Abstract
Somatosensoriske nerver transduce termisk, mekanisk, kjemisk, og skadelige stimuli forårsaket av både endogene og miljøagenter. Cellen likene av disse afferente nerveceller ligger innenfor sensoriske ganglier. Sensoriske ganglia innerverer et bestemt organ eller en del av kroppen. For eksempel, er den dorsale rotganglier (DRG) som befinner seg i ryggsøylen og forlenge prosesser i hele kroppen og lemmene. Trigeminal ganglia er plassert i hodeskallen og innerverer ansikt, og øvre luftveiene. Vagale afferente av nodose ganglia forlenge gjennom gut, hjerte og lunger. De nodose nevroner styre et variert utvalg av funksjoner som: respirasjonsfrekvens, luftveisirritasjon og hoste reflekser. Således, for å forstå og manipulere deres funksjon, er det avgjørende å identifisere og isolere luftveis spesifikke nevronale sub-populasjoner. I mus, blir luftveiene utsettes for et fluoriserende spor fargestoff, Hurtig Blått, for retrograd sporing av luftvei-spesifikk nodose neurons. De nodose ganglia blir dissosiert og fluorescens-aktivert celle (FAC) sortering brukes til å samle fargestoff-positive celler. Deretter er høy kvalitet ribonukleinsyre (RNA) hentet fra fargestoff positive celler for neste generasjons sekvensering. Ved hjelp av denne fremgangsmåten luftvei spesifikke nevronale genekspresjon blir bestemt.
Introduction
Somatosensoriske nerver transduce termisk, mekanisk, kjemisk, og skadelige stimuli forårsaket av både endogene og miljøagenter. De cellelegemer av disse afferente nerver er lokalisert i sensoriske ganglier, slik som dorsal root, trigeminal eller nodose ganglia. Hver sensorisk ganglion innervates spesifikke regioner av kroppen og inneholder celler som innerverer separate organer og vev i denne regionen. For eksempel, er den dorsale rotganglier (DRG) som befinner seg i ryggsøylen og forlenge prosesser i hele kroppen og lemmene, mens trigeminal ganglia er plassert i hodeskallen, inneholdende neuroner som innerverer de ansikt, øyne, hjernehinnene eller øvre luftveier 1, 2. Den nodose ganglia av vagus nerve ligger i halsen under hodeskallen og inneholder cellelegemer som går nervefibre gjennom mage-tarmkanalen, hjerte og nedre luftveier og lunger 3. Hos mennesker den nodose ganglion står alene, men i musen er det smeltetmed jugularis ganglion, som også innervates lungene 4. Dette smeltet ganglion kalles ofte vena / nodose kompleks, vågal ganglion, eller rett og slett nodose ganglion 5. Her er det referert til som nodose ganglion.
Afferente fibrene i nodose overføre informasjon fra innvollene til kjernen av den ensomme tarmkanalen (NTS) i hjernestammen. Sanseinntrykk til denne unike ganglion styrer et variert utvalg av funksjoner, for eksempel tarmmotilitet 6, puls 7, respirasjon 8,9, og etse-aktivert respiratorisk respons 10,11. Med denne mangfold av funksjoner og innerverte organer, er det avgjørende å målrette og isolere organspesifikke subpopulasjoner av den nodose ganglion for å studere de enkelte nervebaner. Imidlertid, gitt den lille størrelsen av nodose og det begrensede antall av neuroner det inneholder dette er ikke en triviell oppgave. Hver mus nodose ganglion inneholder omtrent 5000 nevroner 12i tillegg til en omfattende befolknings støtte satellittceller. Av de 5000 nodose nevroner, kun 3-5% innerverer luftveiene. Derfor er funksjonelle, morfologiske eller molekylære endringer i luftveis-innervating nevroner, på grunn av luft stimulering eller patologi, vil gå tapt i tettpakket nodose ganglion.
For å løse dette problemet, ble det utviklet en metode for å identifisere og isolere nevroner som innerverer luftveiene. Luftveiene ble utsatt for et fluoriserende spor fargestoff for å identifisere de etterfølgende innervating nodose neuroner. Fast Blå ble plukket opp av nevroner og reiser raskt til sin celle organer der det er beholdt i opptil åtte uker 13 - 15. Når identifisert, en mild, men effektiv, dissosiasjon protokollen ble brukt til å bevare fargestoff merking og celleviabilitet for fluorescerende aktivert celle (FAC) sortering. Sorterte cellene brukes til å ekstrahere høy kvalitet ribonukleinsyre (RNA) for å bestemme genekspresjon eller feller andre nedstrøms molekylær analyse. Denne protokollen gir en nyttig og robust teknikk for å isolere sensoriske nevroner som innerverer en vev av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Duke University.
1. intranasal administrasjon av Fast Blå
For Fast Blå, administrere fargestoff minst 2 dager før euthanizing musen. Fargestoffet vil vedvare i opptil åtte uker.
- Anesthetize mus med lys inhalasjonsanastesi (2,5% sevofluran) til å puste begynner å bremse.
- Bruk en 200 ul pipette med filtrert tips til langsomt innpode 40 ul av fargestoff oppløsning (0,4 mM ekte blå, 1% dimetylsulfoksyd, DMSO, i fosfatbufret saltoppløsning, PBS) inn i neseboret, pause av og til for å sikre at musen er aspirering av løsningen (figur 1A).
- Hold musen vertikalt, hodet opp, og forsiktig massasje brystet for å sikre fargestoff sprer seg gjennom lungene.
2. Forberedelser på Dissection og analyse Day
- Forbered 10 ml0; ganglia Dissosiasjon Solution (Gads) ved å kombinere ingrediensene som angitt i tabell 1.
- Utfør RNA ekstraksjon i en egen lab-området. Før du begynner eksperimentet, rene flater med 70% etanol, 10% blekemiddel, og RNase dekontaminering reagens. Dette inkluderer RNA sentrifuge, noen rør stativer, og pipetter. Sørg for at det er dedikert filter tips bokser for RNA bruk. Ikke bruk dette utstyret og området for DNA forberedelse, da dette vil forurense prøvene.
- Blande frisk 70%, og 80% etanol med RNase-fritt vann. Fremstille 1 ml per prøven som skal brukes i RNA-ekstraksjon.
| Ingrediens | Beløp |
| Avansert DMEM / F12 | 9,5 ml |
| glutamin | 100 pl |
| HEPES (10 mM) | 100 pl |
| N2 supplement | 100 pl |
| B27 (ingen vitamin A) | 200 ul |
| NGF (50 ug / ml) | 10 ul |
Tabell 1. Reagens Blanding for ganglia Dissosiasjon Solution (Gads).
3. Dissection Prosedyre
- Fyll 1,5 ml rør med 500 mL GADs, en for hver eksperimentell prøve, en for en positiv sortering kontroll, og en for en negativ sortering kontroll. Lagre rørene på is hele disseksjon.
- Dissekere ut nodose ganglion og lage to delvis kutt for å legge til rette for dissosiasjon, og deretter sette den i den eksperimentelle prøverøret. Vennligst henvis til følgende Jove protokoll for disseksjon av nodose ganglia 16 og DRG 17.
- Dissekere og delvis gjennomskåret ikke-merket ganglier, slik som den dorsale rotganglier (DRG), for sorterings kontrollene. Bruk to ganglia for den positive kontrollen og to Gangliet for den negative kontrollen.
- For å få nok nodose nevroner for vellykket sortering, kombinere gangliene fra 5 mus i en eksperimentell prøve tube inneholder Gads.
4. Sensorisk ganglia Dissosiasjon
- Pipetter ut 500 mL GADs, forlater ganglia i røret. Vask ganglia en gang ved tilsetning av 1 ml PBS, vente på ganglia fikk sette seg på bunnen av røret, og deretter pipette ut PBS.
- Tilsett 1 ml GADs og 22 ul av kutteenzym (collagenase I / II og protease blanding, 2,5 mg / ml i H2O) til hvert rør.
- Tilsett 20 mL Fast Blå (5,26 mm) til den positive kontrollen røret.
- Sette rørene i et vannbad eller varmeblokken allerede er innstilt på 37 ° C.
Merk: Tidspunktet for ganglia fordøyelsen avhenger av alderen på fordøyelsen enzymet. Innen 1 måned oppløse kutteenzym, digest i 30 minutter, i løpet av 2 - 6 måneder for å fordøye i 45 minutter. Dersom enzymet er over 6 måneder gammel, fordøye ganglia feller 60 min. - Hvert 15 min riste rør kort og flick dem for å sikre gangliene dekkes av løsningen.
- Mens ganglia blir fordøyd, forberede tetthetsgradienter ved hjelp av en partikkel løsning (kolloidalt silikapartiklene belagt med polyvinylpyrrolidon).
- Bland 12% partikkel løsning i GADs, 500 mL per prøve.
- Bland 28% partikkel løsning i GADs, 500 mL per prøve.
- Langsomt og tilsett forsiktig 400 ul 12% tetthet oppløsning på toppen av 400 ul 28% tetthet oppløsning i en frisk 1,5 ml rør for hver prøve. Ikke la de to lagene å blande. To distinkte lag skal være synlig i røret; en mørkere enn den andre.
- Mens ganglia blir fordøyd, merk nye 1,5 ml samling rør for sortering (en rask blå positiv og en rask blå negativ tube per sortering prøve). Avhengig av sorteringsanlegget krav, må disse rørene har avtagbare lokk slik at man ikke interfere med cellen sorter.
- Etter riktig fordøyelsen tid, fjerne GADs med fordøyelsen enzym og vaske ganglia to ganger med 1 ml PBS. Tilsett 200 ul av frisk GADs til hvert rør.
- Bruk en 200 mL pipette, satt til 100 ul volum, og pipette ganglia opp og ned flere ganger for å bryte celler fra hverandre. Gjenta til du ikke lenger intakt stykke vev er sett. Unngå å skape bobler i løsningen.
- Pass dissosierte cellene gjennom en 70 mikrometer celle sil.
- Legg ytterligere 100 mL GADs til den opprinnelige dissosiasjon røret for å plukke opp eventuelle gjenværende streif celler til venstre og passere den ekstra oppløsningen gjennom celle sil. Ved hjelp av en ny pipettespiss, samle opp eventuelt gjenværende celle-inneholdende væske som har passert gjennom silen og klamret til nettingen. Sluttvolumet av celler suspendert i GADs er 300 ul.
- Nøye lag 300 ul av celler på toppen av tidligere gjort densitetsgradient. Unngå bobler og blanding av calen med lag tettheten.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 2900 xg ved romtemperatur.
- Mens celler er i sentrifugen, bland lyseringsbuffer (1 ml per eksperimentell prøve) som følger: 10 ul 2-merkaptoetanol i 1 ml buffer RLT (fra RNA-ekstraksjon kit).
- Tilsett 300 mL lysis buffer til Fast Blå positiv samling rør og 600 mikroliter til Fast Blå negativ samling rør (rør merket fra trinn 4.7). Dette volumet avhenger av antall celler som forventes å bli samlet. For <2000 celler, tilsett 300 ul, for> 7000 celler legge 600 mL. Dette vil sikre at sorteringsskjermfluid ikke i vesentlig grad fortynnes lyseringsbuffer.
- Når sentrifugering er fullført, fjerner forsiktig og kast den øverste 700 mL laget. Dette laget inneholder mesteparten av celleavfall som ellers vil forstyrre cellesortering.
- Legg 700 ul frisk GADs til den resterende celle inneholdende oppløsning og pipettete opp og ned flere ganger for å blande.
- Sentrifuger i 15 minutter ved 2900 x g for å pelletere cellene.
- Mens celler er i sentrifugen, bland sortering GADs (500 mL per prøve) ved å tilsette 5 ul DNase (10 mg / ml) til 1 ml GADs.
- Når sentrifugeringen er ferdig, fjernes forsiktig og kast supernatant, slik at cellepelleten.
- Re-suspen cellepelleten i 200 - 300 ul sortering GADs ved å pipettere opp og ned med en 1000 ul pipette for å sette 200 ul flere ganger. Sett prøvene på is. Cellene er nå klar til å bli sortert.
5. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortering
Merk: Denne delen krever operativ kunnskap om en FACS sorter eller assistanse av kyndig personell.
- Tilsett 1 mL propidiumjodid (PI) løsning (50 ug / ml) til hver prøve for å teste for cellenes levedyktighet. Delt negativ kontroll i 2 rør, en med PI og en uten. PI binder DNA bare i døde celler. Hvisetter de første sorterer det ikke er noen døde celler å merke, bruk av PI ikke er nødvendig.
- Transport celler til flowcytometri instrument, f.eks., BD FACS AriaII kjører Diva 8 programvare, på is.
- Siden cellestørrelsen er variabel i denne populasjonen, bruker du en stor dyse (100 mikrometer) for sortering. For å redusere mengden stress i cellene erfaring og øke cellelevedyktigheten bruke lavt trykk (20 psi).
- Bruk FACS sorter programvare for å sette opp analyse tomter, frem scatter, side scatter (SSC), Fast blå, og PI, om nødvendig.
- Å re-suspendere celler, forsiktig vortex prøven kort før du legger den inn i sorter.
- Begynn med negativ kontroll, ingen Fast Blå eller PI, for å sette porten terskel (figur 2A). Dette vil bestemme mengden av autofluorescens i cellepopulasjonen. Valgfritt: Kjør negativ prøve med PI å avdekke om det er en populasjon av døde celler.
- Sorter positive kontrollprøve (incubated med Fast blå), for å sette kompensasjon parametere.
- Når portene og parametere er satt, begynne å sortere de eksperimentelle prøvene. Prøvene er sortert i forberedt samling rør som inneholder RNA lysis buffer.
- Hold sorterte prøvene på is inntil cellesortering er fullført.
- Begynn RNA ekstraksjon skritt umiddelbart etter cellene er sortert.
6. RNA Utvinning
- Vortex sorterte cellene i lysis buffer i 1 minutt for å homogenisere.
- Tilsett 1 volum av 70% etanol og blanding ved å pipettere opp og ned flere ganger.
- Overfør opp til 700 pl av prøven til en spinnkolonne. Sentrifuger i 15 sekunder ved 8000 x g. Kast gjennomstrømnings.
- Gjenta til totalt volum av prøven føres gjennom spinnkolonne.
- Legg 350 ul Buffer RW1 og fortsette RNA renseprosessen, inklusive DNase behandlingstrinn, i henhold til produsentens-protokollenl for celler.
- Når RNA er blitt ekstrahert, teste RNA-kvalitet ved anvendelse av en mikrofluid elektroforese system i henhold til produsentens spesifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne metoden, er luftveis-innervating nevroner merket av intranasalt instilling Fast Blå (figur 1A). Etter to dager, vaskeekte blå merkede celler vises i nodose ganglia (figur 1C). Disse cellene utgjør 3-5% av den totale nevronale befolkningen i nodose ganglia. Andre retrograd fargestoffer som har blitt brukt til dette formålet inkluderer Dil (1,1'-dioktadekyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat) og Fluorogold. Lung eksponering for Dii etiketter nodose nerveceller. Imidlertid tar lengre tid for å nå DII ganglion, 7 - 14 dager etter instillasjon 18,19, ble derfor en aktivt transportert fargestoff som brukes. Fluorogold er et aktivt transporteres fargestoff som også har vært brukt til å merke luftveis neuroner 14,20. I vår erfaring, men når dette fargestoff nådde cellelegemer i nodose ganglion det ble raskt plukket opp av satellittceller og ikke nevroner (data ikke vist). RaskBlue er en alternativ transporteres aktivt fluorescerende fargestoff som vellykket, og raskt, etiketter DRG hos rotter 21 og luftveis-innervating nodose nevroner 13,14. Fast blå tilnærmingen derfor synes mer robust og reproduserbar.
Disseksjon av nodose ganglion er tidligere beskrevet 16 og dens plassering er kort vist i figur 1B. Fordøyelsen starter umiddelbart etter at nodose ganglia har blitt skåret. For å hindre at nerveceller fra klumper sammen og gi rom for en renere form, bruk en mild fordøyelse enzym, fjerne rusk og legge RNase til gangliene løsning sortering. Flere fordøyelsesenzymblandinger ble testet for effektivitet. En mild fordøyelse enzym blanding 22 ble forsøkt, men for voksne ganglion fordøyelsen det ikke var sterk nok til å bryte fra hverandre celler i tide. Alternativt kan en tidligere brukt 23 kombinasjon av papain, proteaseOg kollagenase enzymblandingen, viste seg å være for aggressiv og forårsaket uønsket celledød (data ikke vist). Den skisserte fordøyelse protokoll, med den angitte enzymblandingen, ble funnet å være ideelt for å gjennomføre en oppslutning med høy cellelevedyktighet.
Tidligere fremgangsmåter har benyttet manuell plukking celle med et glass pipette for å separere merkede celler fra umerkede celler 24. Denne teknikk er bedre egnet for enkelt celle analyse av et lite antall celler. Imidlertid, med en maksimal hastighet på 48 celler / time av denne teknikken er upraktisk når hele populasjoner av hundrevis eller tusenvis av cellene trenger for å bli samlet. Når målet er å isolere høy kvalitet RNA, blir tiden en viktig variabel. Det er viktig å starte RNA-ekstraksjon så raskt som mulig for å forhindre nedbrytning. FAC sortering tillater samling av hele merket befolkningen i ~ 45 min og RNA ekstraksjon startes umiddelbart etter.
o: keep-together.within-page = "1"> Når sortering nevroner er det viktig å fjerne så mye rusk fra ødelagte nerveprosesser. En densitet gradient ble anvendt for å fjerne rusk fra dissosierte prøvene. Det er viktig å sentrifugere ved en tilstrekkelig høy styrke til å sikre at C-fiber nevroner, som har en liten radius, ~ 5 um 24, tvinges gjennom gradienten.
Figur 2A og B viser de negative og positive kontroller brukes til å stille inn sorterings porter. Som kan sees i figur 2C, det dissosierte Fast blå merkede nodose celler slag i to populasjoner. De celle tall samlet inn fra denne prøven er oppført i figur 2D. Sortering effektivitet for denne metoden er 73 - 85%. Når du sorterer nevroner termin scatter og side scatter parametere ikke legge spesifisitet. Siden nevroner er ikke sfærisk disse parametrene ikke var i stand til å pålitelig rapportere cellestørrelse.
ent "fo: holde-together.within-siden =" en "> For høy kvalitet RNA utbytte, cellene trenger for å bli sortert direkte inn i lysis buffer og RNA bør trekkes ut umiddelbart etter sortering Et mikrofluid elektroforese system ble brukt til å teste. kvaliteten av RNA (Figur 3). de 18S og 28S topper er bestemt ved gel-elektroforese som brukes til å beregne et RNA integritet nummer (RIN). for RNA-sekvensering av prøven RIN bør være større enn 7. Denne RNA-prøven er nå klar til å bli sekvensert .
Figur 1. Fast Blå Merking av Airway innervating nevroner i Nodose ganglia av nervus vagus. A) En fremstilling av vaskeekte blå intranasal drypping ned i lungene. Under lys sevofluran anestesi, pipette 40 ul Fast Blå i PBS med 1% DMSO i neseborene til en mus, noe som gjør at musen er aspirere i væsken.
Figur 2. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortering porter Fast Blå positive celler. For å sette opp sortering porter bruke negative (A) og positive (B) kontrollerer for å etablere Fast Blå positive befolkningen. Den negative kontroll (A) blir dissosiert DRG-celler thved ikke innerverer lungene. Den positive kontrollen (B) blir dissosiert DRG celler som ruges med Fast Blue in vitro, etter at de har blitt dissekert. På grunn av den ikke-sfærisk form av dissosiert nevroner, vil termin scatter og side scatter parametere ikke bidra til å definere cellepopulasjon. C) En representant slags dissosiert nodose ganglia celler i mus som luftveiene har vært utsatt for Fast blå. D) legemer for (C). Over 1000 Fast Blå (FB) celler ble samlet inn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Vurdering av RNA Kvalitet og Overdragelse av RNA Integrity Number (RIN) Ved hjelp av en mikrofluid elektroforese System. Ved hjelp av en utvalgtrophoresis system kvaliteten på RNA er beregnet ut fra 18S og 28S toppene på avbildet gel bildet. Den nedre peak representerer degradert RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å målrette luftvei-innervating nevroner i nodose ganglia av nervus vagus. Når merket, blir ganglia forsiktig dissosiert til optimalt bevare celle tall og levedyktighet. Disse nervecellene er så FAC sortert direkte i lysebuffer og RNA er hentet. Betydningen av denne protokollen er evnen til å målrette, isolere og bevare kvaliteten på en bestemt sansecellepopulasjon. Genekspresjon er beskrevet i dette liten populasjon av neuroner, og organspesifikke funksjoner og nevrale nettverk identifiseres.
De kritiske trinn i denne protokollen inkluderer rask progresjon gjennom dissosiasjon prosessen og påfølgende cellesortering. Det er viktig å planlegge sorterings tid slik at den starter umiddelbart etter dissosiasjon. Det er også viktig at alle RNA ekstraksjon reagensene er friske, 70% og 80% etanolløsninger er laget, og alle rør og utstyr for RNA-ekstraksjoner rene og RNase gratis.
Denne protokollen kan endres slik at cellene blir sortert individuelt i tillegg plater for enkelt celle RNA ekstraksjon og sekvensering. Den kan også brukes til å isolere celler fra andre sensoriske ganglier, så som dorsale rotganglier (DRG). Dye injeksjon av ulike kroppsdeler for å spore tilbake til DRG har vært tidligere beskrevet 17. Denne protokollen kan også bli modifisert for å samle celler for funksjonell analyse. I stedet for å sortere celler i lyseringsbuffer ble cellene sortert i neuronal kulturmedium, GADs. Disse cellene blir deretter dyrket og anvendt for funksjonelle studier slik som kalsium avbildning, eller elektrofysiologi.
Dersom Fast blå positive befolkningen er mindre enn den forventede resultatet, kjøpe ny fordøyelsen enzym. Alderen på fordøyelsen enzymet er korrelert til effektiviteten av fordøyelsen. Fordøyelsen enzym må brukes innen 1 år etter kjøpet. I det tilfelle hvor celletallet er høyt,RNA ble ekstrahert og kvalitetstestet. Dersom RNA er degradert dette er en indikasjon på at reagensene er ikke frisk, eller har blitt forurenset. I dette tilfellet, må du passe på å rengjøre alle RNA utvinningsområdene, pipetter, stativer, og noe som vil komme i kontakt med prøverør. Gjør frisk RNase og DNase gratis 70% og 80% etanol. Den vann og etanol brukes til å gjøre disse løsningene bør også holdes atskilt fra andre lab forsyninger og brukes kun for RNA ekstraksjon.
FAC sortering er en rask og effektiv metode for isolering av ekte blå-positive celler, er imidlertid en begrensning at celletettheten bør være 1 til 2 millioner celler pr ml buffer. Denne protokollen skyver grensen for aktuelle cellesorteringsmodeller. Antall celler i nodose ganglion er liten. For å få en celle utbytte tilstrekkelig for cellesorterer, blir celler fra fem dyr samlet. Sorterings volum beskrevet er 200 - 300 mikroliter og har færre enn 100.000 suspenderte celler. Thans oversettes til en konsentrasjon på rundt 450.000 celler per ml, under anbefalt tetthet. Ett alternativ til å bruke en cellesorterings er å håndplukker med et fluorescerende mikroskop og glass pipette 24. Denne teknikken er langsommere og har vært brukt til å samle inn 30 - 100 celler på en gang. Derfor denne protokollen gir en raskere high-throughput metode i forhold til eksisterende metoder.
De fremtidige anvendelser av denne protokollen inkluderer muligheten til å bestemme transcriptional profilen til en bestemt populasjon av luftveis-innervating nerver. Den høye kvaliteten RNA oppsamlet under anvendelse av denne protokollen kan brukes som et templat for cDNA-syntese og neste generasjon sekvensering, og andre teknikker for å karakterisere transkriptomet av de innsamlede neuroner. På denne måten kan det bestemmes hvilke gener eller veier som er spesifikke for disse neuroner. Denne informasjonen vil bidra til å belyse den funksjonelle rollen disse nevronene spille i normale fysiologiske forhold. Når grunnleggendeuttrykk mønstre er etablert, kan systemet bli utfordret av fysiske og kjemiske stimuli eller patogener å bestemme deres virkninger på genregulering i lunge-innervating nevroner. Til slutt, ved å identifisere hvilke gener som er regulert vi kan identifisere nye farmakologiske mål og begynner å undersøke effektene av therapeutics å forstyrre akutte og kroniske forandringer i nervefunksjon i luftveissykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Støttet av NIH gi R01HL105635 til SEJ. Forfatterne ønsker å takke Diego V. Bohórquez for teknisk rådgivning. Vi takker også R. Ian Cumming for teknisk assistanse og utførelse av flowcytometri ved (Durham, NC) hertugen Menneskelig Vaccine Institute Forskning flowcytometrisystemer Shared Resource Facility. Flowcytometri ble utført i Regional Biocontainment Laboratory ved Duke som fikk delvis støtte for bygging fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
