Abstract
nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes neurónios aferentes estão localizados dentro do gânglio sensorial. gânglios sensoriais que inervam um órgão específico ou porção do corpo. Por exemplo, o gânglio da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros. O gânglio trigeminal estão localizados no crânio e inervam a face, e das vias aéreas superiores. aferentes vagais dos gânglios nodosos se estender por todo o intestino, coração e pulmões. Os neurónios nodosos controlar um conjunto diversificado de funções, tais como: freqüência respiratória, irritação das vias aéreas, e reflexo de tosse. Assim, entender e manipular a sua função, é crítica para identificar e isolar sub-populações neuronais específicas das vias aéreas. No rato, as vias aéreas estão expostas a um corante marcador fluorescente, azul rápido, para rastreamento retrógrado de neurônio nodose específica das vias aéreass. Os gânglios nodosos são dissociados e de células activadas por fluorescência (FAC) de classificação é usado para coletar células positivas de corante. Em seguida, o ácido ribonucleico, de alta qualidade (ARN) é extraído a partir de células positivas de corante para a próxima geração de sequenciação. Usando este método de expressão do gene de vias aéreas neuronal específica é determinada.
Introduction
nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes nervos aferentes estão localizados em gânglios sensoriais, tais como a raiz dorsal, trigeminal, ou gânglios nodosos. Cada gânglio sensorial inerva regiões específicas do corpo e contém células que inervam órgãos e tecidos separadas dentro dessa região. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros, enquanto que o gânglio trigeminal estão localizados no crânio, contendo neurónios que inervam a face, olhos, meninges ou das vias aéreas superiores 1, 2. A gânglios nodosos do nervo vago está localizado no gargalo abaixo do crânio e contém corpos celulares que se estendem fibras nervosas ao longo do tracto gastrointestinal, no coração e pulmões e vias aéreas inferiores 3. Nos seres humanos o gânglio nodoso está sozinho, no entanto, no ratinho é fundidacom o gânglio jugular, que também inerva os pulmões 4. Este gânglio fundido é muitas vezes chamado a jugular / nodose complexa, gânglio vagal, ou simplesmente nodose gânglio 5. Aqui, é referido como o gânglio nodoso.
fibras aferentes do nodosos passar informações de vísceras para o núcleo do tracto solitário (NTS) no tronco cerebral. Entrada sensorial para esta gânglio único controla um conjunto diversificado de funções, tais como a motilidade intestinal 6, 7 da frequência cardíaca, a respiração 8,9, e as respostas respiratórias activado-irritantes 10,11. Com esta diversidade de funções e órgãos inervados, é crítico para alvejar e isolar subpopulações específicas de órgãos do gânglio nodoso, a fim de estudar vias neuronais individuais. No entanto, dado o pequeno tamanho do nodosos e ao limitado número de neurónios que contém esta não é uma tarefa trivial. Cada rato nodose gânglio contém cerca de 5.000 neurônios 12em adição a uma grande população de células de suporte satélite. Dos 5.000 neurónios nodosos, apenas 3 - 5% inervam as vias aéreas. Portanto, quaisquer alterações funcionais, morfológicos ou moleculares dentro dos neurônios das vias aéreas-inervação, devido a estimulação respiratória ou patologias, serão perdidos no gânglio nodoso densamente.
Para resolver este problema, foi desenvolvido um método para identificar e isolar neurónios que inervam as vias aéreas. As vias aéreas foram expostos a um corante marcador fluorescente para identificar os neurónios nodosos inervação subsequentes. Azul rápida foi apanhada por neurônios e viaja rapidamente para seus corpos celulares, onde é retido por até oito semanas 13 - 15. Uma vez identificados, um protocolo de dissociação suave, mas eficiente foi usado para preservar rotulagem corante e viabilidade celular para celular ativado fluorescente (FAC) de classificação. As células seleccionadas são usadas para extrair o ácido ribonucleico de alta qualidade (ARN) para determinar a expressão do gene ou fou outra análise molecular a jusante. Este protocolo proporciona uma técnica útil e robusto para isolar neurónios sensoriais que inervam um tecido de interesse.
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Protocol
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Duke.
1. Administração Intranasal de Fast Blue
Para Fast Blue, administrar o corante, pelo menos, 2 dias antes da eutanásia o mouse. O corante vai persistir por até oito semanas.
- Anestesiar o rato com anestesia inalatória leve (2,5% sevoflurano) até que começa a respiração lenta.
- Usar uma pipeta de 200 uL com pontas filtrados para instilar-se lentamente 40 ml de solução de corante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solução salina de DMSO, em tampão fosfato, PBS) na narina, parando periodicamente para assegurar o rato é aspiração da solução (Figura 1A).
- Segure o mouse vertical, cabeça para cima e massageie suavemente no peito para garantir o corante se espalha por todo o pulmão.
2. Preparações sobre Dissecção e Dia Análise
- Preparar 10 ml0; Ganglia dissociação Solução (GADs) por combinação dos ingredientes tal como especificado no Quadro 1.
- Realizar a extracção de ARN em uma área de laboratório dedicado. Antes de começar a experiência, limpar as superfícies com 70% de etanol, 10% de água sanitária, e reagente de descontaminação RNase. Isto inclui a centrifugação de ARN, quaisquer suportes de tubos, e as pipetas. Garantir que não dedicados ponta caixas de filtro para uso apenas RNA. Não utilize este equipamento e área para preparação de ADN, como isso vai contaminar as amostras.
- Mistura fresca de 70% e 80% de etanol com água livre de RNase. Prepare 1 ml para cada amostra a ser usado na extracção de ARN.
| Ingrediente | Quantidade |
| Avançada DMEM / F12 | 9,5 ml |
| glutamina | 100 ul |
| HEPES (10 mM) | 100 ul |
| suplemento N2 | 100 ul |
| B27 (sem vitamina A) | 200 ul |
| NGF (50 ug / ml) | 10 ul |
Tabela 1. Mistura Reagente para Ganglia dissociação Solution (gads).
3. Dissecção Procedimento
- Encher tubos de 1,5 ml com 500 ul GADs, uma para cada amostra experimental, um como contraprova positiva de triagem, e uma para um controlo negativo de triagem. tubos de loja no gelo durante todo dissecção.
- Dissecar o gânglio nodoso e fazer dois cortes parciais para facilitar a dissociação, em seguida, colocá-lo no tubo de ensaio experimental. Por favor, consulte o seguinte protocolo JoVE para dissecção dos gânglios nodosos 16 e DRG 17.
- Dissecar e parcialmente em corte gânglios não marcado, tais como gânglio da raiz dorsal (DRG), para os controlos de triagem. Use dois gânglios para o controlo positivo e dois Ganglium para o controlo negativo.
- Para obter neurónios nodosos suficientes para classificar bem sucedida, combinar gânglios a partir de 5 ratos em um tubo de amostra experimental contendo GADs.
4. Sensorial Ganglia dissociação
- Pipeta 500 GADs ul, deixando gânglios no tubo. Lave gânglios uma vez, adicionando 1 ml PBS, aguarde gânglios para assentar no fundo do tubo, então pipeta PBS.
- Adicionar 1 ml GADs e 22 ul da enzima de digestão de colagenase (I / II e mistura de protease, 2,5 mg / ml em H2O) a cada tubo.
- Adicionar 20 ul azuis Rápido (5,26 mm) para o tubo de controlo positivo.
- Colocar os tubos num banho de água ou bloco de aquecimento já fixada em 37 ° C.
Nota: O tempo de digestão gânglios depende da idade da enzima de digestão. No espaço de 1 mês de dissolução do enzima de digestão, digestão durante 30 min, a 2 - 6 meses digerir durante 45 min. Se a enzima é mais de 6 meses de idade, digerir gânglios fou 60 min. - A cada 15 minutos tubos de agitar brevemente e agite-los para assegurar gânglios são cobertos pela solução.
- Enquanto estão a ser digerido gânglios, preparar gradientes de densidade, utilizando uma solução de partículas (partículas de sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona).
- Misturar a solução de partículas% 12 em GADs, 500 ul por amostra.
- Misturar a solução de partículas% 28 em GADs, 500 ul por amostra.
- Lentamente e cuidadosamente adicionar solução densidade de 400 ul de 12% na parte superior da solução densidade de 400 ul de 28% em um tubo de 1,5 ml fresco para cada amostra. Não permita que as duas camadas para misturar. Duas camadas distintas deve ser visível no tubo; uma mais escura que a outra.
- Enquanto gânglios estão sendo digerida, rotular novos tubos de 1,5 ml de coleta para ordenar (um tubo rápido Azul positivo e um rápido Azul negativo por amostra de classificação). Dependendo dos requisitos da instalação de triagem, estes tubos devem ter tampas amovíveis de modo a não interferirE com o classificador de células.
- Após o tempo de digestão adequada, remova GADs com enzima de digestão e lavar gânglios duas vezes com 1 ml PBS. Adicionar 200 ul de GADs fresco a cada tubo.
- Usar uma pipeta de 200 mL, definido como volume de 100 mL, e gânglios pipeta cima e para baixo várias vezes para separar as células. Repita até que nenhum pedaço intacto do tecido é visto. Evitar a criação de bolhas na solução.
- Passa células dissociadas através de um filtro celular de 70 uM.
- Adicionar mais 100 GADs ul ao tubo de dissociação original para pegar todas as células perdidas restantes esquerda e passar a solução adicional através do filtro de células. Utilizando uma nova ponta de pipeta, recolher qualquer líquido contendo células remanescente que passou através do filtro e agarrou-se à malha. O volume final de células suspensas em GADs é 300 ul.
- camada cuidadosamente os 300 ul de células no topo do gradiente de densidade previamente feita. Evitar bolhas e mistura de cells com as camadas de densidade.
- Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg à temperatura ambiente.
- Enquanto as células são na centrífuga, mistura de tampão de lise (1 ml por amostra experimental) como se segue: 10 ul de 2-mercaptoetanol em 1 ml de tampão de RLT (estojo de extracção de ARN).
- Adicionar 300 mL de tampão de lise de tubo de coleta positiva Azul Rápido e 600 mL ao tubo rápido Azul negativo de coleta (tubos rotulados a partir do passo 4.7). Esse volume depende do número de células que se espera serem recolhidos. Para <2000 células, adicionar 300 ul, durante> 7.000 células adicionar 600 ul. Isto irá assegurar que o fluido de revestimento de classificação não dilui significativamente o tampão de lise.
- Uma vez que a centrifugação estiver concluída, remova cuidadosamente e elimine a camada ul top 700. Esta camada contém a maioria dos resíduos celulares que de outra forma interfira com a separação de células.
- Adicionar 700 ul GADs frescos para a célula restante contendo solução e pipetate para cima e para baixo várias vezes para misturar.
- Centrifugar durante 15 minutos a 2900 xg para sedimentar as células.
- Enquanto as células são na centrífuga, misturar triagem GADs (500 ul por amostra) pela adição de 5 ul de ADNase (10 mg / ml) até 1 ml GADs.
- Depois de centrifugação é feito, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante, deixando o sedimento celular.
- Re-suspender pellet celular em 200 - 300 ml de classificação GADs pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 1000 mL ajustado para 200 mL várias vezes. Coloque as amostras em gelo. As células são agora pronto para ser classificado.
5. fluorescência celular ativado (FAC) Classificando
Nota: Esta seção requer conhecimento operacional de um classificador FACS ou a assistência de pessoal qualificado.
- Adicionar uma solução de estoque ul iodeto de propídio (PI) (50 ug / ml) para cada amostra a testar para a viabilidade celular. Divisão de controle negativo em 2 tubos, um com PI e um sem. PI se liga ao ADN apenas em células mortas. E seapós os primeiros tipos não há células mortas, para rotular, não é necessário o uso de PI.
- Células de transporte para citometria de fluxo instrumento, por exemplo., BD FACS AriaII executando o software Diva 8, em gelo.
- Uma vez que o tamanho da célula é variável nesta população, usar um grande bocal (100 uM) para a classificação. Para diminuir a quantidade de tensão da experiência as células e aumentar a viabilidade celular utilizar baixa pressão (20 psi).
- Use o software classificador FACS para configurar as parcelas de análise, de dispersão para a frente, dispersão lateral (SSC), Blue rápido e PI, se necessário.
- Para as células re-suspender, gentilmente vortex brevemente a amostra antes de o colocar na classificador.
- Comece com o controlo negativo, nenhum Fast Blue ou IP, para definir o limite de portão (Figura 2A). Isto vai determinar a quantidade de autofluorescência na população de células. Opcional: Executar a amostra negativa com PI para identificar se existe uma população de células mortas.
- Classificar a amostra de controlo positivo (incubated com Fast Blue), para definir os parâmetros de compensação.
- Uma vez que os portões e parâmetros são definidos, começam a triagem das amostras experimentais. As amostras são classificadas dentro dos tubos de coleta de preparados contendo tampão RNA lise.
- Manter as amostras classificadas em gelo até que a separação de células é completa.
- Comece a etapa de extração de RNA imediatamente após as células são classificadas.
6. Extracção de ARN
- Vortex células classificadas em tampão de lise durante 1 min para homogeneizar.
- Adicionar 1 volume de etanol a 70% e misture pipetando cima e para baixo várias vezes.
- Transferir para 700 ul da amostra a uma coluna de centrifugação. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Descartar o fluxo de passagem.
- Repetir até que o volume total da amostra é passada através da coluna de centrifugação.
- Adicionar 350 ul de tampão de RW1 e continuar o processo de purificação de ARN, incluindo o passo de tratamento com ADNase, de acordo com Protoco do fabricantel para as células.
- Uma vez que o RNA foi extraído, testar a qualidade de ARN utilizando um sistema de electroforese de microfluidos de acordo com as especificações do fabricante.
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Representative Results
Usando este método, os neurónios da via aérea-inervação são rotulados por via intranasal incutir Fast Blue (Figura 1A). Após dois dias, as células marcadas azul depressa aparecem nos gânglios nodosos (Figura 1C). Essas células formam 3-5% da população neuronal total do gânglios nodosos. Outros corantes retrógrada, que têm sido utilizados para este fim incluem DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine) e Fluorogold. exposição de pulmão aos rótulos DII nodosos neurônios. No entanto, DII leva mais tempo para atingir o gânglio, 7 - 14 dias após a instilação 18,19, utilizou-se, portanto, um corante transportado activamente. Fluorogold é um corante transportado activamente que também tem sido utilizado para marcar os neurónios das vias aéreas 14,20. Na nossa experiência, no entanto, uma vez que este corante atingiu os corpos celulares no gânglio nodoso foi rapidamente captado por células satélite e não neurónios (dados não mostrados). RápidoO azul é uma alternativa ativamente transportado corante fluorescente que com sucesso, e rapidamente, etiquetas DRG em ratos 21 e das vias aéreas-inervação neurónios nodosos 13,14. A abordagem Fast Blue, por conseguinte, parece ser mais robusta e reprodutível.
A dissecção do gânglio nodoso foi anteriormente descrito e a sua localização 16 é brevemente ilustrada na Figura 1B. A digestão começa imediatamente após os gânglios nodosos foram excisadas. Para evitar que os neurônios se aglomerem e permitir um tipo aspirador, use uma enzima digestão suave, limpar todos os detritos e adicione RNase para os gânglios solução de classificação. Várias misturas de enzimas de digestão foram testados para a eficácia. Uma mistura leve enzima digestão 22 foi julgado, no entanto, para a digestão gânglio adulto que não era forte o suficiente para quebrar as células de uma forma atempada. Em alternativa, uma combinação previamente utilizado 23 de papaína, proteaseE mistura de enzimas colagenase, provou ser demasiado agressivo e causou a morte das células indesejáveis (dados não mostrados). O protocolo delineado digestão, com a mistura de enzima especificada, verificou-se ser o ideal para uma digestão com oportuna viabilidade celular elevada.
Métodos anteriores usaram células manual de picking com uma pipeta de vidro para separar células marcadas a partir de células não marcadas 24. Esta técnica é mais adequada para a análise de células isoladas de um pequeno número de células. No entanto, com uma taxa máxima de 48 células / hr esta técnica é impraticável quando populações inteiras de centenas ou milhares de células precisam ser recolhidos. Quando o objetivo é isolar RNA de alta qualidade, o tempo torna-se uma variável-chave. É importante para iniciar a extracção de ARN tão rapidamente quanto possível para evitar a degradação. FAC triagem permite a recolha de toda a população rotulados de ~ 45 min e extração de RNA é iniciado imediatamente após.
o: manter-together.within-page = "1"> Ao classificar os neurônios é importante para limpar o máximo de detritos de processos neuronais quebrados. Um gradiente de densidade foi usado para limpar os escombros das amostras dissociados. É importante para centrifugar a uma força suficientemente elevada para assegurar que os neurónios de fibra C, que têm um pequeno raio, ~ 5 ^ M 24, são forçados através do gradiente.
Figura 2A e B mostram os controles negativos e positivos usados para definir as portas de classificação. Como pode ser visto na Figura 2C, o dissociado azul rápido células marcadas nodosos tipo em duas populações. Os números de células recolhidas a partir desta amostra estão listadas na Figura 2D. Triagem eficiência para este método é de 73 - 85%. Ao classificar os neurônios os parâmetros de dispersão e dispersão lateral para a frente não acrescentar especificidade. Desde os neurônios não são esféricos esses parâmetros não foram capazes de informar de forma confiável o tamanho da célula.
ent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Para rendimento de RNA de alta qualidade, as células precisam de ser resolvida diretamente no tampão de lise e RNA deve ser extraído imediatamente após triagem Um sistema de eletroforese microfluídico foi usado para testar a. qualidade de ARN (Figura 3). os picos de 18S e 28S são determinados por meio de electroforese em gel utilizada para calcular um número de integridade do RNA (NIR). para a sequenciação de ARN da amostra RIN deve ser superior a 7. Esta amostra de RNA está agora pronto para ser sequenciado .
Figura 1. Rápido Azul Rotulagem de Airway inervam neurónios no Nodoso gânglios do nervo vago. A) Uma representação da rápida instilação intranasal azul para os pulmões. Sob anestesia com sevoflurano luz, pipeta 40 ul de azul rápido em PBS com 1% de DMSO nas narinas de um mouse, certificando-se o mouse é a aspiração do líquido.
Figura 2. Fluorescência de células activadas (FAC) Classificando Portões para Fast células azuis positivos. Para configurar a classificação portões usar o negativo (A) e positiva (B) controla a estabelecer a população positiva Rápido Azul. O controlo negativo (A) é dissociado células DRG tha não inervam os pulmões. O controlo positivo (B) é dissociado DRG células que são incubadas com Fast Blue in vitro, depois de terem sido dissecados. Devido à forma não esférica de neurónios dissociados, os parâmetros de dispersão e de dispersão lado da frente não vai ajudar a definir a população de células. C) Uma espécie representativa de dissociado nodosos células dos gânglios de ratinhos cujas vias aéreas foram expostos a azul rápido. D) A contagem de células para (C). Mais de 1.000 células rápidos Blue (FB) foram coletados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Avaliação da RNA Qualidade e Atribuição de RNA Integridade Number (RIN) utilizando um sistema microfluídico Eletroforese. Usando um eleitosistema rophoresis a qualidade do RNA é calculado a partir dos picos 18S e 28S na imagem do gel fotografado. O pico inferior representa RNA degradado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método para alvejar neurónios das vias aéreas-inervação nos gânglios nodosos do nervo vago. Uma vez marcado, os gânglios são suavemente dissociados para otimizar a preservar o número de células e viabilidade. Estes neurónios são, então, classificados FAC directamente em tampão de lise e o ARN é extraído. A importância deste protocolo é a capacidade de segmentar, isolar e preservar a qualidade de uma população de células sensorial específica. A expressão de genes é descrito nesta pequena população de neurónios, e as funções específicas do órgão e redes neurais são identificados.
Os passos críticos neste protocolo incluem rápida progressão através do processo de dissociação e subsequente separação de células. É importante para marcar a hora de triagem de modo a que começa imediatamente após a dissociação. Também é fundamental que todos os reagentes de extracção de RNA são frescos, as soluções de 70% e 80% de etanol são feitas frescos, e todos os tubos e equipamentos para extração de RNAsão limpos e RNase livre.
Este protocolo pode ser modificado de tal modo que as células são classificadas individualmente em placas de poços para a extracção de RNA de células única e sequenciação. Ele também pode ser usado para isolar as células de outros gânglios sensoriais, tais como gânglio da raiz dorsal (DRG). Dye injeção de diferentes partes do corpo para o traçado de volta para DRGs tem sido descrito anteriormente 17. Este protocolo pode também ser modificado para recolher células para análise funcional. Em vez de células em tampão de lise de classificação, as células são classificados em meio de cultura neuronal, GADs. Estas células são em seguida cultivadas e utilizadas para estudos funcionais tais como a imagiologia de cálcio, ou electrofisiologia.
Se a população positiva para azul rápido é menor do que o resultado esperado, comprar nova enzima de digestão. A idade da enzima de digestão é correlacionada com a eficiência da digestão. A enzima de digestão precisa de ser usado no prazo de 1 ano de compra. No caso em que o número de células é alta,O ARN é extraído e testado a qualidade. Se o ARN é degradada esta é uma indicação de que os reagentes não são frescos, ou ter sido contaminadas. Neste caso, certifique-se de limpar completamente todas as áreas de extração de RNA, pipetas, racks e qualquer coisa que vai entrar em contato com os tubos de amostra. Faça RNase fresco e DNase livre de etanol a 70% e 80%. A água e etanol usado para fazer essas soluções também devem ser mantidos separados dos outros suprimentos de laboratório e utilizados exclusivamente para a extração de RNA.
FAC triagem é um método rápido e eficiente para o isolamento de células positivas Fast Blue, no entanto, uma limitação é que a densidade de células deve ser de 1 a 2 milhões de células por ml de tampão. Este protocolo empurra o limite de modelos de separação de células atuais. O número de células do gânglio nodoso é pequena. Para obter um rendimento celular suficiente para a separação de células, as células de cinco animais são reunidos. O volume de triagem descrito é de 200 - 300 ul e tem menos de 100.000 células em suspensão. Tseus traduz-se numa concentração de cerca de 450.000 células por ml, abaixo da densidade recomendada. Uma alternativa à utilização de um separador de células é handpick com um microscópio fluorescente e vidro pipeta 24. Esta técnica é mais lenta e tem sido utilizado para recolher 30 - 100 células de cada vez. Portanto, este protocolo oferece um método mais rápido de alto rendimento em comparação com os métodos existentes.
As futuras aplicações deste protocolo incluem a capacidade de determinar o perfil transcricional de uma população específica de nervos vias aéreas-inervação. O RNA de alta qualidade recolhidas utilizando este protocolo pode ser utilizado como um molde para a síntese de cDNA e sequenciação próxima geração, e outras técnicas para caracterizar o transcriptoma dos neurónios recolhidos. Desta forma, pode-se determinar quais os genes ou vias são específicas para estes neurónios. Esta informação irá ajudar a elucidar o papel funcional desses neurônios jogar em condições fisiológicas normais. Uma vez básicapadrões de expressão foram estabelecidas, o sistema pode ser contestada por estímulos físicos e químicos ou por patógenos para determinar os seus efeitos na regulação dos genes nos neurônios do pulmão de inervação. Finalmente, através da identificação de quais genes são regulados podemos identificar novos alvos farmacológicos e começar a investigar os efeitos da terapêutica para interferir com alterações agudas e crónicas da função do nervo em doenças das vias respiratórias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Financiado pelo NIH conceder R01HL105635 a SEJ. Os autores gostariam de agradecer a Diego V. Bohórquez para aconselhamento técnico. Agradecemos também R. Ian Cumming para a assistência técnica e realização da citometria de fluxo no Centro de Duke vacina humana Instituto de Pesquisa Citometria de Fluxo de recursos partilhados (Durham, NC). A citometria de fluxo foi realizada no Laboratório de biocontenção Regional na Duke que recebeu o apoio parcial para a construção dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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