、実験試料管に入れて。節状神経節16とDRG 17の解剖については、次のJoveのプロトコルを参照してください。
- ソートのコントロールのために、このような後根神経節（DRG）などの神経節を、解剖し、部分的に非標識カット。ポジティブコントロールと2 gangliための2つの神経節を使用しますネガティブコントロールのために。
- 成功した並べ替えのための十分な結節ニューロンを得るためには、GADSを含む1つの実験サンプル管に5匹のマウスからの神経節を兼ね備えています。
4.知覚神経節解離
- チューブ内の神経節を残して、500μlのGADSをピペット。一度1mlのPBSを添加することにより洗浄神経節は、その後、PBSをピペット、チューブの底に沈殿する神経節を待ちます。
- 1ミリリットルGADSと消化酵素の22μlの（コラゲナーゼI / IIおよびプロテアーゼ混合物は、2.5 mg / mlで中のH 2 O）を各チューブを追加します。
- 陽性対照チューブに20μlのファーストブルー（5.26ミリモル）を追加します。
- 既に37℃に設定した水浴または加熱ブロックにチューブを入れてください。
注：神経節消化の時間は、消化酵素の年齢に依存します。消化酵素を溶解する1ヶ月以内に、30分間のダイジェスト、2の内部 - 6ヶ月、45分間のダイジェスト。酵素は6ヶ月以上古いものであれば、神経節Fをダイジェストまたは60分。 - 15分毎に振盪管簡単と神経節を確実にするために、それらをフリック溶液で覆われています。
- 神経節が消化されている間、粒子溶液（ポリビニルピロリドンで被覆されたコロイドシリカ粒子）を用いた密度勾配を調製します。
- GADS、サンプルあたり500μlの12％の粒子溶液を混ぜます。
- GADS、サンプルあたり500μlの28％粒子溶液を混ぜます。
- ゆっくりと慎重に、各サンプルの新しい1.5 mlチューブに400μlの28％濃度溶液の上に400μlの12％濃度の溶液を添加します。 2つの層が混在しないようにしてください。二つの異なる層は、チューブ内に表示されるはずです。他のより暗い1。
- 神経節を消化されている間、（1ファーストブルー陽性およびサンプルを分類ごとに1ファーストブルー負のチューブ）をソートするための新しい1.5 mlのコレクションチューブにラベルを付けます。干渉しないようにソート機能要件に応じて、これらのチューブは、取り外し可能な蓋を持っている必要がありますセルソーターた電子。
- 適当な消化時間後、消化酵素でGADSを除去し、1mlのPBSで2回神経節を洗います。各チューブに新鮮なGADSの200μLを加えます。
- 離れて細胞を破壊するには、上下に数回200μlの100μlの容量に設定さピペット、ピペット神経節を使用してください。組織のない無傷の作品が見られなくなるまで繰り返します。溶液中の気泡を作成しないでください。
- 70μmのセルストレーナーを通して解離した細胞を渡します。
- 残された残りの浮遊細胞をピックアップし、セルストレーナーを介して追加のソリューションを渡すために、元の解離管に別の100μlのGADSを追加します。新しいピペットチップを使用して、ストレーナを通過し、メッシュにしがみついた残りの細胞含有液を収集します。 GADSに懸濁された細胞の最終容量は300μLです。
- 慎重に以前に作られた密度勾配の上に細胞を300μlをレイヤー。 Cの泡と混合を避けます密度層を有するells。
- 室温で2900×gで10分間遠心します。
- 細胞は遠心分離器であるが、以下のように、溶解バッファー（実験サンプルあたり1ミリリットル）を混ぜる：10μlの2-メルカプトエタノール（RNA抽出キットから）1ミリリットルのBuffer RLTインチ
- ファーストブルー正のコレクションチューブに300μlの溶解バッファーとファーストブルー負のコレクションチューブ（ステップ4.7からラベルされたチューブ）に600μlのを追加します。この体積は、収集されると予想される細胞の数に依存します。 7000細胞600μlを添加するために、<2,000細胞、300μlを添加する>が。これはかなりの溶解緩衝液を希釈しないソートシース流体を保証します。
- 遠心分離が完了したら、慎重に取り外し、トップ700μlの層を捨てます。この層は、他の方法で細胞選別を妨害する細胞の破片の大部分が含まれています。
- 溶液およびピペットを含む残りの細胞に700μlの新鮮なGADSを追加TE数回上下に混合します。
- 細胞をペレットに2900×gで15分間遠心します。
- 細胞は遠心分離器であるが、1ミリリットルのGADSに5μlのDNアーゼ（10mg / ml）を添加することにより、GADS（サンプルあたり500μl）をソート混ぜます。
- 遠心分離が完了したら、慎重に細胞ペレットを残し、上澄み液を除去し、廃棄します。
- 再懸濁200で細胞ペレット - と200μlの数倍に設定千μlをピペットで上下にピペッティングすることにより、GADSをソート300μLを。氷の上にサンプルを置きます。細胞は、今ソートする準備ができています。
5.蛍光活性化細胞（FAC）並べ替え
注：このセクションでは、運用FACSソーターの知識や熟練者の支援を必要とします。
- 細胞生存度を試験するために、各サンプルに1μlのヨウ化プロピジウム（PI）ストック溶液（50μg/ ml）を加えます。 2チューブ、PIと1と1なしに負の制御を分割します。 PIは死んだ細胞のDNAと結合します。もし最初のいくつかの種類の後に標識する全く死んだ細胞が存在しない、PIの使用は必要ありません。
- 交通細胞を氷上で例えば 、BD FACS AriaIIは、歌姫8ソフトウェアを実行して、楽器フローサイトメトリーします。
- セルサイズがこの集団内の変数であるため、ソートに大ノズル（100μm）を使用します。ストレス細胞経験の量を減少させ、細胞生存率は、低圧（20 PSI）を使用して増加させます。
- 必要に応じて、解析プロット、前方散乱、側方散乱（SSC）、ファーストブルー、およびPIを設定するために、FACSソーターのソフトウェアを使用してください。
- 細胞を再懸濁するために、そっとソーターにロードする前にサンプルを簡単にボルテックス。
- ゲート閾値（ 図2A）を設定するために、ネガティブコントロール、無ファーストブルーまたはPIで始まります。これは、細胞集団内の自己蛍光の量を決定します。オプション：死んだ細胞の集団があるかどうかを識別するために、PIで負のサンプルを実行します。
- 陽性対照サンプル（株式会社を並べ替えます補正パラメータを設定するには、）ファーストブルーでubated。
- ゲートおよびパラメータを設定した後、実験サンプルを選別始めます。試料は、RNA溶解緩衝液を含む準備コレクションチューブにソートされます。
- 細胞選別が完了するまで氷上でソートされたサンプルを保管してください。
- 細胞がソートされた直後のRNA抽出工程を開始します。
6. RNA抽出
- 1分間、溶解緩衝液で渦選別された細胞をホモジナイズします。
- 数回ピペッティングにより70％エタノールとミックスの1ボリュームを追加します。
- スピンカラムに700μlのサンプルまで移します。 8000 x gで15秒間遠心します。フロースルーを捨てます。
- 試料の全量をスピンカラムを通過するまで繰り返します。
- メーカーのprotocoに従って、DNase処理工程を含む、350μlのBuffer RW1を追加し、RNA精製プロセスを続行細胞についてリットル。
- RNAを抽出した後、製造業者の仕様書に従って、マイクロ流体電気泳動システムを用いてRNAの品質をテストします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この方法を使用して、気道神経支配するニューロンは、鼻腔内にファーストブルー（ 図1A）を浸透することによって標識されます。 2日後、ファーストブルー標識された細胞は、節状神経節（ 図1C）に表示されます。節状神経節の全ニューロン集団の5％ - これらの細胞は、3を構成しています。この目的のために使用されてきた他の逆行性染料はのDiI（1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチル過塩素酸塩）およびフルオロゴールドを含みます。ニューロン結節のDiIラベルへの肺暴露。しかし、DiIでは神経節に達するのに時間がかかり、7から14日点眼18,19の後、したがって、積極的に輸送染料を使用しました。フルオロゴールドはまた、気道ニューロン14,20を標識するために使用されている積極的に輸送色素です。我々の経験では、しかし、一度この染料は（データは示していない）、それは迅速に衛星細胞ではなく、神経細胞によってピックアップされた結節神経節に細胞体に達しました。ファストブルー代替が積極的に成功し、かつ迅速に、ラット21および気道神経支配の結節ニューロン13,14におけるDRGを標識する蛍光色素を輸送しています。ファーストブルーアプローチは、したがって、より堅牢かつ再現性が表示されます。
結節神経節の切開は、先16に記載されており、その位置は、簡単に、図1Bに示されています。消化は節状神経節を切除された直後に開始されます。一緒に凝集からニューロンを防止し、クリーンなソートを可能にし、穏やかな消化酵素を使用するには、任意の破片をクリアし、神経節ソート液にRNアーゼを追加します。多数の消化酵素の混合物は、有効性について試験しました。軽度の消化酵素混合物22は、成人の神経節消化のために、タイムリーで細胞をばらばらにするのに十分強力ではなかった、しかし、試みました。また、以前にパパインの23の組み合わせを使用し、プロテアーゼ、およびコラゲナーゼ酵素の混合物も積極的であることが判明した（データは示さず）、望ましくない細胞死を引き起こしました。特定の酵素混合物で概説消化プロトコルは、高い細胞生存率と適時の消化のために理想的であることが見出されました。
以前の方法は、非標識細胞24から標識細胞を分離するためにガラスピペットでピッキングマニュアルのセルを使用しています。この技術は、少数の細胞の単一細胞分析のために適しています。細胞の数百または数千の全集団を収集する必要がある場合が、48細胞/時の最大速度で、この技術は非現実的です。目標は、高品質のRNAを単離する場合には、時間が重要な変数となります。分解を防ぐために可能な限り迅速RNA抽出を開始することが重要です。 FACのソートは〜45分を全体ラベルされた人口の収集を可能にし、RNA抽出は、直後に開始されます。
O：キープtogether.withinページ= "1">のニューロンをソートする場合、壊れた神経突起からできるだけ多くの破片をクリアすることが重要です。密度勾配は、分離試料から破片をクリアするために使用されました。それが5μm24〜、小さな半径を持つC線維ニューロンを、確実にするために十分に高い力で遠心分離することが重要であり、勾配を介して強制的にされています。
図2AおよびBは、選別ゲートを設定するために使用陰性および陽性対照を示しています。 図2Cから分かるように、解離ファーストブルーソート2つの集団に結節の細胞を標識しました。このサンプルから採取した細胞の数は、 図2Dに記載されています。 85％ - このメソッドの効率をソートする73です。ニューロンをソートする場合、前方散乱および側方散乱パラメータは、特異性を追加しませんでした。ニューロンは球形ではないので、これらのパラメータは、確実にセルサイズを報告することができませんでした。
「FO：キープtogether.within-ページを=「ENT高品質のRNA収量について1 ">は、細胞を溶解緩衝液に直接ソートする必要があり、RNAは、マイクロ流体電気泳動システムをテストするために使用されたソートした後、すぐに抽出する必要があります。 RNAの質（ 図3）。18S及び28Sのピークは、RNA完全性番号（RIN）を計算するために使用されるゲル電気泳動により決定される。RNAは、RINこのRNAサンプルは、現在配列決定される準備ができて7より大きくなければならないサンプルを配列決定のために。
図1.迷走神経の節状神経節における気道神経支配ニューロンのファーストブルーラベリング。 A）肺へのファーストブルー鼻腔内滴下の表現。光セボフルラン麻酔下で、ピペット1％DMSOを含むPBS中のファーストブルー40μlのマウスの鼻の穴に、マウスが流体中に吸引されていることを確認すること。
ファーストブルー陽性細胞のためのゲートをソート図2.蛍光活性化細胞（FAC）。ソートゲートを設定するには、負の（A）及び正（B）はファーストブルー陽性集団を確立するために、コントロールを使用。陰性対照（A）は、DRG細胞番目解離しますで肺を支配しません。陽性対照（B）は、それらが切開された後、in vitroでのファーストブルーでインキュベートされるDRG細胞を解離します。解離したニューロンの非球面形状に、前方散乱および側方散乱パラメータは、細胞集団を定義する助けにはなりません。C）気道ブルーをFastに暴露されたマウスの神経節細胞結節解離の代表一種。D） （C）のための細胞数。 1,000以上のファーストブルー（FB）細胞を回収した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.当選者を使用したRNAの品質およびRNA完全性番号（RIN）の割り当てマイクロ流体電気泳動システムを使用しての評価。rophoresisシステムは、RNAの品質は、画像のゲル画像の18Sおよび28Sのピークから計算されます。低いピークは、分解されたRNAを表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、迷走神経の節状神経節で気道神経支配ニューロンをターゲットにする方法を説明しています。一旦標識神経節を穏やかに最適細胞数および生存率を維持するために分離されています。これらのニューロンは、その後、FACは、溶解緩衝液に直接ソートされ、RNAが抽出されます。このプロトコルの重要性は、標的に切り分け、および特定の感覚細胞集団の品質を維持する能力です。遺伝子発現は、ニューロンのこの小集団に記載されており、器官特異的機能とニューラルネットワークが識別されます。
このプロトコルでの重要なステップは、解離過程を経て急速な進行とそれに続く細胞選別を含みます。解離後直ちに開始するように、並べ替えの時間をスケジュールすることが重要です。 70％と80％のエタノール溶液を新たに作製された、すべてのRNA抽出試薬が新鮮であることも重要であり、そしてRNA抽出のための全てのチューブおよび機器無料の清潔およびRNaseです。
このプロトコルは、細胞が単一細胞RNA抽出およびシークエンシングのためにウェルプレートに個別にソートされるように改変することができます。また、後根神経節（DRGを）などの他の感覚神経節からの細胞を単離するために使用することができます。 DRGを再びトレースする異なる身体部分の染料の注入は、以前17に記載されています。このプロトコルはまた、機能的分析のために細胞を収集するように改変することができます。代わりに、溶解緩衝液に細胞を選別する、細胞は、ニューロン培地、GADSに分類されます。次いで、これらの細胞を培養し、カルシウム画像化、または電気生理学など機能的研究のために使用されます。
ファーストブルー陽性集団が期待される結果よりも小さい場合には、新たな消化酵素を購入。消化酵素の年齢は、消化の効率と相関しています。消化酵素は、購入の1年以内に使用する必要があります。細胞数が高い場合には、RNAを抽出し、品質が検査されます。 RNAが分解されている場合、これは試薬が新鮮ではない、又は汚染されていることを示します。この場合には、徹底的にすべてのRNA抽出領域、ピペット、ラック、および試料管と接触する何かをきれいにしてください。新鮮なRNアーゼおよびDNアーゼ無料の70％および80％エタノールを加えます。これらの溶液を作製するために使用される水及びエタノールは、他の実験用品は別に保持され、もっぱらRNA抽出のために使用されるべきです。
FACソーティングファストブルー陽性細胞を単離するための迅速かつ効率的な方法であるが、1つの制限は、細胞密度がmlの緩衝液当たり1〜200万個の細胞でなければならないということです。このプロトコルは、現在のセルソーターモデルの限界をプッシュします。結節神経節内の細胞の数が少ないです。セルソーターのための十分な細胞収量を得るために、5匹の動物からの細胞をプールします。 300μlの少ない10万懸濁した細胞を持っている - 説明ソートボリュームは200です。 T推奨密度以下ミリリットル当たり約45万細胞の濃度、に彼の変換します。セルソーターを使用する1つの代替案は、蛍光顕微鏡やガラスピペット24と自分に都合の良いように選ぶことです。この技術は遅く、30収集するために使用されている - 一度に100細胞。したがって、このプロトコルは、既存の方法に比べてより高速、高スループットの方法を提供しています。
このプロトコルの将来のアプリケーションは、気道神経支配神経の特定の集団の転写プロファイルを決定する能力を含みます。このプロトコルを使用して収集し、高品質のRNAを回収し、ニューロンのトランスクリプトームを特徴付けるために、cDNA合成および次世代シークエンシング、および他の技術のためのテンプレートとして使用することができます。このようにして、これらのニューロンに特異的である遺伝子または経路を決定することができます。この情報は、これらのニューロンは、正常な生理的条件で再生機能的役割を解明するのに役立ちます。基本的に一度発現パターンが確立されている、システムは、肺神経支配神経細胞における遺伝子調節に対する効果を決定するために、物理的および化学的刺激により、または病原体によるチャレンジすることができます。最後に、我々は、新しい薬理学的標的を同定および気道疾患における神経機能の急性および慢性の変化を妨害する治療薬の効果を調査するために開始することができる調節される遺伝子を同定することによって。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
SEJにNIH助成R01HL105635でサポートされています。著者は、技術的な助言のためにディエゴ・V.Bohórquezに感謝したいと思います。我々はまた、技術支援、デュークヒトワクチン研究所研究フローサイトメトリー共有リソース機能（ダーラム、ノースカロライナ州）でのフローサイトメトリーを実行するためのR.イアンカミングに感謝します。フローサイトメトリー国立衛生研究所、アレルギーの国立研究所感染症（UC6-AI058607）から建設のための部分的なサポートを受けデューク大学の地域の生物学的封じ込め実験室で行いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
