Summary
網膜色素上皮（RPE）の交換戦略と遺伝子ベースの治療は、いくつかの網膜変性条件のために考慮されています。臨床翻訳のために、大きな目の動物モデルは、患者において適用外科技術を研究するために必要とされます。ここでは、汎用性とコスト効率であるRPE移植、に向けた網膜下手術のためのウサギモデルを提示します。
Abstract
加齢黄斑変性症（AMD）、網膜色素変性症、および他のRPE関連疾患は、工業先進国における成人の視力の不可逆的な損失のための最も一般的な原因です。 RPE移植は、それが、機能不全RPEを交換し、その機能、およびそれによって視力を回復することができるように、有望な治療法であると思われます。
ここでは、ウサギの網膜下腔（SRS）に足場上で培養RPE単層を移植する方法について説明します。硝子体切除異種移植は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）コーティングされたプランジャーと20ゲージの金属ノズルからなるカスタムメイドのシューターを使用して、SRSに送達された後。現在の技術では、6年間で150以上のウサギの手術で進化しました。術後フォローアップは、灌流固定し、組織学に続くスペクトル領域光コヒーレンストモグラフィ（SD-OCT）などのインビボイメージングにおける非侵襲的および反復使用して得ることができます。
目E法は簡単学習と高い成功率のために明確に定義されたステップを有します。ウサギは、臨床翻訳のための前臨床試験で大きな目の動物モデルが有用であると考えられます。この文脈において、ウサギは他の大規模な眼の動物モデルへのコスト効率の高い、おそらく便利な代替手段です。
Introduction
加齢黄斑変性症（AMD）は、中心視力の低下を引き起こすとして、工業先進国では50歳以上の成人の視覚障害の最も一般的な原因です。これらの患者の約15％が血管新生を脈絡膜に由来し、網膜機能1を破壊する疾患の「ウェット」フォーム、苦しみます。この変異体は、抗血管形成薬2の反復内硝子体注射で非常に効果的な治療法によって治療することができます。しかし、患者の大部分（〜85％）は、網膜色素上皮（RPE）の下での細胞外沈着物（ 例えば 、ドルーゼン）によって特徴付けられる乾燥形態、苦しみます。これらの堆積物は、黄斑の網膜萎縮につながるRPEの機能障害を引き起こします。任意の根治治療選択肢の欠如を考えると、AMDは、多くの異なる根治治療的アプローチが試験されている集中的に開発する研究分野、へと進化しました。外科RPEの交換がありますこの衰弱性疾患3を倒して1魅力的な未来の可能性。
自家網膜下RPE移植が黄斑に機能不全または失われたRPEに置き換えられ、その生理機能4-9を回復させる可能性を秘めています。この手術法は、科学者に移植10 RPEの無限の細胞源を与えて、ヒト胚性幹細胞（hESCの）と人工多能性幹細胞（IPSC）からのRPE分化プロトコルの開発に突破口を有していました。 RPE移植は現在、幹細胞由来の治療のための魅力的なファースト・イン・ヒューマンアプリケーションとして認識されています。目は、 インビボ監視ツール11-13 で優れた外科的アクセスと洗練されたを提供しています。
RPE移植するために、一つの方法は、より良好なRPE特性および移植の機能を維持するために、あるいは、人工キャリアSUBSTRの細胞懸濁液を使用して低侵襲性送達にありますRPEの交換のためのATE（足場）は4,14,15検討されています。大型の動物モデルは、前臨床検証に必要とされる、まだ動物の取り扱いと手術手技に関する詳細な技術情報は、16-23とデートするために不足しています。
それは、より安全なハンドリングを提供し、単層の完全性と機能性を保持するように我々とは逆25にいくつかの証拠にもかかわらず、他のもの11,24は 、硬質まだ弾性キャリア基板の使用を示唆しています。時間が経つにつれて、私たちは、網膜下腔（SRS）への細胞キャリアサポートRPE移植の移植のためのいくつかのカスタム設計の器具および補助技術をテストしています。私たちは、移植の成功14,26,27を評価するために、スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SLO / SD-OCT）、および組織学と組み合わせた生体内走査レーザー検眼鏡では 、術中ビデオ録画を利用しました。ここでは、ウサギの網膜下のRPE移植のための私達の現在の勧告を提供し、これは、150以上の手順で、5つの異なるウサギ株、7セル担体材料と4 RPE細胞源で試験しました。
Protocol
眼科研究における動物の扱いの倫理：我々は、医学部の倫理委員会の承認を得たボン大学、およびビジョンと眼科研究協会（ARVO）が述べているガイドラインに準拠しています。また、すべての手順は、ノルトライン=ヴェストファーレン州の州の規制当局によって承認されました。食料と水に自由にアクセスで標準化された個々のケージで20℃で、定期的な昼光への曝露、 - 動物は、18の間の温度とエアコンの専門施設で屋内で開催されました。
注：動物に手術の親和性を確保するために、動物の健康のスコアシートには、以下の決定的な動物の除外基準含まれて続いている：入院時の体重と比較して20％の重量損失を、動物の見かけのチアノーゼ。動物震え、けいれんを持っているか、協調して移動することはできません。運動失調/感覚異常、 例えば 、麻痺させます。無関心;極端な自動切断（皮膚創傷、切断肢）。
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1.機器の滅菌
- 超音波浴中で再利用可能な器具を配置します。
- 500ミリリットルの蒸留水と機器消毒剤の2ミリリットルを追加します。
- 15分間掃引機能を使用してクリーン機器。
- 超音波浴から楽器を削除し、5分間蒸留水を用いてすすぎます。
- オートクレーブ内の器具を挿入し、標準的なプログラム（20分121ºC下に楽器の消毒）を使用します。
2.機器の準備
- 密室、手術用スクラブを着て、マスクやヘアカバーに働くことによって、無菌領域を確立し、維持します。無菌手術用手袋を着用しての前に手を消毒。詳細なアプローチについては28を参照してください。
- 滅菌ドレープの滅菌器具を配置します。
- 注射のための27 G針、バランス塩溶液（BSS）で10mlの注射器に取り付けられた40mgのトリアムシノロンを充填した1mlシリンジ、および5ミリリットルのシリンジOを配置ドレープ上のF潤滑剤。
- 3-0絹、7-0 VICRYL、眼スティック（結膜/強膜出血を止めるために）、ツイスターガーゼスポンジ、創傷閉鎖ストリップ（硝子体切除先端チューブを固定するために）、およびドレープ上のシャンデリアendoillumination繊維線を配置します。
- 25 Gシャンデリアendoilluminatorのラップを解除し、滅菌技術を用いて、光のマシンに接続する（ステップ2.1参照）。滅菌技術を使用して、硝子体切除機に高速vitrectorとベンチュリカセットを含む硝子体切除セットを接続します（ステップ2.1参照）。
- 500ミリリットルBSSボトルを開き、製造元の指示に従って、ベンチュリカセットにソリューションを接続します。
動物の麻酔とポジショニングの調製
- 正確な投薬用量を確保するために動物を計量。
- 0.35ミリグラム/ kgのケタミンとスタートのために0.25mg / kgのメデトミジンを含む27 G針を1シリンジを用いて筋肉内（IM）麻酔を準備します。ミックスする注射器を反転します。
- 1/3トンで2注射器を準備彼は運転中に麻酔を維持するために、用量。
- 静脈内注入の代替として、5％グルコース溶液および皮下注射のために18 G針の20ミリリットルを含む注射器を準備します。
- 散瞳目の3×1滴は瞳孔拡張のための硝子体手術の前に下がる与えます。
- 毛布で覆いウサギは、麻酔注射の前に落ち着か30秒間注入部位の周りの後肢（臀筋）やマッサージに注入します。
注：IM麻酔の最初のショットは、約1持続 - 2時間を。ウサギのサイズに応じて、薬物耐性、脂肪層、応力及び体温。 45分 - 色褪せ麻酔の最初の兆候は、眼振（外科医によって監視されなければならない）、約30最後のその後の注射です。 - 催眠、反射低下、鎮痛および動物の筋肉の弛緩を検証することにより、適切な麻酔を確認してください。
- ウサギは無意識になると、首の皮膚のひだに皮下注射白金（Pt。3.3）を得ました。
- methylcを追加ellulose潤滑剤ごとに5 - 運営眼の中の10分は、非操作眼に潤滑剤やテープ蓋を追加します。
- 手術用顕微鏡下（鼻が少しブランケットの金型を通って上昇し、それが眼の表面と同じ高さ）は、このような最適な位置に綿毛布のようなカバーで覆われた手術台に覆われたウサギを置きます。顕微鏡の対物レンズに垂直に目を合わせます。
- 直腸温度計（正常体温39±1ºC）29を使用して、適切な身体コア温度を確認してください。
- 術後感染を減らすためにハサミ（ブレード上のいくつかの軟膏）を使用して、まつ毛をカット。
- 局所的に1分間0.1グラム/ミリリットルポビドンヨードの3滴と滅菌BSSで洗い流し - 2を使用して目を駆除。
- 目に途中でプレカット開口部を備えた滅菌ドレープで目を覆い、その後（スティッキー）外科的切開ドレープで12×17センチカバーしています。
4.硝子体手術
- INVを使用して3-0絹とProptoseとセキュアな目ertedキャリパーとは、結膜peritomyを行います。
- 角膜輪部に近いが、血管から十分vannasシザー（〜1ミリメートルの距離）と結膜を切開。
- 「T-カット」を作成することにより、結膜を解剖。まず、角膜輪部にはさみ平行でperitomyを拡大してから約6のための「T」の形で垂直に結膜を切開 - 7ミリメートル。慎重にぶっきらぼうに結膜を分離します。
- 慎重に視神経に向かう方向に刃の鋭い先端を挿入することにより、右眼/ OD（左目/ OS上の4時）に8時23 Gのmicrovitreoretinal（MVR）のブレードを用いて、強膜切開を行います。ゆっくりと同じ方向にブレードを撤回し、強膜切開を拡大することは避けてください。
- 挿入し、7-0絹縫合糸を用いて縫合カスタムサイドポート注入カニューレ27と24 mmHgので眼圧（IOP）を設定します。
- OD（10 O '上の2時位置に25 Gフラットヘッドトロカールと強膜切開を行います; 4.2工程と同様のOS上のクロック）。
- 粘着テープで固定すると、約 30％で光源をオンにし、フラットヘッドのトラカールに25 Gのシャンデリアの光を挿入します。
- 必要に応じて、より良い眼内視覚化のための＃20メスを用いて浮腫状角膜上皮を除去します。
- 結び目を作ることなく、OD上の10時（OS上の2時）、（前）場所のU字型強膜切開の周りに7-0縫合糸で4.2ステップ、および硝子体切除カッター先端を挿入する同様の強膜切開を行います。
- 最大で小片に硝子体液を切断することにより、高速vitrectorを使用して、視神経乳頭と線維のmedullaresにわたって継続し、その後、入口ポートの周りに硝子体切除術30を起動します。 2000 - 最大で吸引/分3,000カット、。硝子体切除機の述べたパラメータ設定を使用して200 mmHgの（ 表1）
- 後極Aの上に高速vitrectorを保持することによって網膜から硝子体液を分離することにより、後部硝子体剥離（PVD）を実行ND（優しく可能であれば）ディスク31のみ最大で吸引しながらの優れました。切断せずに200 mmHgで。
- 硝子体内に可視化し、容易にするために、約 50μlの（20mg）をトリアムシノロンまたは希釈フルオレセイン（ 約 0.1mg / mlの）（合計近く）硝子体切除時の後極とmidperipheryオーバーフローティング硝子体の除去を注入します。レンズの下にクロスオーバーは避けてください。ガスタンポナーデを希望する場合（熟練）アシスタントによって周辺硝子体を剃るためにインデントが推奨されます。
- でBSSの点滴液に0.001ミリグラム/ mlの最終濃度になるように20単位/ mlのヘパリンおよび0.5 mgのエピネフリンを追加し、パラレルまたはステップ4.10の後。
注：ヘパリン/エピネフリンは、眼内注入されないように、その効果は、注入流量に応じて遅延されます。
5.読み込んシューター
注：本明細書で説明する作業は、ヘルシンキ宣言の教義に該当しません。それは、ヒト患者を伴いませんでした。ここでは、駅ndard RPE細胞は、ヒト胎児の目から単離し、培養し、コーティングされていない厚さ10μmのポリエステル（PET）に分化させた私たちの以前に公開されたプロトコル14に従って挿入します。ヒト胎児材料で作業する権限はボン大学の倫理委員会から入手しました。また、ヒトES-RPEは、それらがVaajasaari らによって記載された技術に従って培養したSkottmanラボ（。準備中の原稿）、から出荷された32。これらの細胞の許可はR.コッホ研究所、ベルリン、ドイツから得られています。
- 前眼科グレードのBSSとインプラントの3倍の調製細胞培養物を洗浄します。
- 10ミリリットルの眼科用グレードのBSSで、標準的な細胞培養皿（100×20 mm）を入力します。
- BSSと中心光顕微鏡下皿に細胞培養インサートを追加します。
- フラット、豆状の基板を得ることが鈍い、楕円形、カスタムメイドの針で2.4×1.1ミリメートルのインプラントをパンチアウト二つの長辺と2ラウンドエッジを持ちます。
- ゆっくりBSS満たされたカスタムメイドのローディングステーション（ 図1）にインプラントを洗い流すためにBSSを有する第二ポートを介して針をあふれさせます。
- 必要に応じてちょうど第三のエッジを得るために、インプラント（<0.5ミリメートル）の1ラウンドの端をカット。
- インプラントが単層細胞担体上に逆さまであることを確実にすることによって、右方向にあることを確認します。慎重に2メスを使用して位置決め変更します。
- インプラントのすべてが先端の内側に固定されるまで、針ホルダを使用して、シューターの機器に優しく、完全にインプラントを押してください。プランジャが後退したままにしてください。
- 注入の瞬間までBSS下ローディングステーションの「ロードされた「シューティングゲームのヒントにしてください。
6.移植
- 気密注射器に接続された拡張可能な41 G網膜下注射針とのアプローチ神経網膜（すべての気泡が避難していることを確認してくださいチューブから！）。
- 3ディスク径（DD） - 網膜下にし、それにより約2のブレブ網膜剥離（BRD）を作成（カルシウム、マグネシウム/ CM付き）BSSを注入します。目ごとに2つのBRDを安全に上昇させることができます。
- 縦23 G VR-はさみで1.5ミリメートルに網膜切開を拡大。網膜下腔は現在移植またはさらなる操縦のためにアクセス可能です。
- 20 G・アプローチに1.4ミリメートル切開ナイフで強膜切開（正確に）を拡張します。
- ロードされたシューティングゲームの円滑な、まだぴったり移行を保証するために、必要に応じて拡大し、20 Gシューティングダミーを使用して強膜切開を通過しようとしました。
- 24 mmHgのに理想的な強膜切開を介してロードされたシューター27に渡します。
- エッジ網膜切開アプローチと網膜上の位置から網膜下インプラントを取り出します。
- それが合理的に離れて網膜切開からretina-の下にも配置されていることを確認する半分閉じた23 Gはさみ、鉗子または41 G針でインプラントを調整します。
7。動作を終了
- 25 Gのシャンデリアと注入カニューレを外します。
- すべてsclerotomiesを縫合。
- 8時の強膜切開（前縫合の最後の強膜切開）によって25μlの（10mg）をトリアムシノロンを注入します。
- チェック/触診によってIOPを調整し、必要に応じて、30 G針/シリンジを介してBSSを注入。
- 7-0 VICRYLとの縫合結膜。
- ゆっくり3-0シルクスリングをproptosing削除（深い眼窩静脈叢を避けてください！）。
- 蓋の下でデキサメタゾン/抗生物質軟膏を追加します。
- ダウン（空気/ガス付）（W / Oガス）を上向きに操作した目と毛布で覆われた1時間の位置、または。
- それは胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、無人の動物を放置しないでください。
- 麻酔が完全にフェードインする前に、これは与えられたメデトミジンの量と同じ薬を逆転メデトミジンを注入することで高速化することができるウサギを輸送してはなりません。
8.術後動物ケア
- キープ適切な条件（温度、光、食品、水、スペースなど ）や専門施設での綿密なモニタリングの下にウサギ。
- すなわち 、その動物が十分に休息であることを確認してください。、食品や水の欠乏の無い長時間。
- 特に注射部位に、任意の創傷または傷害を探します。
- 感染を防ぐために乾燥傷を保管してください。感染が疑われる場合、抗生物質を与える：デキサメタゾン1ミリグラム/ gに、硫酸ネオマイシン3,500 IU /グラム、硫酸ポリミキシンB 6,000 IU / gの軟膏を眼の表面上に1週間の術後1日2回適用しました。
- 優れた眼表面再生および縮小術後の痛みのために一日二回、次の7日間の術後のためのデキサメタゾン/抗生物質軟膏を追加します。
- 全身鎮痛薬を与える（Carprofeneに4mg /一日二回キロ）最初の48時間。
- それは胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
- その動物を返さないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けています。
- 不必要な苦痛に動物を公開しないでください。
9. SLO / SD-OCTガイダンス
- 準備し、0.175ミリグラム/ kgのケタミンおよび0.125ミリグラム/開始のためのキロメデトミジンを含む27 G針を1シリンジを用いて筋肉内（IM）麻酔を注入します。ミックスする注射器を反転します。
- 明確なSD-OCTイメージングを目に潤いを与えるし、維持するために、少なくとも5分ごとに潤滑剤を追加し、必要に応じてカスタムコンタクトレンズを使用することができます。
- 必要な位置に動物を安定させるためにヘッドレストに鋼製のプラットフォームを取り付けます。
- プローブに垂直な目を配置し、スチールプラットフォーム上でウサギを置きます。
- 気管を回避下頬の骨（下顎骨）からウサギの頭を保持します。
- インプラント上の視野角を最適化するために、およそ45°SD-OCTプローブに向かっによりチルト動物の頭。
- 30度のレンズとオプトの次のパラメータを使用します。imal 10月イメージング[HS]：1ライン分の30度設定は100（平均）に設定ARTモードと15に設定ARTモードでボリュームスキャンの20×20度の設定でスキャンします。高解像度モードが要求されません。
- インプラント（ 図2A）の焦点面を見つけるために、SLO赤外線反射率イメージングを使用します。最適な焦点は、インプラントのエッジが14尖っているときに（すべて）に達しました。
- 終了したら、蓋の下にデキサメタゾンを1mg / gで、硫酸ネオマイシン3,500 IU /グラム、硫酸ポリミキシンB 6,000 IU / gの軟膏を追加します。
Representative Results
網膜は、中心硝子体切除を行ったときに61％CAの成功率を有し、後部硝子体剥離が誘導された76％にまで上昇下で網膜下移植のための記載された方法の結果を表2生着に示されています。これらの数値は、いずれかの術中または第3術後日間で死亡した動物の21％を約含まれます。この技術は、同時に一方の眼で異なる網膜領域に2つの足場を移植するために使用することができます。
ウサギはシュタンツェルらによって記載されているように、SD-OCTおよび組織学的処理を使用してフォローアップ。27（ 図2）in vivoでの術後施行した。 図。図2Aは、単純な移植後のポリエステル膜（PET）上に移植培養RPEの走査型レーザ検眼鏡赤外線反射率画像を示します。ザインプラントの周りのハローは、感光体の萎縮に対応する。 図。インプラントに隣接する神経網膜が正常に近い反射帯域を示している図2（b）は 、対応するSD-OCT、通知網膜、主に外顆粒層（ONL）間伐、インプラント上記のSD-OCT上のハイパー反射バンドを示します。これらの結果は、非外傷性の送達を示唆している。 図。図2Cは、医原性操作の結果として可能性の網膜切開部位の周囲の網膜下瘢痕およびONL萎縮を示し、インプラント、PETを超える連続したまだ不規則な着色層のHematoxiline /エオシン（H / E）染色を示しています。インプラントの下のブルーフ膜はまた、連続して登場し、脈絡は、いくつかの散乱赤血球が含まれています。これらの形態学的結果は、SD-OCTに匹敵すると非外傷性の配信の論文を強化します。
イチジク URE 1：PETのセル担体上の人間IPSC-RPE培養したロードシューター。 A）カスタムメイドの針。B）細胞培養物からカット豆状のインプラントを使用してインプラントを打ち抜く示している。インプラントのC）位置決めの前にロード。D）インプラントとのシューティングゲームの読み込み中。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
図2： 培養ヒトのhES-RPE PET上での細胞のキャリアウサギ網膜下腔での4週間。 A）SLO赤外線反射画像を表示し、緑色の線は、 図1に示す断面を画定します。図2（b）。B）対応SD-10月C）H / E染色、詳細については、テキストまたは26,27を参照してください。ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| パラメーター | 使用される設定 |
| 硝子体茎切除術 | 6000カット/分 |
| 真空 | 200 mmHgの |
| 立ち上がり時間 | 1秒 |
| 空気 | 24 mmHgの |
| かんがい | 24 CMH 2 O |
| Diathermy | 30％ |
表1： 硝子体手術マシンのパラメータ設定。
| 硝子体茎切除術 | インプラント | 操作ウサギ | 成功したインプラント | 失敗したインプラント | 死 | 成功率％ |
| コア硝子体切除術 | ペット | 30 | 19 | 4 | 7 | 63.33 |
| PET + RPE | 70 | 42 | 12 | 16 | 60 | |
| PVDは、PPV / wのプラスミンを±します | ペット | 28 | 21 | 2 | 5 | 75 |
| PET + RPE | 22 | 17 | 2 | 3 | 77.27 |
表2： 最後 の 150事業 を含む法の概要とインプラントタイプ。
Discussion
ウサギモデルを使用して、安全かつ再現性のある方法は、カスタム設計されたシューティングゲーム機器との網膜下腔への細胞のキャリア上で培養RPEのtransvitreal配信のために提示されています。それは網膜下演習と硝子体切除術における標準的な技術を必要とするように記載されている方法は、簡単な学習のためのショート/最適化された外科技術を提供しています。結果は非常にきれいな硝子体網膜インタフェース、および乾燥を通して網膜と強膜損傷を防止する、低IOPでブレブ網膜剥離（BRD）を誘導、移植部位の上に流体乱流を回避眼内注入、およびウサギの適切な配置によって促進されます。
我々は、例えば、移植の成功を妨げ、いつでも発生する可能性があるいくつかの術中合併症として、しかし警告する眼内出血、麻酔、このような注入などの重要なステップの間にオフフェージングによる機器の操作や眼の低眼圧症にBRDの崩壊、 R低酸素性脳損傷、または温熱療法を引き起こす長い操作中に麻酔、低血圧の過剰投与量に起因するabbit死。しかし、これらの合併症は、彼らはすぐに手術チームの経験を増加させることによって取り組まれ、解決された場合、時間とともに減少します。
いくつかの合併症にはいくつかの簡単な、まだ決定的な手順に従うことによって低減することができました。運転中に角膜、強膜および結膜の損傷を防ぐために、そして明確な眼内メディアは、乾燥したとして/黒くなっ強膜が順番に眼の低眼圧症とにつながる創傷裂開の原因であってもよく、維持するために10分 - 潤滑剤は、すべての5を追加する必要があります/またはsclerotomiesから術中の漏れ。ヘパリンは、ヘパリン16の下出血を減少させるためにエピネフリンを加える同時に挑戦特に網膜下注入を行い、フィブリン膜の形成を防止するために添加されるべきです。あまりにも長い間ヘパリン/エピネフリンの露光時間（> 1時間）は、角膜EDEを防ぐために避けるべきです内皮代償33、高血圧性危機や術中の死亡によってミリアンペア。細心の硝子体の除去は、網膜および/または脈絡膜剥離を回避するために、機器（エントリー）ポートで実行されなければなりません。眼内の機器は、レンズタッチ（医原性白内障の形成を引き起こす）または（侵入部位）網膜の損傷を避けるために、後極に向かって指摘されるべきです。それは、このように制御されていない網膜切開の引き裂き、そしてBRDの崩壊を防止し、注入領域の周囲にジェット気流を減衰させるような眼内側ポート注入カニューレは、使用されるべきです。 BRD正中線における誘導（視神経から縦軸）や視神経髄繊維に近い大規模な医原性網膜剥離を防ぐために避けるべきです。最後に、最後が、少なくともBRDが網膜の損傷につながる可能性があり、過度の流量を使用して（ 例えば 、延伸により）網膜下BSS注入を避けるために、低IOPで誘導されるべきではありません。
このような細胞キャリーなどの多くの研究変数r個の変異体、胎児、成人または幹細胞由来のRPE細胞源、免疫抑制のための選択肢は、 など 。、14,26,27,34を検討することができます。このような無血清RPE培養法、網膜下腔におけるxenoRPEの特性、インプラント足場用のホストRPE層14や戦略の除去などのさらなる改善は、進行中の現在の仕事です。
記載された技術は、チンチラの野郎、チンチラろくでなし/ KBLハイブリッド、ニュージーランドホワイト/赤十字、ニュージーランドホワイト（アルビノ）とオランダのベルトを含む5種類のウサギ株、上で使用されてきた今日まで。雄と雌のウサギの両方が（種に依存）、ウサギ、少なくとも1.5キロや年齢の2ヶ月で、操作されました。 3キロ - ほとんどの手術は2.5間の重みで着色されたウサギ（チンチラろくでなしまたはチンチラろくでなしハイブリッド）にありました。
私たちが仕事をする機会を持っていたウサギの株のすべては、いくつかの特殊性を持っているように思われます。 exclusを考えます2009-13におけるドイツのチンチラろくでなし株の着色されたウサギのアイブの可用性は、我々は、これらの動物で最も経験を収集しています。残念ながら、それは繁殖が中止されているので、使用できなくなりましたが、後者でより有利な厚い強膜とより大きな目のボリューム以外のニュージーランドホワイト/赤十字に非常によく比較されます。チンチラろくでなしハイブリッドは重要な術中フィブリン形成を有しており、上記のように成功した網膜下操縦を確保するために、ヘパリン/エピネフリンの使用を必要とします。このプロトコルはまた、非着色アルビノウサギ（ニュージーランドホワイト）で行わしかし、特にBRD作成および網膜下注入が減少し、コントラスト感謝与えられたより挑戦的であるされています。後部硝子体剥離を誘発する可能性は、私たちの手に依存ウサギ株を思えませんでした。
Transvitreal網膜下の配信は、おそらくそれが最もCOMMある与えられた選択肢の将来の外科的戦略でありますルート上に、今日臨床的に網膜にアクセスします。その結果、多くの他のグループは、キャリア上で培養RPEのためのこのような技術を提示してきたように、動物の作業11,15,23,35に対応しています。 Aramant ら 36は、配置ではなく、その網膜下の標的部位へのハイドロゲルカプセル化ソフトインプラントをプッシュ楽器を、持っています。トゥマンらの設計は。流体注入19を介してそれを浮遊させることによって、キャリア・サポートグラフトを解放中空へらを利用します。どちらも前者の戦略はepiretinally appositioned楽器と比較した場合、我々の見解では、合併症になりやすいです楽器の網膜下挿入を必要とします。モンテスマら 22は、ブタの網膜下チップインプラントの送達のための網膜下挿入器具を説明したが、それ以上の仕事は、私たちの知る限り以降に発行されていません。私たちは、豚にいくつかの変更で説明した手法を拡張することができました。
jove_content ">我々の好ましい細胞キャリアは10ミクロンの厚さのポリエステルテレフタレート（PET）膜である。外科的な観点から、この物質は、細胞培養実験中のその広い汎用性に加え、良好な剛性と弾力性のパラメータを持っている。我々が展開テトラフルオロエチレンで同じような経験を発見しました37またはナノファイバー膜PET、ポリ乳酸/ capronolactic酸（PLCL）またはポリからエレクトロスピニング（ePTFEの） - 。乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）、ならびに複合ナノファイバー（PLGAまたはPET）と極薄PET 26た場合PET膜は、当社の金属製のシューティングゲーム機器で使用され、それらはシューター27から自分の噴出に挑戦静電荷を、発揮する臨時の傾向を持っています。超薄ポリイミド膜は私たちの手で上に概説したプロトコルで網膜下腔に移植することができませんでした（原稿準備中）。Marmor ら 。体系的に自発的なRESOを検討してきました医原性局所的な網膜剥離における網膜下液のrption 38-41。網膜下腔であっても、次の操作は、これらは平穏の手術で、術後4日目までに再吸収されることが見出されました。レーザー網膜復位は網膜切開の縁を固定するために実行されません。直感に反する人間の手術と比較した場合が、空気/ガスタンポナーデは必要ありません。周辺硝子体の綿密な除去を達成することができない限り、特に優れた象限に、これは、実際に網膜切開部位由来の巨大網膜裂傷を生じ得ます。唯一の術中医原性網膜剥離または特定のインプラントの位置を確保する必要がある場合にをサルベージするために、後続の20％SF6ガスタンポナーデと流体空気交換を行うことを推奨します。
神経網膜の機械的に誘発されるアブレーションはウサギ42,43にRPEと光受容体の損傷を引き起こす可能性がありますが、その程度は（たとえ正規のBSSで）大きく変動するデこのような等引き伸ばし、それによって誘発された網膜で使用IOP、シリンジタイプ、注入量、などの要因に保留中。我々はまた、多くの場合、お勧めのCa / Mgを無料でBSSが剥離42-44を容易にテストしたが、それは（特に高温で）術中レンズ混濁の原因となり、大幅に遅延させ、さらには、網膜再付着27を損なうことを見出しました。 20のスロー網膜下注射 - 100μlの注射器との定期的なBSS30μlの体積は、したがって、お勧めします。注射針の動きはその周り網膜切開のシールので、最小限であるとブルッフ膜の損傷を防ぐ必要があります。医原性損傷のいくつかは、RPE、創傷治癒、および再付着後のONL厚さの観察された相対的な保全することによって解決することができる、また、他の人45によって記載されているようにRPE /感光体複合体は、この障害に耐えることができることを示唆しています。
細胞ベースの治療薬または網膜補綴物は、前臨床アニマを必要としますリットル試験前規制当局の承認にと人間の安全性試験を開始します。前者は国によって異なります。ここで説明するウサギモデルが確立、あるいは規制当局によるすべての要件を実施するためのコスト効率の高い、より少ない困難なプラットフォームとして機能することができます。また、その後、道に沿って、最終的な多施設臨床試験や技術のさらなる改善に外科医のトレーニングのために働くことができます。
Disclosures
RB、BVS、ZL、NEとGeuder AGはシューターに、欧州特許出願しています。 NBはGeuder AGの従業員です。このビデオの記事のための出版手数料はGeuder AGによって支払われました。
Acknowledgments
2008＆2010（BVS）、BONFOR /ゲロク奨学O-137.0015（BVS）、BONFOR /ゲロク奨学O-137.0019（FT）、ドイツ学術協会/ DFG（BVS）STA 1135 / 2-1、中国語でリュディガー財団補助金によってサポートされています奨学金評議会第2008627116（ZL）とGeuder AG、ハイデルベルク（図2）によって無制限の助成金。 H. Skottmanの研究室、タンペレ、フィンランドの大学のメンバーは感謝して、図2に示すRPEをhES由来を提供するために認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75 L |
| DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23 L |
| Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1 |
| Needle | BD | 305196 305136 |
18 G x1 27 G x5 |
| Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
| Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60 x 40 cm x2 12 x 17 cm |
| Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66 x 5 mm |
| Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
| Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
| Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
| Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25 G incl. trocar |
| Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
| Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
| Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23 G |
| Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
| Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 23 G x1 |
| 3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
| Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
| Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
| Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x 23 G 1x 20 G |
| 7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
| Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
| Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
| Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
| Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41 G |
| VR scissor | Geuder | G-36542 | 25 G |
| Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23 G |
| Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23 G |
| Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
| Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
| Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
| Flute needle | DORC | 1281.SD | 20 G (Vacuum) |
| Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100 µl |
| Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg Engineering |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
| Drugs and solutions | |||
| Name | Company | Active agent | Comments |
| Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2 L |
| Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2 L |
| Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10 ml (100 mg/ml) |
| Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10 ml (1 mg/ml) |
| Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10 ml (5 mg/ml) |
| Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10 ml |
| Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10 ml (5 mg/ml) |
| Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10 g |
| PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500 ml |
| Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100 ml |
| Heparin-Natrium-25,000 | Ratiopharm | Heparin | 5 ml (2,500 unit/ml) |
| Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1 ml (1 mg/ml) |
| Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1 ml (40 mg/ml) |
| Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10 ml |
| Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30 ml (1 g/10 ml) |
| Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10 ml |
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