Abstract
Соматосенсорные нервы трансдукции тепловые, механические, химические и вредные стимулы, вызванные как эндогенных, так и факторов окружающей среды. Клеточные тела этих афферентных нейронов расположены в пределах сенсорных ганглиев. Сенсорных ганглиев иннервируют конкретный орган или часть тела. Например, ганглии задних корешков (DRG) расположены в позвоночнике и расширить процессы по всему телу и конечностям. Тройничного ганглиев расположены в черепе и иннервируют лицо и верхние дыхательные пути. Вагусными афференты в Узловые ганглиев распространяются на протяжении кишечника, сердца и легких. В Узловые нейроны контролируют широкий спектр функций, таких как: частота дыхания, раздражение дыхательных путей и кашель рефлексов. Таким образом, чтобы понять и манипулировать их функции, крайне важно, чтобы идентифицировать и изолировать в дыхательных путях конкретных нейронные субпопуляции. У мышей, дыхательные пути подвергаются флуоресцентного индикаторного красителя, Fast Blue, для ретроградного отслеживании в дыхательных путях специфических нодозного нейронеs. В Узловые ганглиев разобщены и флуоресценции активированных клеток (FAC) сортировка используется для сбора красителей положительных клеток. Далее, высокое качество рибонуклеиновой кислоты (РНК) извлекается из красителя положительных клеток к следующей последовательности поколения. С помощью этого метода дыхательные пути определяется специфическая экспрессия гена нейронный.
Introduction
Соматосенсорные нервы трансдукции тепловые, механические, химические и вредные стимулы, вызванные как эндогенных, так и факторов окружающей среды. Клеточные тела этих афферентных нервов расположены в сенсорных ганглиев, таких как спинной корень, невралгии тройничного или нодозного ганглиев. Каждая сенсорная ганглий иннервирует конкретных областей тела и содержит клетки, которые возбуждают отдельные органы и ткани в этом регионе. Например, ганглии задних корешков (DRG) расположены в позвоночнике и расширить процессы по всему телу и конечностям, в то время как тройничный ганглии расположены в черепе, содержащий нейроны, иннервирующие лицо, глаза, мозговые оболочки или верхние дыхательные пути 1, 2. Узловатый ганглии блуждающего нерва находится в области шеи ниже черепа и содержит тела клеток , которые проходят нервные волокна в течение всего желудочно - кишечного тракта, сердца, и нижние дыхательные пути и легкие 3. У человека узловатый ганглий стоит особняком, однако, у мышей он слитс яремной ганглия, который также иннервирует легкие 4. Этот слитый ганглий часто называют яремной / узловатый комплекс, блуждающего ганглий, или просто узловатый ганглий 5. Здесь он упоминается как нодозного ганглия.
Афферентные волокна узловатый передают информацию от внутренностей к ядру одиночного пути (NTS) в стволе головного мозга. Сенсорное вход в этот уникальный ганглии управляет множеством разнообразных функций, таких как кишок 6, частота сердечных сокращений, дыхания 7 8,9, и раздражающих активированные респираторных реакций 10,11. С этим разнообразием функций и иннервируемых органов, крайне важно, чтобы цели и выделить специфические для органа субпопуляций нодозного ганглии с целью изучения отдельных нейронных путей. Однако, учитывая небольшой размер узловатый и ограниченное число нейронов она содержит это не является тривиальной задачей. Каждая мышь узловатый ганглий содержит примерно 5000 нейронов 12в дополнение к обширной популяции поддержки сателлитных клеток. Из 5000 узловатый нейронов, только 3 - 5% иннервируют дыхательные пути. Таким образом, любые функциональные, морфологические или молекулярные изменения в пределах воздушной трассы-иннервирующих нейронов, из-за стимуляции дыхания или патологий, будут потеряны в плотно упакованной нодозного ганглии.
Чтобы решить эту проблему, был разработан метод, чтобы идентифицировать и изолировать нейроны, которые иннервируют дыхательные пути. Дыхательные подвергались воздействию флуоресцентного индикаторного красителя, чтобы идентифицировать последующие нейроны иннервирующих узловатый. Быстрый Синий подхватили нейронов и быстро перемещается к их клеточных тел , где она сохраняется до восьми недель 13 - 15. После идентификации, мягкий, но эффективный, протокол диссоциации был использован для сохранения маркировки красителя и жизнеспособность клеток для люминесцентной активированной клетки (FAC) сортировочный. Отсортированные клетки используются для извлечения высокого качества рибонуклеиновой кислоты (РНК) для определения экспрессии гена или Fили другой вниз по течению молекулярного анализа. Этот протокол обеспечивает полезный и надежный метод для изоляции сенсорных нейронов, иннервирующих ткани интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) из Университета Дьюка с.
1. Интраназальная Администрация Fast синий
Для быстрого Blue, администрировать краситель по крайней мере за 2 дня до эвтаназии мыши. Краска будет сохраняться до восьми недель.
- не Обезболить мышь с легкой ингаляционной анестезии (2,5%) до севофлураном дыхания начинает замедляться.
- С помощью 200 мкл пипетки с отфильтрованным кончиков медленно привить 40 мкл раствора красителя (0,4 мМ Быстрый синий, 1% диметилсульфоксид, ДМСО, в фосфатном буферном растворе, PBS), в ноздрю, делая паузу время от времени, чтобы обеспечить мышь аспирационных решение (Рисунок 1А).
- Держите мышь вертикально, головой вверх, и нежно массировать грудь, чтобы обеспечить краситель распространяется по всей легких.
2. Подготовка к Dissection и день анализа
- Приготовьте 10 мл0; Ганглиев диссоциация Solution (Gads) путем комбинирования ингредиентов , как указано в таблице 1.
- Выполнение экстракции РНК в выделенной зоне лаборатории. Перед началом эксперимента, чистые поверхности с 70% этанола, 10% хлорной извести и реагента обеззараживания РНКазы. Это включает в себя РНК-центрифугу, любые стойки трубки и пипетки. Убедитесь, что существуют специализированные фильтрующим мундштуком коробки для использования только РНК. Не следует использовать данное оборудование и площадь для подготовки ДНК, так как это будет загрязнять образцы.
- Смешайте свежий 70% и 80% этанола с РНКазы без воды. Подготовка 1 мл на образец для использования в экстракции РНК.
| Ингредиент | Количество |
| Advanced DMEM / f12 | 9,5 мл |
| глутамин | 100 мкл |
| HEPES (10 мМ) | 100 мкл |
| N2 добавка | 100 мкл |
| В27 (без витамина А) | 200 мкл |
| ФРН (50 мкг / мл) | 10 мкл |
Таблица 1. Реагент Смесь для ганглиев раствора (диссоциации Gads).
3. Процедура Вскрытие
- Наполните 1,5 мл пробирки с 500 мкл Gads, по одному для каждого экспериментального образца, один для положительного контроля сортировочного, и один для отрицательного контроля сортировочного. Хранить трубы на льду в течение рассечение.
- Рассеките из узловатый ганглий и сделать два частичных сокращений для облегчения диссоциации, а затем положить его в экспериментальном образце трубки. Пожалуйста , обратитесь к следующему протоколу Jove для рассечения нодозного ганглиев 16 и DRG 17.
- Dissect и частичным разрезом немеченого ганглии, например, спинальных ганглиях (DRG), для сортировочных элементов управления. Используйте два ганглии для положительного контроля и двух gangliА для отрицательного контроля.
- Для того, чтобы получить достаточное количество нейронов узловатый для успешной сортировки, объединить ганглиев из 5 мышей в один экспериментальный образец пробирки, содержащей Gads.
4. Сенсорная Ганглиев диссоциация
- Пипетировать из 500 мкл шляется, оставляя ганглиев в трубке. Вымойте ганглии один раз путем добавления 1 мл PBS, ждать ганглии оседают на дно пробирки, затем пипеткой из PBS.
- Добавляют 1 мл Gads и 22 мкл переваривания фермента (коллагеназы I / II и смеси протеазы, 2,5 мг / мл в H 2 O) в каждую пробирку.
- Добавьте 20 мкл Быстрый синий (5,26 мМ) к положительному выводу контрольной трубки.
- Поместите пробирки в блоке водяной бане или нагрева уже при 37 ° C.
Примечание: Время ганглиев пищеварения зависит от возраста пищеварения фермента. В течение 1 месяца растворения переваривания фермента, переваривают в течение 30 мин, в течение 2 - 6 месяцев переваривать в течение 45 мин. Если фермент составляет более 6 месяцев, дайджест ганглиев пили 60 мин. - Каждые 15 мин сотрясения трубки кратко и вылить их, чтобы обеспечить ганглии покрываются раствором.
- В то время как ганглии переваривается, готовят градиенты плотности с использованием раствора частиц (коллоидные частицы диоксида кремния, покрытые поливинилпирролидона).
- Смешайте 12% -ный раствор частиц в Gads, 500 мкл на образце.
- Смешайте 28% раствор частиц в Gads, 500 мкл на образце.
- Медленно и осторожно добавляют 400 мкл 12% -ного раствора плотность на вершине 400 мкл 28% раствора плотностью в свежую 1,5 мл пробирку для каждого образца. Не позволяйте два слоя перемешать. Два различных слоев должны быть видны в трубе; один темнее, чем другие.
- В то время как ганглии переваривается, маркировать новые пробирки 1,5 мл сбора для сортировки (один быстрый синий положительный и один быстрый Синий отрицательную туба на сортировочной образца). В зависимости от требований к сортировочных объекте, эти трубки должны иметь съемные крышки таким образом, чтобы не INTERFERе с клеточным сортировщика.
- После того, как соответствующее время пищеварения, удалить шляется с пищеварением ферментом и мыть ганглиев дважды 1 мл PBS. Добавить 200 мкл свежей Gads в каждую пробирку.
- Используйте 200 мкл пипетки, установите объемом 100 мкл и пипетки ганглии вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить клетки друг от друга. Повторяйте, пока не нетронутым кусочек ткани не видно. Избегайте образования пузырьков в растворе.
- Проход диссоциированных клеток через клеточный фильтр 70 мкм.
- Добавьте еще 100 мкл Gads к исходной диссоциации трубки, чтобы забрать оставшиеся паразитных клетки слева и пройти дополнительное решение через ячейки фильтра. Используя новый наконечник пипетки, собрать все оставшиеся ячейки, содержащие жидкость, прошедшую через сито и цеплялся к сетке. Конечный объем клеток, суспендированных в Gads составляет 300 мкл.
- Тщательно наслаивать 300 мкл клеток в верхней части предварительно приготовленным градиента плотности. Избегайте пузырьков и смешивания Cгезов со слоями плотности.
- Центрифуга в течение 10 мин при 2,900 мкг при комнатной температуре.
- В то время как клетки находятся в центрифуге, смешать лизирующий буфер (1 мл на экспериментальном образце) следующим образом: 10 мкл 2-меркаптоэтанола в 1 мл Буфера RLT (с использованием набора для экстракции РНК).
- Добавьте 300 мкл буфера для лизиса к быстрому Синей положительной пробирку для сбора и 600 мкл к быстрому Синей отрицательной коллекторной трубки (трубки, меченные со стадии 4.7). Этот объем зависит от количества клеток, как ожидается, будут собраны. Для <2000 клеток, добавляют 300 мкл для> 7000 клеток добавляют 600 мкл. Это обеспечит сортировочный жидкость оболочки не приводит к существенному разбавить буфера для лизиса.
- После центрифугирования завершена, тщательно удалить и выбросить мкл слой сверху 700. Этот слой содержит большинство остатков клеток, которые в противном случае мешать сортировки клеток.
- Добавьте 700 мкл свежей Gads к оставшейся клетки, содержащей раствор и пипеткойт.е вверх и вниз несколько раз перемешать.
- Центрифуга в течение 15 мин при 2,900 мкг для осаждения клеток.
- В то время как клетки находятся в центрифуге, смешать сортировку Gads (500 мкл на пробу) путем добавления 5 мкл ДНКазы (10 мг / мл) до Gads 1 мл.
- После центрифугирования будет сделано, тщательно удалить и уничтожить супернатант, оставляя осадок клеток.
- Повторное приостановить осадок клеток в 200 - 300 мкл сортировки шляется с помощью пипетки вверх и вниз с 1000 мкл пипетки равным 200 мкл в несколько раз. Поместите образцы на льду. Клетки теперь готовы быть отсортированы.
5. клеток с возбуждением флуоресценции (FAC) Сортировка
Примечание: Этот раздел требует оперативного знания сортировщика FACS или помощь квалифицированного персонала.
- Добавить 1 мкл иодида пропиди (PI) маточного раствора (50 мкг / мл) для каждого образца, чтобы проверить на жизнеспособность клеток. Разделить отрицательный контроль в 2-х трубок, одна с ПИ и без. PI связывается с ДНК только в мертвых клеток. Еслипосле первых родов нет мертвых клеток для мечения, использование PI не требуется.
- Транспортные клетки проточной цитометрии инструмента, например., BD FACS AriaII работает программное обеспечение Diva 8, на льду.
- Так как размер ячейки является переменной в этой популяции, используют большое сопло (100 мкм) для сортировки. Для того, чтобы уменьшить количество стресса опыта клеток и повышают жизнеспособность клеток используют низкое давление (20 фунтов на квадратный дюйм).
- С помощью программного обеспечения сортировщика FACS для настройки графиков анализа, рассеяния вперед, боковое рассеивание (SSC), Fast синий и PI, если это необходимо.
- Для того, чтобы повторно приостанавливать клетки, мягко вихрь образца на короткое время перед загрузкой в сортировщика.
- Начните с отрицательного контроля, нет Быстрый синий или PI, чтобы установить порог затвора (рис 2A). Это позволит определить количество автофлюоресценции в клеточной популяции. Необязательно: Запустите отрицательный образец с PI, чтобы определить, есть ли популяция мертвых клеток.
- Сортировать положительный контрольный образец (в т.ч.ubated с Fast синим), чтобы установить параметры компенсации.
- После того, как ворота и параметры установлены, начинают сортировка экспериментальных образцов. Образцы сортируются в подготовленные пробирки для сбора содержащих РНК буфер для лизиса.
- Хранить отсортированные образцы на льду до тех пор, сортировки клеток не будет завершена.
- Начало стадии экстракции РНК сразу после того, как клетки отсортированный.
6. Экстракция РНК
- Вихревые отсортированные клетки в буфере для лизиса в течение 1 мин для гомогенизации.
- Добавить 1 объем 70% этанола и смесь с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Трансфер до 700 мкл образца в ротационную колонку. Центрифуга в течение 15 сек при 8000 х г. Выбросьте проточные.
- Повторить, пока общий объем образца не пропускают через ротационную колонку.
- Добавьте 350 мкл буфера RW1 и продолжить процесс очистки РНК, в том числе и на стадии обработки ДНКазой, в соответствии с Protoco производителял для клеток.
- После того, как РНК были извлечены, проверки качества РНК с использованием микрожидкостных системы электрофореза в соответствии с техническими требованиями изготовителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот метод, дыхательные пути-иннервирующих нейроны помечены интраназально прививая Fast Blue (Рис . 1А) После двух дней, быстрая Синий меченые клетки появляются в нодозного ганглиев (рис 1C). Эти клетки составляют 3 - 5% от общего нейрональной популяции нодозного ганглиев. Другие ретроградных красители, которые были использованы для этой цели, включают в DII (1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат) и Fluorogold. облучение легких к Dii меток узловатый нейронов. Тем не менее, DiI занимает больше времени , чтобы достичь ганглий, 7 - 14 дней после закапывания 18,19, был использован , поэтому активно транспортируются краситель. Fluorogold является активно транспортируется краситель , который также используется для обозначения нейронов в дыхательных путях 14,20. По нашему опыту, однако, как только этот краситель достиг тела клетки в нодозного ганглии она была быстро подхвачена сателлитных клеток, а не нейроны (данные не показаны). БыстроСиний альтернативный активно транспортируется флуоресцентный краситель , который успешно и быстро, этикетки DRG у крыс 21 и дыхательные пути-иннервирующих нейронов узловатый 13,14. Быстрый Синий подход, таким образом, оказывается более надежным и воспроизводимым.
Рассечения нодозного ганглии было описано ранее 16 и его расположение кратко показано на фигуре 1В. Пищеварение начинается сразу же после того, как Узловые ганглиев были вырезаны. Для того, чтобы предотвратить нейроны от слипания друг с другом и позволяют более чистого вида, используйте нежное пищеварение фермент, очистить любой мусор и добавьте РНКазы в ганглиях сортировочного решения. Несколько ферментов смеси с пищеварением были протестированы на предмет эффективности. Мягкое смесь 22 переваривание фермента пытался, однако, для взрослых ганглии пищеварения он не был достаточно силен , чтобы распадаться клетки своевременно. В качестве альтернативы, которые ранее использовались 23 комбинации папаин, протеазыИ коллагеназы смесь ферментов, оказались слишком агрессивным и вызвал нежелательную клеточную гибель (данные не показаны). Изложенная протокол переваривание, с указанным ферментной смеси, было обнаружено, что идеальным для своевременного расщеплением жизнеспособности высокой клеток.
Предыдущие методы использовали ручной ячейки собирала со стеклянной пипеткой , чтобы отделить меченых клеток от немеченых клеток 24. Этот метод лучше всего подходит для одного анализа клеток небольшого числа клеток. Тем не менее, с максимальной скоростью 48 клеток / ч этот метод является нецелесообразным, когда необходимо собрать целые популяции сотен или тысяч клеток. Когда цель состоит в том, чтобы изолировать высокое качество РНК, время становится ключевой переменной. Важно, чтобы начать экстракции РНК как можно быстрее, чтобы предотвратить деградацию. FAC сортировка позволяет собирать всю меченого населения в ~ 45 мин и экстракции РНК начинается сразу же после.
O: Keep-together.within-страницу = "1"> При сортировке нейронов, важно, чтобы очистить как можно больше мусора из разрушенных нервных процессов. Градиент плотности был использован, чтобы очистить от мусора диссоциированных образцов. Важно , чтобы центрифугировать при достаточно высокой силы , чтобы гарантировать , что нейроны С-волокнах, которые имеют малый радиус, ~ 5 мкм 24, которые пропускают через градиент.
Рисунок 2А и В показывают положительные и отрицательные элементы управления , используемые для установки сортировочных ворот. Как видно на фиг.2С, Диссоциированный Быстрое Синий меченый узловатый клетки своего рода на две популяции. Число клеток , собранных из этого образца приведены на рис 2D. Сортировка эффективность этого метода составляет 73 - 85%. При сортировке нейронов рассеяния вперед и боковые разброс параметров не добавлял специфичность. Так как нейроны не имеют сферической формы эти параметры были неспособны надежно сообщать размер ячейки.
лор "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> Для получения урожая высокого качества РНК, клетки должны быть отсортированы непосредственно в буфер для лизиса и РНК должны быть извлечены сразу после сортировки микрожидком система электрофореза была использована для проверки. качество РНК (рисунок 3). пики 18S и 28S определяют с помощью гель - электрофореза , используемого для расчета количества целостности РНК (РИН). для РНК секвенирования образца РИН должно быть больше 7. Этот образец РНК теперь готов быть секвенировали ,
Рисунок 1. Быстрый Синий Маркировку Airway иннервирующих Нейроны в Узловые ганглиев блуждающего нерва. A) Представление Fast Синий интраназального закапывания в легкие. При легкой севофлурана анестезии, пипетки 40 мкл Fast синего в PBS с 1% ДМСО в ноздри мыши, убедившись, что мышь аспирационных в жидкости.
Рисунок 2. Флуоресцентный активированных клеток (FAC) Gates для сортировки Fast Синий положительных клеток. Для установки сортировки ворота используйте отрицательные (А) и положительный (B) управления , чтобы установить быстрый Синий положительное население. Отрицательный контроль (A) диссоциирует клетки DRG - йна не иннервируют легкие. Положительный контроль (В) диссоциирует DRG клетки, которые инкубируют с Fast синим в пробирке, после того, как они были рассечены. Из - за несферической формы диссоциированных нейронов, то рассеяния вперед и боковые разброс параметров не поможет определить популяцию клеток. C) представитель рода диссоциированы узловатый ганглий клеток мышей , чьи дыхательные пути были выставлены Fast синего цвета. D) подсчет клеток для (C). Было собрано более 1000 Fast Blue (FB) клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Оценка качества и РНК Назначение РНК Integrity Number (RIN) с использованием системы Микрожидкостных электрофорез. Использование избранныхСистема rophoresis качество РНК рассчитывается из пиков 18S и 28S на изображенном изображение геля. Нижний пик представляет деградированных РНК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод целевому дыхательные пути-иннервирующих нейроны в нодозного ганглии блуждающего нерва. После того, как меченый, ганглиях мягко диссоциированных оптимально сохранить количество клеток и жизнеспособность. Эти нейроны затем КВС сортируются непосредственно в буфере для лизиса и РНК экстрагируют. Значение этого протокола является способность к цели, изолировать и сохранить качество конкретной сенсорной популяции клеток. Экспрессия генов описано в этой небольшой популяции нейронов, и органные специфические функции и нейронные сети идентифицируются.
Критические шаги в этом протоколе, включают быстрое прогрессирование через процесс диссоциации и последующей сортировки клеток. Важно, чтобы планировать время сортировки таким образом, что она начинается сразу же после того, как диссоциации. Кроме того, важно, чтобы все реагенты экстракции РНК являются новыми, 70% и 80% растворы этанола сделаны свежие, и все трубы и оборудование для экстракции РНКчистые и РНКазы.
Этот протокол может быть модифицирован таким образом, что клетки сортируются по отдельности в луночные планшеты для одной экстракции клеточной РНК и последовательности. Он также может быть использован для выделения клеток из других сенсорных ганглиев, такие как спинальных ганглиях (КСГ). Краситель инъекции различных частей тела для отслеживания обратно к КСГ было описано ранее 17. Этот протокол также может быть модифицирован для сбора клеток для функционального анализа. Вместо того чтобы сортировать клетки в буфере для лизиса, клетки сортируются в нейронной культуральной среде, шляется. Эти клетки затем культивировали и использовали для функциональных исследований, таких как изображения кальция или электрофизиологических.
Если Fast Синий положительное население меньше, чем ожидаемый результат, приобретение нового пищеварения фермента. Возраст пищеварительную фермента коррелирует с эффективностью пищеварения. Переваривание фермент должен быть использован в течение 1 года после покупки. В случае, когда число клеток высока,РНК экстрагируют и качество испытания. Если РНК деградировали это признак того, что реагенты не свежие, или были загрязнены. В этом случае не забудьте тщательно очистить все области выделения РНК, пипеток, стойки, и все, что будет входить в контакт с образцом труб. Сделайте свежую РНКазы и ДНКазы 70% и 80% этанола. Вода и этанол используется, чтобы сделать эти решения также должны храниться отдельно от других лабораторных расходных материалов и используются исключительно для экстракции РНК.
FAC сортировка является быстрый и эффективный метод выделения Fast синего положительных клеток, однако, одно ограничение состоит в том, что плотность клеток должна быть от 1 до 2 млн клеток на мл буфера. Этот протокол толкает предел текущих моделей сотовых сортировщика. Число клеток в нодозного ганглии мала. Для того, чтобы получить выход клеток достаточно для клеточного сортировщика, клетки из пяти животных объединяют. Сортировочный объем описано 200 - 300 мкл и имеет менее 100000 взвешенном клеток. Tего приводит к концентрации около 450 000 клеток на мл, ниже рекомендуемой плотности. Одной из альтернатив с помощью клеточного сортера является тщательно подбирать с помощью флуоресцентного микроскопа и стеклянной пипеткой 24. Этот метод работает медленнее, и используется для сбора 30 - 100 клеток, в то время. Таким образом, этот протокол обеспечивает более быстрый метод высокой пропускной способностью по сравнению с существующими методами.
Будущие приложения этого протокола включают в себя возможность определить транскрипционный профиль специфической популяции дыхательные пути-иннервирующих нервов. РНК высокого качества собранные с использованием этого протокола может быть использован в качестве матрицы для синтеза кДНК и секвенирование следующего поколения, а также другие методы, чтобы охарактеризовать транскриптом собранных нейронов. Таким образом, можно определить, какие гены или пути являются специфическими для этих нейронов. Эта информация поможет выяснить функциональную роль играют эти нейроны в нормальных физиологических условиях. После того, как базоваяпаттерны экспрессии были установлены, система может быть оспорена физическими и химическими раздражителями или патогенными организмами, чтобы определить их влияние на регуляции генов в легких-иннервирующих нейронов. И, наконец, путем определения того, какие гены регулируются мы можем определить новые фармакологические мишени и начинают исследовать эффекты терапии мешать острые и хронические изменения функции нерва при заболеваниях дыхательных путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
При поддержке NIH грант R01HL105635 к SEJ. Авторы хотели бы поблагодарить Диего В. Бохоркез за технической консультацией. Мы также благодарим Р. Ян Камминг за техническую помощь и выполнение проточной цитометрии на Duke человеческих вакцин Научно-исследовательский институт проточной цитометрии совместно используемых ресурсов фонда (Durham, NC). Проточной цитометрии проводили в биоизоляции лаборатории регионального Дюка, который получил частичную поддержку строительства от Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
