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Neuroscience

एक विधि को लक्षित और चूहे में अलग-श्वासनली innervating संवेदी न्यूरॉन्स के लिए

Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53917
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

Abstract

Somatosensory नसों थर्मल, यांत्रिक, रासायनिक, और दोनों अंतर्जात और पर्यावरण एजेंटों की वजह से हानिकारक उत्तेजनाओं transduce। इन अभिवाही न्यूरॉन्स की सेल निकायों संवेदी गैन्ग्लिया के भीतर स्थित हैं। संवेदी गैन्ग्लिया एक विशिष्ट अंग या शरीर के हिस्से को अंदर आना। उदाहरण के लिए, पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) कशेरुका स्तंभ में स्थित है और शरीर और अंगों भर प्रक्रियाओं का विस्तार कर रहे हैं। त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया ऊपरी वायुमार्ग खोपड़ी में स्थित है और चेहरे अंदर आना रहे हैं, और। ग्रंथिल गैन्ग्लिया के vagal afferents भर पेट, हृदय और फेफड़ों का विस्तार। श्वसन दर, एयरवे जलन, खांसी और सजगता: ग्रंथिल न्यूरॉन्स जैसे कार्यों की एक विविध सरणी नियंत्रित करते हैं। इस प्रकार, समझने और उनके समारोह में हेरफेर करने के लिए है, यह पहचान करने और एयरवे विशिष्ट neuronal उप आबादी को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। माउस में, वायुमार्ग एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर डाई, फास्ट ब्लू, एयरवे विशेष ग्रंथिल न्यूरॉन के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए सामने आ रहे हैंएस। ग्रंथिल गैन्ग्लिया अलग कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (एफएसी) छँटाई डाई सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अगले, उच्च गुणवत्ता ribonucleic एसिड (आरएनए) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए डाई सकारात्मक कोशिकाओं से निकाला जाता है। इस विधि एयरवे विशिष्ट neuronal जीन अभिव्यक्ति निर्धारित किया जाता है का उपयोग करना।

Introduction

Somatosensory नसों थर्मल, यांत्रिक, रासायनिक, और दोनों अंतर्जात और पर्यावरण एजेंटों की वजह से हानिकारक उत्तेजनाओं transduce। इन अभिवाही नसों की सेल निकायों ऐसे पृष्ठीय रूट, त्रिपृष्ठी, या ग्रंथिल गैन्ग्लिया के रूप में, संवेदी गैन्ग्लिया में स्थित हैं। प्रत्येक संवेदी नाड़ीग्रन्थि शरीर के विशिष्ट क्षेत्रों innervates और कोशिकाओं है कि उस क्षेत्र के भीतर अलग अंगों और ऊतकों अंदर आना होता है। उदाहरण के लिए, पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) कशेरुका स्तंभ में स्थित है और शरीर और अंगों भर प्रक्रियाओं का विस्तार, जबकि त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया खोपड़ी में स्थित हैं, न्यूरॉन्स कि चेहरे, आंखों, तानिका या ऊपरी एयरवेज 1 अंदर आना युक्त हैं, 2। वेगस तंत्रिका की ग्रंथिल गैन्ग्लिया खोपड़ी के नीचे गर्दन में कम एयरवेज और फेफड़ों 3 स्थित है और सेल निकायों कि जठरांत्र संबंधी मार्ग, दिल भर तंत्रिका तंतुओं का विस्तार शामिल है, और। मनुष्यों में ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि अकेला खड़ा है, तथापि, माउस में यह जुड़े हुए हैकंठ नाड़ीग्रन्थि है, जो भी फेफड़ों 4 innervates के साथ। यह आपस में जुड़े नाड़ीग्रन्थि अक्सर कंठ / ग्रंथिल जटिल, vagal नाड़ीग्रन्थि कहा जाता है, या बस ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि 5। यहाँ, यह ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि के रूप में जाना जाता है।

ग्रंथिल की अभिवाही फाइबर brainstem में एकान्त पथ (एनटीएस) के नाभिक को आंत से जानकारी गुजरती हैं। इस अनूठी नाड़ीग्रन्थि संवेदी इनपुट ऐसे आंत गतिशीलता 6, हृदय की दर 7, श्वसन 8,9, और अड़चन सक्रिय सांस की प्रतिक्रियाएं 10,11 के रूप में काम करता है, की एक विविध सरणी नियंत्रित करता है। कार्यों और इन्नेर्वतेद अंगों की इस विविधता के साथ, यह लक्ष्य और व्यक्तिगत न्यूरोनल रास्ते का अध्ययन करने के क्रम में ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि के अंग विशेष उप-जनसंख्या को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, ग्रंथिल के छोटे आकार और न्यूरॉन्स की सीमित संख्या के बाद उसमें यह एक तुच्छ काम नहीं है को देखते हुए। नाड़ीग्रन्थि ग्रंथिल प्रत्येक माउस लगभग 5000 न्यूरॉन्स 12 में शामिलउपग्रह कोशिकाओं का समर्थन करने का एक व्यापक आबादी के अलावा। 5% अंदर आना एयरवेज - 5000 ग्रंथिल न्यूरॉन्स, केवल 3 की। इसलिए, एयरवे-innervating न्यूरॉन्स के भीतर किसी भी, कार्यात्मक रूपात्मक या आणविक परिवर्तन, सांस की उत्तेजना या विकृतियों के कारण, घनी पैक ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि में खो जाएगा।

इस समस्या को हल करने के लिए, एक विधि की पहचान करने और न्यूरॉन्स कि वायुमार्ग अंदर आना अलग करने के लिए विकसित किया गया था। वायुमार्ग एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर डाई से अवगत कराया गया बाद में innervating ग्रंथिल न्यूरॉन्स की पहचान। फास्ट ब्लू न्यूरॉन्स द्वारा उठाया और उनके सेल निकायों जहां यह अप करने के लिए आठ सप्ताह 13 के लिए बनाए रखा है के लिए जल्दी से यात्रा कर रहा था - 15। एक बार की पहचान, एक सज्जन, अभी तक कुशल, हदबंदी प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल (एफएसी) छंटाई के लिए डाई लेबलिंग और सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हल कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति या एफ निर्धारित करने के लिए उच्च गुणवत्ता ribonucleic एसिड (आरएनए) निकालने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंया अन्य बहाव आणविक विश्लेषण। इस प्रोटोकॉल संवेदी न्यूरॉन्स कि ब्याज की एक ऊतक अंदर आना अलग-थलग करने के लिए एक उपयोगी और मजबूत तकनीक प्रदान करता है।

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Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ड्यूक विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. तेजी से ब्लू के Intranasal प्रशासन

फास्ट ब्लू के लिए, कम से कम 2 दिनों माउस euthanizing से पहले डाई प्रशासन। डाई आठ सप्ताह के लिए जारी रहती है।

  1. धीमी गति से शुरू होता है जब तक साँस लेने में प्रकाश साँस लेना संज्ञाहरण (2.5% sevoflurane) के साथ माउस anesthetize।
  2. फ़िल्टर सुझावों के साथ एक 200 μl पिपेट का उपयोग धीरे-धीरे नथुने में (1% डाइमिथाइल sulfoxide, DMSO, फॉस्फेट में खारा बफर, पीबीएस 0.4 मिमी तेजी से नीला) डाई समाधान के 40 μl टपकाना करने के लिए, कभी कभी रोक माउस सुनिश्चित करने के लिए समाधान aspirating है (चित्रा 1 ए)।
  3. खड़ी माउस पकड़, सिर, छाती और धीरे मालिश सुनिश्चित करने के लिए डाई फेफड़ों भर में फैलता है।

2. विच्छेदन और विश्लेषण दिवस पर तैयारी

  1. 10 मिलीलीटर की तैयारी0; गैन्ग्लिया हदबंदी समाधान (GADS) तालिका 1 में निर्दिष्ट के रूप में सामग्री के संयोजन द्वारा।
  2. एक समर्पित प्रयोगशाला क्षेत्र में शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शन। प्रयोग, 70% इथेनॉल, 10% ब्लीच, और RNase परिशोधन अभिकर्मक के साथ साफ सतहों शुरू करने से पहले। यह आरएनए सेंट्रीफ्यूज, किसी भी ट्यूब रैक, और pipettes भी शामिल है। सुनिश्चित करें आरएनए उपयोग के लिए ही समर्पित फिल्टर टिप बक्से देखते हैं। डीएनए तैयार करने के लिए इस उपकरण और क्षेत्र का उपयोग न करें, क्योंकि यह नमूने दूषित होगा।
  3. RNase मुक्त पानी के साथ मिक्स ताजा 70%, और 80% इथेनॉल। तैयार नमूना प्रति 1 मिलीलीटर आरएनए निष्कर्षण में इस्तेमाल किया जाएगा।
घटक रकम
उन्नत DMEM / F12 9.5 मिलीलीटर
glutamine 100 μl
HEPES (10 मिमी) 100 μl
एन 2 के पूरक 100 μl
B27 (कोई विटामिन ए) 200 μl
NGF (50 माइक्रोग्राम / एमएल) 10 μl

तालिका 1 गैन्ग्लिया हदबंदी समाधान (GADS) के लिए अभिकर्मक मिश्रण।

3. विच्छेदन प्रक्रिया

  1. साथ 500 μl GADS, प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना के लिए एक, एक सकारात्मक छँटाई नियंत्रण के लिए एक, और एक नकारात्मक छँटाई नियंत्रण के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों भरें। विच्छेदन के दौरान बर्फ पर स्टोर ट्यूबों।
  2. ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि काटना और हदबंदी की सुविधा के लिए दो आंशिक कटौती करने के लिए, तो प्रयोगात्मक नमूना ट्यूब में डाल दिया। ग्रंथिल गैन्ग्लिया 16 और 17 डीआरजी के विच्छेदन के लिए निम्नलिखित जौव प्रोटोकॉल को देखें।
  3. काटना और आंशिक रूप से इस तरह के पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) के रूप में गैर लेबल गैन्ग्लिया, कट, छंटाई नियंत्रण के लिए। सकारात्मक नियंत्रण और दो gangli के लिए दो गैन्ग्लिया का प्रयोग करेंनकारात्मक नियंत्रण के लिए एक।
  4. सफल छँटाई के लिए पर्याप्त ग्रंथिल न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए, एक प्रयोगात्मक नमूना ट्यूब युक्त GADS में 5 चूहों से गैन्ग्लिया गठबंधन।

4. संवेदी गैन्ग्लिया हदबंदी

  1. 500 μl GADS बाहर पिपेट, ट्यूब में गैन्ग्लिया जा रही है। एक बार 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़कर गैन्ग्लिया धो, गैन्ग्लिया, ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए तो पीबीएस बाहर पिपेट प्रतीक्षा करें।
  2. 1 मिलीलीटर GADS और पाचन एंजाइम के 22 μl (कोलैजिनेज़ मैं / द्वितीय और प्रोटीज मिश्रण, 2.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर में एच 2 ओ) के लिए प्रत्येक ट्यूब जोड़ें।
  3. सकारात्मक नियंत्रण ट्यूब के लिए 20 μl फास्ट ब्लू (5.26 मिमी) जोड़ें।
  4. पहले से ही 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में ट्यूबों रखो।
    नोट: गैन्ग्लिया पाचन के समय पाचन एंजाइम की उम्र पर निर्भर करता है। पाचन एंजाइम भंग के 1 महीने के भीतर, 30 मिनट के लिए पचाने के भीतर 2 - 6 महीने 45 मिनट के लिए पचाने। अगर एंजाइम महीने 6 वर्ष से अधिक उम्र है, पचाने गैन्ग्लिया चया 60 मिनट।
  5. हर 15 मिनट हिला नलियों संक्षिप्त और उन्हें झटका गैन्ग्लिया सुनिश्चित करने के लिए समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं।
  6. गैन्ग्लिया पच किया जा रहा है, वहीं एक कण समाधान (कोलाइडयन सिलिका के कण polyvinylpyrrolidone के साथ लेपित) का उपयोग घनत्व ढ़ाल तैयार करते हैं।
    1. GADS में 12% कण समाधान, नमूना प्रति 500 ​​μl मिक्स।
    2. GADS में 28% कण समाधान, नमूना प्रति 500 ​​μl मिक्स।
    3. धीरे धीरे और सावधानी से प्रत्येक नमूना के लिए एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 400 μl 28% घनत्व समाधान के शीर्ष पर 400 μl 12% घनत्व समाधान जोड़ें। दो परतों मिश्रण करने के लिए अनुमति न दें। दो अलग परतों ट्यूब में दिखाई जानी चाहिए; एक दूसरे से गहरा।
  7. गैन्ग्लिया पचा जा रहा है, (एक तेजी से ब्लू सकारात्मक और एक तेजी से ब्लू नकारात्मक छँटाई नमूना प्रति ट्यूब) छंटाई के लिए लेबल नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों। छँटाई सुविधा आवश्यकताओं पर निर्भर करता है, इन ट्यूबों वियोज्य पलकों होनी चाहिए ताकि के रूप में दखलंदाजी नहीं करने के लिएसेल सॉर्टर के साथ ई।
  8. उचित पाचन समय के बाद, पाचन एंजाइम के साथ GADS हटाने और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार गैन्ग्लिया धो लें। प्रत्येक ट्यूब ताजा GADS के 200 μl जोड़ें।
  9. एक 200 μl पिपेट, 100 μl मात्रा करने के लिए सेट, और पिपेट गैन्ग्लिया ऊपर और नीचे कई बार कोशिकाओं को अलग तोड़ने के लिए प्रयोग करें। दोहराएँ जब तक ऊतक का कोई बरकरार टुकड़ा देखा जाता है। समाधान में बुलबुले बनाने से बचें।
  10. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से अलग कोशिकाओं गुजरती हैं।
  11. मूल हदबंदी ट्यूब के लिए एक और 100 μl GADS जोड़े छोड़ किसी भी शेष आवारा कोशिकाओं लेने के लिए और सेल झरनी के माध्यम से अतिरिक्त समाधान पारित करने के लिए। एक नया विंदुक टिप का उपयोग करना, किसी भी शेष सेल युक्त तरल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया और जाल से चिपके रहे है कि इकट्ठा। GADS में निलंबित कर दिया कोशिकाओं के अंतिम मात्रा 300 μl है।
  12. ध्यान से पहले किए गए घनत्व ढाल के शीर्ष पर कोशिकाओं के 300 μl परत। बुलबुले से बचने और सी का मिश्रणघनत्व परतों के साथ एल।
  13. आरटी पर 2,900 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  14. कोशिकाओं सेंट्रीफ्यूज में हैं, lysis बफर (प्रयोगात्मक नमूना प्रति 1 मिलीलीटर) मिश्रण इस प्रकार है: 1 मिलीलीटर बफर RLT (आरएनए निकासी किट से) में 2-मर्केप्टोइथेनाल 10 μl।
    1. फास्ट ब्लू सकारात्मक संग्रह ट्यूब के लिए 300 μl lysis बफर और फास्ट ब्लू नकारात्मक संग्रह ट्यूब (ट्यूब कदम 4.7 से लेबल) के लिए 600 μl जोड़ें। यह मात्रा की उम्मीद एकत्र होने की कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है। के लिए <2,000 कोशिकाओं, 300 μl जोड़ने के लिए> 7000 कोशिकाओं 600 μl जोड़ें। इस छँटाई म्यान तरल पदार्थ काफी lysis बफर कमजोर नहीं करता है सुनिश्चित करेगा।
  15. एक बार centrifugation पूरा हो गया है, ध्यान से हटाने के लिए और शीर्ष 700 μl परत त्यागें। यह परत सेल मलबे कि अन्यथा सेल छँटाई के साथ हस्तक्षेप करेगा के बहुमत में शामिल है।
  16. शेष सेल समाधान और pipet युक्त करने के लिए 700 μl ताजा GADS जोड़ेते ऊपर और नीचे कई बार मिश्रण करने के लिए।
  17. 2900 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं।
  18. कोशिकाओं सेंट्रीफ्यूज में हैं, 1 मिलीलीटर GADS करने के लिए 5 μl DNase (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़कर GADS (नमूना प्रति 500 ​​μl) छँटाई मिश्रण।
  19. एक बार centrifugation किया जाता है, ध्यान से हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सेल गोली छोड़ने।
  20. पुनः निलंबित 200 में सेल गोली - ऊपर pipetting द्वारा और एक 1000 μl पिपेट 200 μl कई बार करने के लिए सेट के साथ नीचे 300 μl छँटाई GADS। बर्फ पर नमूने रखो। कोशिकाओं को अब हल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।

5. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (एफएसी) छंटनी

नोट: यह खंड एक FACS सॉर्टर का परिचालन ज्ञान या कुशल कर्मियों की सहायता की आवश्यकता है।

  1. 1 μl propidium आयोडाइड (पीआई) शेयर समाधान (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के प्रत्येक नमूने के लिए जोड़े सेल व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए। 2 ट्यूब, पीआई के साथ एक और एक के बिना में नकारात्मक नियंत्रण विभाजित। पीआई ही मृत कोशिकाओं में डीएनए को बांधता है। अगरपहले कुछ प्रकार के बाद वहाँ लेबल करने के लिए, पीआई के उपयोग की जरूरत नहीं है कोई मृत कोशिकाओं रहे हैं।
  2. परिवहन कोशिकाओं साधन प्रवाह cytometry के लिए, बर्फ पर जैसे।, बी.डी. FACS AriaII चल दिवा 8 सॉफ्टवेयर,।
  3. चूंकि सेल आकार इस आबादी में चर रहा है, छंटाई के लिए एक बड़ी नोक (100 माइक्रोन) का उपयोग करें। तनाव कोशिकाओं अनुभव की मात्रा को कम करने और बढ़ाने के लिए सेल व्यवहार्यता कम दबाव (20 साई) का उपयोग करें।
  4. विश्लेषण भूखंडों, आगे तितर बितर, पक्ष तितर बितर (एसएससी), फास्ट ब्लू, और पीआई, अगर जरूरत है स्थापित करने के लिए FACS सॉर्टर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
  5. फिर से निलंबित करने के लिए कोशिकाओं, धीरे यह सॉर्टर में लोड करने से पहले नमूना संक्षेप में भंवर।
  6. नकारात्मक नियंत्रण, कोई तेजी से ब्लू या पीआई के साथ शुरू, गेट दहलीज (2A चित्रा) स्थापित करने के लिए। इस सेल की आबादी में autofluorescence की राशि का निर्धारण करेगा। वैकल्पिक: पीआई के साथ नकारात्मक नमूना चलाएँ मृत कोशिकाओं की आबादी है कि क्या वहाँ की पहचान।
  7. सकारात्मक नियंत्रण नमूना के आधार पर क्रमबद्ध (आईएनसीफास्ट ब्लू के साथ ubated), मुआवजा मानकों को स्थापित करने के लिए।
  8. एक बार फाटक और मानकों को स्थापित कर रहे हैं, प्रयोगात्मक नमूने छंटाई शुरू करते हैं। नमूने आरएनए lysis बफर युक्त तैयार संग्रह ट्यूबों में हल कर रहे हैं।
  9. बर्फ पर हल नमूने रखें जब तक सेल छँटाई पूरा हो गया है।
  10. आरएनए निष्कर्षण कदम के तुरंत बाद कोशिकाओं को हल कर रहे हैं शुरू।

6. शाही सेना निकालना

  1. 1 मिनट के लिए lysis बफर में भंवर हल कोशिकाओं homogenize करने के लिए।
  2. कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 70% इथेनॉल और मिश्रण का 1 मात्रा जोड़ें।
  3. एक स्पिन स्तंभ के लिए नमूना के 700 μl अप करने के लिए स्थानांतरण। पर 8000 x जी 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    1. दोहराएँ जब तक नमूने की कुल मात्रा स्पिन स्तंभ के माध्यम से पारित कर दिया है।
  4. निर्माता के protoco के अनुसार 350 μl बफर RW1 जोड़ें और आरएनए शुद्धिकरण की प्रक्रिया जारी है, DNase उपचार कदम भी शामिल है,कोशिकाओं के लिए एल।
  5. एक बार शाही सेना को निकाला गया है, निर्माता विनिर्देशों के अनुसार एक microfluidic वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करते हुए शाही सेना गुणवत्ता का परीक्षण करें।

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Representative Results

इस विधि का प्रयोग, एयरवे-innervating न्यूरॉन्स intranasally तेजी ब्लू (चित्रा 1 ए) instilling द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। दो दिनों के बाद, फास्ट ब्लू लेबल की कोशिकाओं ग्रंथिल गैन्ग्लिया (चित्रा 1 सी) में दिखाई देते हैं। ग्रंथिल गैन्ग्लिया की कुल न्यूरोनल जनसंख्या का 5% - इन कोशिकाओं को 3 बनाते हैं। अन्य प्रतिगामी रंगों कि इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) और Fluorogold शामिल हैं। न्यूरॉन्स ग्रंथिल DiI लेबल के फेफड़े जोखिम। हालांकि, DiI अब लगता है नाड़ीग्रन्थि तक पहुंचने के लिए, 7 - 14 दिनों टपकाना 18,19 के बाद, इसलिए एक सक्रिय रूप से ले जाया डाई का इस्तेमाल किया गया था। Fluorogold एक सक्रिय रूप से ले जाया डाई भी है कि एयरवे न्यूरॉन्स 14,20 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हमारे अनुभव में, हालांकि, एक बार इस डाई सेल निकायों ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि इसे जल्दी उपग्रह कोशिकाओं और नहीं न्यूरॉन्स द्वारा उठाया गया था में पहुँच (नहीं दिखाया डेटा)। उपवासब्लू एक वैकल्पिक सक्रिय रूप से फ्लोरोसेंट रंजक है कि सफलतापूर्वक, और जल्दी से, लेबल चूहों 21 और एयरवे-innervating ग्रंथिल न्यूरॉन्स 13,14 में डीआरजी ले जाया जाता है। फास्ट ब्लू दृष्टिकोण है, इसलिए, और अधिक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होता है।

ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि के विच्छेदन के पहले 16 में वर्णित किया गया और उसके स्थान संक्षेप में चित्रा 1 बी में सचित्र है। पाचन शुरू होता है के तुरंत बाद ग्रंथिल गैन्ग्लिया excised किया गया है। clumping से न्यूरॉन्स एक साथ रोकने के लिए और एक क्लीनर प्रकार के लिए अनुमति देते हैं, एक सज्जन पाचन एंजाइम का उपयोग करने के लिए, किसी भी मलबे को साफ करने और गैन्ग्लिया समाधान छँटाई करने के लिए RNase जोड़ें। एकाधिक पाचन एंजाइम घोला जा सकता है प्रभावशीलता के लिए परीक्षण किया गया। एक हल्के पाचन एंजाइम मिश्रण 22 की कोशिश की थी, हालांकि, वयस्क नाड़ीग्रन्थि पाचन के लिए यह काफी मजबूत एक समय पर फैशन में कोशिकाओं को अलग तोड़ने के लिए नहीं था। वैकल्पिक रूप से, एक पहले से papain की 23 संयोजन का इस्तेमाल किया, प्रोटीजऔर collagenase एंजाइम मिश्रण भी आक्रामक साबित हुई है और अवांछनीय कोशिका मृत्यु का कारण (नहीं दिखाया डेटा)। निर्दिष्ट एंजाइम मिश्रण के साथ रेखांकित पाचन प्रोटोकॉल, उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ एक समय पर पाचन के लिए आदर्श होना पाया गया।

पिछले विधियों का मार्गदर्शन सेल एक गिलास पिपेट लेबल हटाया गया कोशिकाओं 24 से लेबल की कोशिकाओं को अलग करने के साथ उठा इस्तेमाल किया है। इस तकनीक को बेहतर कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के एकल कक्ष विश्लेषण के लिए अनुकूल है। हालांकि, 48 कोशिकाओं / घंटा की अधिकतम दर के साथ इस तकनीक जब सैकड़ों या कोशिकाओं के हजारों की पूरी आबादी को एकत्र करने की आवश्यकता अव्यावहारिक है। जब लक्ष्य के लिए उच्च गुणवत्ता शाही सेना को अलग करने के लिए है, समय एक महत्वपूर्ण चर हो जाता है। यह आरएनए निकासी शुरू करने के रूप में जल्दी संभव के रूप में गिरावट को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। एफ ए सी छँटाई में पूरे लेबल आबादी के संग्रह की अनुमति देता है ~ 45 मिनट और आरएनए निष्कर्षण के तुरंत बाद शुरू कर दिया है।

O: रख-together.within-पेज = "1"> जब न्यूरॉन्स छँटाई यह टूटा neuronal प्रक्रियाओं से ज्यादा के रूप में मलबा साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक घनत्व ढाल अलग नमूनों से मलबा साफ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह एक उच्च पर्याप्त बल पर अपकेंद्रित्र करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि सी-फाइबर न्यूरॉन्स, जो एक छोटे त्रिज्या है, ~ 5 माइक्रोन 24, ढाल के माध्यम से मजबूर कर रहे हैं महत्वपूर्ण है।

चित्रा 2A और बी छँटाई फाटक स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण दिखा। चित्रा -2 में देखा जा सकता है, अलग फास्ट ब्लू क्रमबद्ध दो आबादी में ग्रंथिल कोशिकाओं लेबल। सेल इस नमूने से एकत्र संख्या चित्रा 2 डी में सूचीबद्ध हैं। 85% - इस विधि के लिए दक्षता छंटनी 73 है। जब न्यूरॉन्स छँटाई आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर मानकों को विशिष्टता जोड़ नहीं था। चूंकि न्यूरॉन्स गोलाकार नहीं हैं इन मानकों मज़बूती सेल आकार की रिपोर्ट करने में असमर्थ थे।

ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> उच्च गुणवत्ता शाही सेना उपज के लिए, कोशिकाओं lysis बफर में सीधे हल किया जाना चाहिए और आरएनए छँटाई एक microfluidic वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के बाद तुरंत निकाला जाना चाहिए। शाही सेना (चित्रा 3) की गुणवत्ता। 18S और 28S चोटियों जेल एक शाही सेना अखंडता संख्या (Rin) की गणना करने के लिए इस्तेमाल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से निर्धारित होते हैं। आरएनए नमूना अनुक्रमण के लिए RIN अधिक से अधिक 7 से यह आरएनए नमूना अब अनुक्रम किया जा करने के लिए तैयार होना चाहिए ।

आकृति 1
चित्रा 1. वेगस तंत्रिका की ग्रंथिल ganglia में श्वासनली innervating न्यूरॉन्स की तेजी ब्लू लेबलिंग। ए) फेफड़ों में तेजी ब्लू intranasal टपकाना का प्रतिनिधित्व। प्रकाश sevoflurane संज्ञाहरण, पिपेट एक माउस के नाक में 1% DMSO के साथ पीबीएस में तेजी से ब्लू के 40 μl, यकीन है कि माउस तरल पदार्थ में श्वास है बनाने के तहत। सी के साथ चलाता है की एक उमड़ना के रूप में दिखाई देता है) में कम से कम 2 दिनों के बाद, फास्ट ब्लू ग्रंथिल गैन्ग्लिया में प्रकट होता है, एयरवे न्यूरॉन्स अंकन। ग्रंथिल लाल फ्लोरोसेंट Nissle दाग है, जो सभी न्यूरॉन्स के धब्बे के साथ counterstained है। स्केल बार 100 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (एफएसी) फास्ट ब्लू सकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेट्स छंटनी। छँटाई फाटक नकारात्मक (ए) और सकारात्मक (बी) का उपयोग करने के लिए स्थापित करने के लिए तेजी से ब्लू सकारात्मक आबादी स्थापित करने के लिए नियंत्रित करता है। नकारात्मक नियंत्रण (ए) वें डीआरजी कोशिकाओं अलग हैपर फेफड़ों अंदर आना नहीं है। सकारात्मक नियंत्रण (बी) डीआरजी कोशिकाओं है कि, इन विट्रो में तेजी से ब्लू के साथ incubated रहे हैं के बाद वे विच्छेदित कर दिया है अलग है। अलग न्यूरॉन्स की गैर-गोलाकार आकृति के कारण, आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर मानकों को सेल की आबादी। सी) का एक प्रतिनिधि क्रमबद्ध चूहों जिसका एयरवेज फास्ट करने के लिए ब्लू। डी उजागर किया गया है की गैन्ग्लिया कोशिकाओं ग्रंथिल अलग) को परिभाषित करने में मदद नहीं करेंगे (सी) के लिए कोशिकाओं की संख्या। 1,000 से अधिक तेजी से ब्लू (एफबी) कोशिकाओं एकत्र किए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. शाही सेना गुणवत्ता और आरएनए वफ़ादारी संख्या (Rin) का आबंटन एक microfluidic वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग का आकलन। एक चुनाव का उपयोगrophoresis प्रणाली शाही सेना की गुणवत्ता चित्र जेल छवि पर 18S और 28S चोटियों से गणना की है। कम चोटी अपमानित आरएनए का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल वेगस तंत्रिका की ग्रंथिल गैन्ग्लिया में एयरवे-innervating न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए एक विधि का वर्णन है। एक बार लेबल, गैन्ग्लिया धीरे बेहतर सेल नंबर और व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए अलग कर रहे हैं। इन न्यूरॉन्स तो कर रहे हैं एफएसी lysis बफर में सीधे हल और आरएनए निकाला जाता है। इस प्रोटोकॉल के महत्व, लक्ष्य को अलग, और एक विशिष्ट संवेदी सेल की आबादी की गुणवत्ता बनाए रखने की क्षमता है। जीन अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स की इस छोटी सी आबादी में वर्णन किया गया है, और अंग-विशिष्ट कार्यों और तंत्रिका नेटवर्क पहचाने जाते हैं।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हदबंदी प्रक्रिया के माध्यम से तेजी से प्रगति और बाद में सेल छँटाई शामिल हैं। यह छँटाई समय ऐसी है कि यह हदबंदी के तुरंत बाद शुरू होता है अनुसूची करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी महत्वपूर्ण है कि सभी आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों, ताजा कर रहे हैं 70% और 80% इथेनॉल समाधान ताजा बना रहे हैं, और सभी ट्यूबों और आरएनए निकासी के लिए उपकरणस्वच्छ और RNase मुक्त कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल है कि इस तरह की कोशिकाओं एकल कक्ष आरएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण के लिए अच्छी तरह से प्लेटों में व्यक्तिगत रूप से हल किया जाता है संशोधित किया जा सकता है। यह भी ऐसी पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) के रूप में अन्य संवेदी गैन्ग्लिया से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। DRGs वापस करने के लिए पता लगाने के लिए शरीर के विभिन्न भागों की डाई इंजेक्शन पहले किया गया है 17 में वर्णित है। इस प्रोटोकॉल भी कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। lysis बफर में कोशिकाओं छँटाई करने के बजाय, कोशिकाओं न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से, GADS में हल कर रहे हैं। इन कोशिकाओं को फिर सुसंस्कृत और जैसे कैल्शियम इमेजिंग, या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में कार्य अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

फास्ट ब्लू सकारात्मक आबादी की उम्मीद है और परिणाम की तुलना में छोटा होता है, तो नए पाचन एंजाइम की खरीद। पाचन एंजाइम की उम्र पाचन की दक्षता को जोड़ा जाता है। पाचन एंजाइम खरीद के 1 वर्ष के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस मामले में जहां सेल संख्या अधिक है में,आरएनए निकाला जाता है और गुणवत्ता का परीक्षण किया। आरएनए अपमानित किया जाता है, तो यह इस बात का संकेत है कि अभिकर्मकों ताजा नहीं कर रहे हैं, या दूषित कर दिया है। इस मामले में, के लिए यकीन है कि अच्छी तरह से साफ सब आरएनए निष्कर्षण क्षेत्रों pipettes, रैक, और कुछ भी है कि नमूना ट्यूबों के साथ संपर्क में आ जाएगा। ताजा RNase और DNase मुक्त 70% और 80% इथेनॉल बनाओ। पानी और इथेनॉल इन समाधान बनाने के लिए इस्तेमाल भी अन्य लैब आपूर्ति से अलग रखा और आरएनए निकासी के लिए पूरी तरह से इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

एफ ए सी छँटाई तेजी ब्लू सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेजी से और कारगर तरीका है, हालांकि, एक सीमा है कि सेल घनत्व 1 2 लाख मिलीलीटर बफर प्रति कोशिकाओं होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल वर्तमान सेल सॉर्टर मॉडल की सीमा धक्का। ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि में कोशिकाओं की संख्या कम है। एक सेल उपज सेल सॉर्टर के लिए पर्याप्त प्राप्त करने के लिए, पांच जानवरों से कोशिकाओं को जमा कर रहे हैं। 300 μl और कम से कम 100,000 निलंबित कोशिकाओं है - छँटाई मात्रा में वर्णित 200 है। टीमिलीलीटर प्रति चारों ओर 450,000 कोशिकाओं, सिफारिश घनत्व नीचे की एकाग्रता के लिए अपने अनुवाद। एक सेल सॉर्टर का उपयोग करने के एक विकल्प के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और कांच पिपेट 24 के साथ चुनने के लिए है। इस तकनीक में धीमी है और 30 इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है - एक समय में 100 कोशिकाओं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के मौजूदा तरीकों की तुलना में एक तेजी से उच्च throughput विधि प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों एयरवे-innervating नसों की एक विशिष्ट जनसंख्या के transcriptional प्रोफ़ाइल निर्धारित करने की क्षमता शामिल हैं। उच्च गुणवत्ता वाले इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र आरएनए एकत्र न्यूरॉन्स की transcriptome को चिह्नित करने के सीडीएनए संश्लेषण और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और अन्य तकनीकों के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह, यह निर्धारित किया जा सकता है जो जीन या रास्ते इन न्यूरॉन्स के लिए विशिष्ट हैं। यह जानकारी कार्यात्मक भूमिका इन न्यूरॉन्स सामान्य शारीरिक स्थितियों में खेलने को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी। एक बार बुनियादीअभिव्यक्ति पैटर्न स्थापित किया गया है, इस प्रणाली के भौतिक और रासायनिक उत्तेजनाओं से या रोगजनकों द्वारा चुनौती दी जा सकती है, फेफड़ों-innervating न्यूरॉन्स में जीन विनियमन पर उनके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए। अंत में, पहचान के द्वारा जो जीन विनियमित रहे हैं हम नए औषधीय लक्ष्यों की पहचान और airway रोगों में तंत्रिका समारोह की तीव्र और जीर्ण परिवर्तन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए चिकित्सा विज्ञान के प्रभाव की जांच करने के लिए शुरू कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एनआईएच द्वारा समर्थित Sej को R01HL105635 अनुदान। लेखकों तकनीकी सलाह के लिए डिएगो वी BOHORQUEZ को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम यह भी तकनीकी सहायता के लिए आर कमिंग इयान धन्यवाद और ड्यूक मानव वैक्सीन अनुसंधान संस्थान से फ्लो साझा संसाधन सुविधा (डरहम, नेकां) में प्रवाह cytometry प्रदर्शन। फ्लो का ड्यूक में क्षेत्रीय Biocontainment प्रयोगशाला जो राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोग (UC6-AI058607) से निर्माण के लिए आंशिक समर्थन प्राप्त करने में प्रदर्शन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fast Blue Polysciences, Inc. 17740-2 stock 2 mg/ml in water
NeuroTrace 530/615 red Nissle stain Life Technologies N21482
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free Gibco 14190-144
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
glutamine (Glutamax) Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
N2 Gibco 17502-048
B27 (no vitamin A) Gibco 12587-010
Nerve Growth Factor (NGF) Sigma N6009 stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS
digestion enzyme, Liberase DH Research Grade Roche 5401054001 stock 2.5 mg/ml in water
particle solution (Percoll) Sigma P1644-25ML
Heating block LabNet
70 µm cell strainer Falcon 352350
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-500
RNase free water Fisher Scientific BP2484-100
RNase decontamination reagent, RNase AWAY invitrogen 10328-011
2-mercaptoethanol VWR EM-6010
RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit Qiagen 74034
DNase kit, RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
DNase Sigma D5025-15KU stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl
Propidium Iodide Sigma P4170-10MG stock 10 µg/ml in PBS
Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) Agilent

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 110 संवेदी तंत्रिका विज्ञान ग्रंथिल गैन्ग्लिया माउस फेफड़े प्रतिगामी प्रतिदीप्ति ट्रेसिंग फास्ट ब्लू प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) शाही सेना अनुक्रमण
एक विधि को लक्षित और चूहे में अलग-श्वासनली innervating संवेदी न्यूरॉन्स के लिए
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Kaelberer, M. M., Jordt, S. E. A… More

Kaelberer, M. M., Jordt, S. E. A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice. J. Vis. Exp. (110), e53917, doi:10.3791/53917 (2016).

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