Abstract
nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces neurones afférents se trouvent à l'intérieur des ganglions sensoriels. ganglions sensoriels innervent un organe ou une partie spécifique du corps. Par exemple, les ganglions rachidiens (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d'étendre les processus à travers le corps et les membres. Le ganglion de Gasser sont situés dans le crâne et innervent la face, et des voies respiratoires supérieures. afférences vagales des ganglions noueux prolongent tout au long de l'intestin, le cœur et les poumons. Les neurones noueux contrôlent un large éventail de fonctions telles que: la fréquence respiratoire, irritation des voies respiratoires, et les réflexes de toux. Ainsi, de comprendre et de manipuler leur fonction, il est essentiel d'identifier et d'isoler des sous-populations neuronales spécifiques des voies respiratoires. Chez la souris, les voies respiratoires sont exposés à un colorant traceur fluorescent, bleu rapide, pour le traçage rétrograde spécifique des voies aériennes noueux neurones. Les ganglions noueux sont dissociés et cellules activées par fluorescence (FAC) tri est utilisé pour recueillir des cellules positives de colorant. Ensuite, l'acide ribonucléique de haute qualité (ARN) est extrait à partir des cellules positives de colorants pour le séquençage de la prochaine génération. En utilisant cette méthode intubation expression spécifique du gène neuronal est déterminé.
Introduction
nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces nerfs afférents sont situés dans les ganglions sensoriels, comme la racine dorsale, du trijumeau ou des ganglions noueux. Chaque ganglions sensitifs innerve régions spécifiques du corps et contient des cellules qui innervent les organes et tissus séparés dans cette région. Par exemple, les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d' étendre les processus à travers le corps et les membres, tandis que les ganglions trigéminés sont situés dans le crâne, contenant les neurones qui innervent le visage, les yeux, des méninges ou des voies aériennes supérieures 1, 2. Les ganglions noueux du nerf pneumogastrique est situé dans le col au- dessous du crâne et qui contient des corps cellulaires qui prolongent les fibres nerveuses dans tout le tractus gastro - intestinal, le cœur et les poumons et les voies respiratoires inférieures 3. Chez l'homme, ganglion noueux est seule, cependant, chez la souris, il est fusionnéavec le ganglion jugulaires, qui innerve aussi les poumons 4. Ce ganglion fusionné est souvent appelée la jugulaire / noueux complexe, ganglion vagal, ou simplement ganglion noueux 5. Ici, elle est désignée sous le ganglion noueux.
afférences du noueux transmettent des informations à partir des viscères vers le noyau du tractus solitaire (NTS) dans le tronc cérébral. Entrée sensorielle à ce ganglion unique contrôle un large éventail de fonctions, telles que la motilité intestinale 6, la fréquence cardiaque 7, respiration 8,9, et les réponses respiratoires irritantes activées 10,11. Avec cette diversité de fonctions et organes innervés, il est essentiel de cibler et d'isoler des sous-populations spécifiques d'organes du ganglion noueux afin d'étudier les voies neuronales individuelles. Toutefois, étant donné la petite taille de l'noueux et le nombre limité de neurones qu'il contient ce n'est pas une tâche triviale. Chaque souris noueux ganglion contient environ 5000 neurones 12en plus d'une population étendue de cellules de soutien du satellite. Sur les 5.000 neurones noueux, seulement 3-5% innervent les voies respiratoires. Par conséquent, les modifications fonctionnelles, morphologiques ou moléculaires dans les neurones des voies aériennes innervant, en raison de la stimulation ou pathologies respiratoires, seront perdus dans le ganglion noueux dense.
Pour résoudre ce problème, un procédé a été développé pour identifier et isoler les neurones qui innervent les voies respiratoires. Les voies respiratoires ont été exposés à un colorant traceur fluorescent pour identifier les neurones innervant de noueux ultérieures. Fast Blue a été repris par les neurones et se déplace rapidement à leurs corps cellulaires où elle est conservée pendant jusqu'à huit semaines 13 - 15. Une fois identifié, un protocole de dissociation douce mais efficace a été utilisée pour préserver l'étiquetage de colorant et la viabilité des cellules pour les cellules activées par fluorescence (FAC) de tri. Les cellules triées sont utilisées pour extraire l'acide ribonucléique de haute qualité (ARN) afin de déterminer l'expression du gène ou de fou une autre analyse moléculaire en aval. Ce protocole fournit une technique utile et robuste pour isoler les neurones sensoriels qui innervent un tissu d'intérêt.
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Protocol
Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université Duke.
1. intranasale administration de Fast Blue
Pour Fast Blue, administrer le colorant au moins 2 jours avant euthanasier la souris. Le colorant va persister pendant un maximum de huit semaines.
- Anesthetize la souris avec l'anesthésie par inhalation de lumière (2,5% de sévoflurane) jusqu'à ce que la respiration commence à ralentir.
- Utiliser une pipette de 200 pi avec des conseils filtrés pour instiller lentement 40 pl de solution de colorant (0,4 mM bleu rapide, 1% de diméthylsulfoxyde, salins DMSO, dans un tampon phosphate, PBS) dans la narine, une pause de temps en temps pour assurer la souris est aspiration de la solution (figure 1A).
- Maintenez la souris verticale, la tête, et masser doucement la poitrine pour assurer le colorant se répand dans les poumons.
2. Préparatifs sur Dissection et Day Analyse
- Préparer 10 ml0; Ganglions Dissociation Solution (GAD) en combinant les ingrédients comme indiqué dans le tableau 1.
- Effectuer l'extraction d'ARN dans une zone de laboratoire dédiée. Avant de commencer l'expérience, des surfaces propres avec 70% d'éthanol, 10% l'eau de Javel, et RNase réactif de décontamination. Cela comprend la centrifugeuse d'ARN, des supports pour tubes et pipettes. Assurez-vous qu'il ya des boîtes de pointe de filtre dédiés à l'utilisation d'ARN seulement. Ne pas utiliser cet équipement et la zone de préparation de l'ADN, car cela va contaminer les échantillons.
- Mélanger frais 70%, et 80% d'éthanol avec de l'eau sans RNase. Préparer 1 ml par échantillon à utiliser dans l'extraction de l'ARN.
| Ingrédient | Montant |
| Avancée DMEM / f12 | 9,5 ml |
| glutamine | 100 ul |
| HEPES (10 mM) | 100 ul |
| supplément N2 | 100 ul |
| B27 (pas de vitamine A) | 200 ul |
| NGF (50 ng / ml) | 10 ul |
Tableau 1. Réactif Mélange pour Ganglions Dissociation Solution (GAD).
3. Procédure Dissection
- Remplir tubes de 1,5 ml avec 500 ul GADS, un pour chaque échantillon expérimental, un pour un contrôle de tri positif, et un pour un contrôle de tri négatif. tubes de magasins sur la glace tout au long de la dissection.
- Disséquer le ganglion noueux et faire deux coupes partielles pour faciliter la dissociation, puis le mettre dans le tube d'échantillon expérimental. S'il vous plaît se référer au protocole JoVE suivante pour la dissection des ganglions noueux 16 et DRG 17.
- Disséquer et partiellement coupé ganglion non marqué, comme les ganglions de la racine dorsale (DRG), pour les contrôles de tri. Utilisez deux noyaux pour le contrôle positif et deux Gangliun pour le contrôle négatif.
- Pour obtenir des neurones noueux assez pour le tri réussi, combiner ganglion de 5 souris dans un seul tube échantillon expérimental contenant GADS.
4. Sensory Ganglions Dissociation
- Pipeter sur 500 GADS ul, laissant ganglion dans le tube. Laver une fois ganglion en ajoutant 1 ml de PBS, attendez ganglion à déposer au fond du tube, puis pipetez sur PBS.
- Ajouter 1 ml Gads et 22 ul de digestion enzymatique (collagénase I / II et de protéase du mélange, 2,5 mg / ml dans H 2 O) dans chaque tube.
- Ajouter 20 ul bleu rapide (5,26 mM) au tube de contrôle positif.
- Mettre les tubes dans un bloc de bain d'eau ou de chauffage déjà réglé à 37 ° C.
Remarque: Le temps de digestion ganglion dépend de l'âge de l'enzyme de digestion. Moins de 1 mois de dissoudre l'enzyme de digestion, la digestion pendant 30 minutes, à l'intérieur de 2 - 6 mois à digérer pendant 45 minutes. Si l'enzyme est âgé de plus de six mois, digérer ganglion fou 60 min. - Chaque 15 min tubes agités brièvement et flick eux pour assurer ganglion sont couverts par la solution.
- Alors que les ganglions sont digérées, de préparer des gradients de densité en utilisant une solution de particules (particules de silice colloïdale enrobées avec de la polyvinylpyrrolidone).
- Mélanger la solution de 12% de particules dans GADS, 500 ul par échantillon.
- Mélanger la solution de 28% de particules dans GADS, 500 ul par échantillon.
- Lentement et soigneusement ajouter 400 ul solution de densité de 12% au-dessus de la solution de densité de 400 ul de 28% dans un tube de 1,5 ml frais pour chaque échantillon. Ne pas laisser les deux couches de se mélanger. Deux couches distinctes doivent être visibles dans le tube; une plus foncé que l'autre.
- Alors que les ganglions sont digérés, étiqueter les nouveaux tubes de 1,5 ml de collecte pour le tri (un bleu positif et un tube bleu rapide rapide négative par échantillon de tri). Selon les exigences de l'installation de tri, ces tubes doivent avoir des couvercles amovibles afin de ne pas interférere avec le trieur de cellules.
- Après le temps de la digestion appropriée, enlever GADS avec digestion enzymatique et laver deux fois avec ganglion 1 ml de PBS. Ajouter 200 pi de GADS frais à chaque tube.
- Utiliser une pipette de 200 pi, réglé sur un volume de 100 pi, et la pipette ganglion monter et descendre plusieurs fois pour séparer les cellules. Répétez jusqu'à ce qu'aucun morceau de tissu intact est vu. Évitez de créer des bulles dans la solution.
- Passez cellules dissociées à travers une cellule crépine de 70 um.
- Ajouter un autre 100 GADS pi au tube d'origine de dissociation pour ramasser toutes les cellules restantes errants gauche et passer la solution supplémentaire à travers le tamis de la cellule. L'utilisation d'un nouvel embout de pipette, recueillir tout liquide contenant des cellules restantes qui a passé à travers le tamis et accroché à la maille. Le volume final de cellules en suspension dans GADS est de 300 pi.
- superposer soigneusement les 300 pi de cellules sur le dessus du gradient de densité préalablement réalisé. Éviter les bulles et le mélange de caunes avec les couches de densité.
- Centrifuger pendant 10 min à 2900 xg à la température ambiante.
- Alors que les cellules sont dans la centrifugeuse, mélanger le tampon de lyse (1 ml par échantillon expérimental) comme suit: 10 pi de 2-mercaptoéthanol dans 1 ml de tampon RLT (de la trousse d'extraction d'ARN).
- Ajouter 300 pi de tampon de lyse rapide au tube de collecte positif bleu et 600 pi à tube de Fast Blue négative de collection (tubes marqués à l'étape 4.7). Ce volume dépend du nombre de cellules qui devraient être collectées. Pour <2.000 cellules, ajouter 300 pi pour> 7000 cellules ajouter 600 pi. Cela permettra d'assurer le fluide gainant le tri ne dilue pas de manière significative le tampon de lyse.
- Une fois la centrifugation est terminée, retirez soigneusement et jeter la couche ul top 700. Cette couche contient la majorité des débris cellulaires qui, autrement, interférer avec le tri cellulaire.
- Ajouter 700 ul GADS frais à la cellule restante contenant la solution et pipetteste monter et descendre plusieurs fois pour mélanger.
- Centrifuger pendant 15 min à 2900 xg pour sédimenter les cellules.
- Alors que les cellules sont dans la centrifugeuse, mélangez le tri GADS (500 pi par échantillon) en ajoutant 5 pi DNase (10 mg / ml) à 1 ml GADS.
- Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement et éliminer le surnageant, en laissant le culot cellulaire.
- Re-suspendre culot cellulaire dans 200 - 300 pi de tri GADS par pipetage de haut en bas avec une pipette de 1000 pi réglé à 200 pi plusieurs fois. Mettre les échantillons sur la glace. Les cellules sont maintenant prêts à être triés.
5. Fluorescence cellulaire activé (FAC) Tri
Remarque: Cette section nécessite une connaissance opérationnelle d'un trieur FACS ou l'assistance d'un personnel qualifié.
- Ajouter 1 ul d'iodure de propidium (PI) solution mère (50 pg / ml) à chaque échantillon pour tester la viabilité des cellules. Divisez contrôle négatif en 2 tubes, une avec PI et l'autre sans. PI lie à l'ADN seulement dans les cellules mortes. Siaprès quelques sortes, il n'y a pas de cellules mortes à étiqueter, l'utilisation de PI est pas nécessaire.
- Cellules de transport à la cytométrie de flux instrument, par exemple., BD FACS AriaII exécutant le logiciel Diva 8, sur la glace.
- Étant donné que la taille des cellules est variable dans cette population, utiliser une grande buse (100 um) pour le tri. Pour diminuer la quantité de stress l'expérience des cellules et augmenter la viabilité cellulaire utiliser une faible pression (20 psi).
- Utilisez le logiciel trieur FACS pour mettre en place les parcelles d'analyse, de dispersion vers l'avant, diffusion latérale (SSC), bleu rapide, et PI, si nécessaire.
- Pour les cellules re-suspendre, vortex doucement brièvement l'échantillon avant de le charger dans la trieuse.
- Commencez par le contrôle négatif, aucun Fast Blue ou PI, de fixer le seuil de la porte (figure 2A). Cela permettra de déterminer la quantité d'autofluorescence dans la population cellulaire. Facultatif: Exécutez l'échantillon négatif avec PI pour déterminer s'il y a une population de cellules mortes.
- Trier l'échantillon de contrôle positif (incubated avec Blue rapide), pour définir les paramètres de compensation.
- Une fois que les portes et les paramètres sont définis, commencer à trier les échantillons expérimentaux. Les échantillons sont classés dans les tubes de collecte d'ARN préparés contenant un tampon de lyse.
- Conserver les échantillons triés sur la glace jusqu'à ce que le tri cellulaire est terminée.
- Commencer l'étape d'extraction d'ARN immédiatement après que les cellules sont triées.
6. Extraction de l'ARN
- Vortex cellules triées dans un tampon de lyse pendant 1 min à homogénéisent.
- Ajouter 1 volume de 70% d'éthanol et mélange par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
- Transférer jusqu'à 700 ul de l'échantillon à une colonne de centrifugation. Centrifugeuse pendant 15 secondes à 8000 x g. Jeter l'écoulement.
- Répéter jusqu'à ce que le volume total de l'échantillon est passé à travers la colonne.
- Ajouter 350 pi de tampon RW1 et poursuivre le processus de purification de l'ARN, comprenant l'étape de traitement par la DNase, selon le protoco du fabricantl pour les cellules.
- Une fois que l'ARN a été extrait, de tester la qualité de l'ARN en utilisant un système d'électrophorèse microfluidique selon les spécifications du fabricant.
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Representative Results
En utilisant cette méthode, les neurones des voies aériennes innervant sont marquées par voie intranasale instillant Fast Blue (figure 1A). Au bout de deux jours, les cellules marquées bleu rapide apparaissent dans les ganglions noueux (figure 1C). Ces cellules représentent 3 à 5% de la population neuronale totale des ganglions noueux. D'autres colorants rétrogrades qui ont été utilisés à cet effet comprennent Dil (1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3' perchlorate tetramethylindocarbocyanine) et Fluorogold. l'exposition pulmonaire aux étiquettes DiI noueux neurones. Cependant, Dil prend plus de temps pour atteindre le ganglion, 7 - 14 jours après l' instillation 18,19 donc un colorant transporté activement a été utilisé. Fluorogold est un colorant transporté activement qui a également été utilisé pour marquer les neurones des voies respiratoires 14,20. Dans notre expérience, cependant, une fois ce colorant atteint les corps cellulaires dans le ganglion noueux, il a été rapidement repris par les cellules satellites et non neurones (données non présentées). ViteLe bleu est un autre transporté activement colorant fluorescent qui avec succès, et rapidement, les étiquettes DRG chez les rats 21 et les neurones noueux voies respiratoires-innervant 13,14. L'approche Fast Blue, apparaît donc plus robuste et reproductible.
La dissection du ganglion noueux a été décrit précédemment 16 et son emplacement est brièvement illustré sur la figure 1B. Digestion commence immédiatement après les ganglions noueux ont été excisées. Pour empêcher les neurones de agglomérer et de permettre une sorte de nettoyage, utiliser une enzyme de digestion douce, effacer tous les débris et ajoutez RNase aux ganglions solution de tri. Plusieurs mélanges d'enzymes de digestion ont été testés pour l'efficacité. Une digestion enzymatique mélange doux 22 a été jugé, cependant, pour adultes digestion ganglionnaires il n'a pas été assez forte pour briser les cellules en temps opportun. En variante, un utilisé précédemment 23 combinaison de la papaïne, protéaseEt avec un mélange enzymatique de collagénase, se sont avérés trop agressifs et ont causé la mort des cellules indésirables (données non présentées). Le protocole de digestion décrit, avec le mélange enzymatique spécifiée, a été jugée idéale pour la digestion en temps utile avec la viabilité cellulaire élevée.
Des procédés antérieurs ont utilisé des cellules avec la cueillette manuelle d' une pipette en verre pour séparer les cellules marquées des cellules non marquées 24. Cette technique est mieux adaptée à l'analyse d'une cellule unique d'un petit nombre de cellules. Toutefois, avec un taux maximal de 48 cellules / h cette technique est peu pratique lorsque des populations entières de centaines ou de milliers de cellules doivent être collectées. Lorsque l'objectif est d'isoler l'ARN de haute qualité, le temps devient une variable clé. Il est important de commencer l'extraction de l'ARN aussi rapidement que possible pour éviter la dégradation. FAC tri permet de collecter l'ensemble de la population marquée en ~ 45 min, et l'extraction de l'ARN commence immédiatement après.
o: keep-together.within-page = "1"> Lors du tri des neurones, il est important de dégager autant de débris de processus neuronaux brisés. Un gradient de densité a été utilisée pour éliminer les débris des échantillons dissociées. Il est important de centrifuger à une force suffisamment élevée pour faire en sorte que les neurones C-fibres, qui ont un petit rayon, ~ 5 um 24, sont forcés à travers le gradient.
Figure 2A et B montrent les contrôles positifs et négatifs utilisés pour définir les grilles de tri. Comme on peut le voir sur la figure 2C, le Fast Blue dissociées marqué les cellules noueux tri en deux populations. Les nombres de cellules recueillies à partir de cet échantillon sont indiqués sur la figure 2D. Tri efficacité de cette méthode est 73-85%. Lors du tri des neurones les paramètres de diffusion et de dispersion latérale vers l'avant n'ajouter une spécificité. Etant donné que les neurones ne sont pas sphériques ces paramètres ont été incapables de présenter de manière fiable la taille des cellules.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Pour un rendement d'ARN de haute qualité, les cellules doivent être triés directement dans le tampon de lyse et de l'ARN doit être extrait immédiatement après le tri Un système d'électrophorèse microfluidique a été utilisé pour tester la. la qualité de l' ARN (figure 3). les 18S et 28S des pics sont déterminées par électrophorèse sur gel utilisé pour calculer un indice d'intégrité de l' ARN (RIN). pour l' ARN séquençage de l'échantillon RIN doit être supérieur à 7. l'échantillon d'ARN est maintenant prêt à être séquencée .
Figure 1. Fast Blue Étiquetage des Airway innervant Neurones dans le noueux Ganglions du nerf vague. A) Une représentation de Fast Blue instillation intranasale dans les poumons. Sous anesthésie sévoflurane lumière, pipette 40 pl de bleu rapide dans du PBS avec 1% de DMSO dans les narines d'une souris, en faisant que la souris est ASPIRATION dans le fluide.
Figure 2. Fluorescence cellulaire activé (FAC) Tri Gates rapides cellules bleues positives. Pour mettre en place le tri des portes utilisent la borne négative (A) et positive (B) contrôle pour établir la population positif Bleu rapide. Le contrôle négatif (A) est dissocié des cellules DRG eà ne pas innerver les poumons. Le témoin positif (B) , on dissocie les cellules de DRG qui sont mises en incubation avec du bleu rapide in vitro, une fois qu'ils ont été disséqués. En raison de la forme non sphérique des neurones dissociés, les paramètres de diffusion et de dispersion latérale vers l' avant ne seront pas aider à définir la population de cellules. C) Un tri représentatif de dissociées noueux cellules ganglionnaires de souris dont les voies respiratoires ont été exposés à Fast Blue. D) pour la numération des cellules (C). Plus de 1000 cellules rapides Bleu (FB) ont été recueillies. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Évaluation de l' ARN de la qualité et cession de l' ARN Integrity Number (RIN) Utilisation d' un système microfluidique Electrophoresis. Utilisation d' un éluSystème de rophoresis la qualité de l'ARN est calculée à partir des pics 18S et 28S sur l'image de gel illustré. Le pic inférieur représente l' ARN dégradé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit un procédé pour cibler des neurones innervant des voies aériennes dans les ganglions noueux du nerf vague. Une fois marqué, les ganglions sont doucement dissociés pour préserver de manière optimale le nombre de cellules et la viabilité. Ces neurones sont ensuite triés FAC directement dans le tampon de lyse et l'ARN est extrait. L'importance de ce protocole est la capacité de cibler, d'isoler et de préserver la qualité d'une population spécifique de cellules sensorielles. L'expression des gènes est décrite dans cette petite population de neurones, et les fonctions spécifiques d'organes et les réseaux de neurones sont identifiés.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent la progression rapide à travers le processus de dissociation et de tri cellulaire ultérieure. Il est important de programmer l'heure de triage de telle sorte qu'elle commence immédiatement après la dissociation. Il est également essentiel que tous les réactifs d'extraction d'ARN sont frais, les solutions d'éthanol à 70% et 80% sont frais, et tous les tubes et équipement pour l'extraction de l'ARNsont propres et RNase.
Ce protocole peut être modifié de telle sorte que les cellules sont triées individuellement dans des plaques à puits pour l'extraction de l'ARN cellulaire unique et le séquençage. Il peut également être utilisé pour isoler des cellules provenant d'autres ganglions sensoriels, tels que les ganglions de la racine dorsale (DRG). Injection de colorant de différentes parties du corps pour remonter à DRG a été décrit précédemment 17. Ce protocole peut également être modifié pour collecter des cellules pour une analyse fonctionnelle. Au lieu de classer les cellules dans un tampon de lyse, les cellules sont triées dans un milieu de culture neuronale, Gads. Ces cellules sont ensuite cultivées et utilisées pour des études fonctionnelles telles que l'imagerie de calcium ou l'électrophysiologie.
Si la population positif Fast Blue est plus petit que le résultat escompté, l'achat d'une nouvelle enzyme de digestion. L'âge de l'enzyme de digestion est corrélée à l'efficacité de la digestion. L'enzyme de digestion doit être utilisé dans les 1 an d'achat. Dans le cas où le nombre de cellules est élevé,L'ARN est extrait et la qualité de l'essai. Si l'ARN est dégradé ceci est une indication que les réactifs ne sont pas frais, ou ont été contaminés. Dans ce cas, assurez-vous de bien nettoyer toutes les zones d'extraction d'ARN, pipettes, racks, et tout ce qui va entrer en contact avec les tubes d'échantillons. Faire RNase fraîche et DNase 70% et 80% d'éthanol. L'eau et l'éthanol utilisé pour fabriquer ces solutions doivent également être séparés des autres fournitures de laboratoire et utilisés uniquement pour l'extraction de l'ARN.
FAC tri est une méthode rapide et efficace pour isoler des cellules positives Fast Blue, toutefois, une limitation est que la densité cellulaire doit être de 1 à 2 millions de cellules par ml du tampon. Ce protocole repousse les limites des modèles de trieuse de cellules actuelles. Le nombre de cellules dans le ganglion noueux est faible. Pour obtenir un rendement cellulaire suffisante pour le tri de cellules, des cellules provenant de cinq animaux sont mis en commun. Le volume de tri décrit est de 200 - 300 pi et a moins de 100.000 cellules en suspension. Tses translatées à une concentration d'environ 450.000 cellules par ml, en dessous de la densité recommandée. Une alternative à l' aide d' un trieur de cellules est cueillir à la main avec un microscope à fluorescence et le verre 24 pipette. Cette technique est plus lente et a été utilisé pour recueillir 30 - 100 cellules à la fois. Par conséquent, ce protocole offre une méthode à haut débit plus rapide par rapport aux méthodes existantes.
Les futures applications de ce protocole comprennent la capacité de déterminer le profil transcriptionnel d'une population spécifique des nerfs innervant des voies aériennes. L'ARN de haute qualité ont été recueillies en utilisant ce protocole peut être utilisé comme matrice pour la synthèse d'ADNc et séquençage de la prochaine génération, et d'autres techniques pour caractériser le transcriptome des neurones collectés. De cette manière, on peut déterminer quels sont les gènes ou de voies sont spécifiques à ces neurones. Cette information vous aidera à élucider le rôle fonctionnel de ces neurones jouent dans des conditions physiologiques normales. Une fois de baseprofils d'expression ont été mis en place, le système peut être contestée par des stimuli physiques et chimiques ou par des agents pathogènes afin de déterminer leurs effets sur la régulation des gènes dans les neurones du poumon innervant. Enfin, en identifiant les gènes sont régulés, nous pouvons identifier de nouvelles cibles pharmacologiques et de commencer à étudier les effets de la thérapeutique à interférer avec les changements aigus et chroniques de la fonction nerveuse dans les maladies des voies respiratoires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Soutenu par des subventions du NIH R01HL105635 à SEJ. Les auteurs tiennent à remercier Diego V. Bohórquez pour des conseils techniques. Nous remercions également R. Ian Cumming pour l'assistance technique et en effectuant la cytométrie en flux à l'installation de vaccin humain Duke Institut de recherche de cytométrie en flux de ressources partagées (Durham, Caroline du Nord). La cytométrie en flux a été réalisée dans le laboratoire de bioconfinement régional à Duke, qui a reçu un soutien partiel pour la construction des Instituts nationaux de la santé, Institut national des allergies et des maladies infectieuses (UC6-AI058607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
