Summary
Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.
Abstract
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinitis pigmentosa, en andere RPE gerelateerde ziekten zijn de meest voorkomende oorzaken van onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen van volwassenen in industrieel ontwikkelde landen. RPE transplantatie lijkt een veelbelovende therapie, aangezien het disfunctioneel RPE kan vervangen, de functie en daardoor herstellen visie.
Hier beschrijven we een methode voor het transplanteren van een gekweekte RPE monolaag op een steiger in de subretinale ruimte (SRS) van de konijnen. Na vitrectomie xenotransplantatie werden afgeleverd in de SRS met behulp van een op maat gemaakt shooter, bestaande uit een 20-gauge metalen mondstuk met een polytetrafluorethyleen (PTFE) gecoate zuiger. De huidige techniek evolueerde in meer dan 150 konijnen operaties meer dan 6 jaar. Post-operatieve follow-up kan worden verkregen met behulp van niet-invasieve en repetitieve in vivo beeldvorming, zoals spectrale domein optical coherence tomography (SD-oktober), gevolgd door perfusie gefixeerd histologie.
the methode heeft duidelijk omschreven stappen voor het eenvoudig leren en hoog slagingspercentage. Konijnen worden beschouwd als een groot oog diermodel bruikbaar in preklinische studies voor klinische toepassing. In dit verband konijnen kostenefficiënt en misschien gemakkelijk alternatief voor andere grote gaten diermodellen.
Introduction
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de meest voorkomende oorzaak van slechtziendheid bij volwassenen in industrieel ontwikkelde landen 50 jaar of ouder, zoals het verlies van het centrale zicht veroorzaakt. Ongeveer 15% van deze patiënten lijden aan de "natte" vorm van de ziekte, waarbij neovascularisatie afkomstig van het vaatvlies en verstoort de retinale functie 1. Deze variant kan worden behandeld door een zeer effectieve therapie met herhaalde intra-vitreale injecties van antiangiogene drugs 2. De overgrote meerderheid van de patiënten (~ 85%) lijdt de droge vorm, die wordt gekenmerkt door extracellulaire afzettingen (bijvoorbeeld drusen) onder het retinale pigmentepitheel (RPE). Deze afzettingen veroorzaken RPE disfunctie leidt tot retinale atrofie in de macula. Gezien het ontbreken van een curatieve therapeutische opties, AMD zich ontwikkeld tot een intensief ontwikkeling van onderzoek gebied, waar veel verschillende curatieve therapeutische benaderingen worden getest. Chirurgische RPE vervangingeen aantrekkelijke toekomstige mogelijkheid om deze slopende ziekte 3 verslaan.
Autologe transplantatie subretinale RPE vervangt disfunctioneel of verloren RPE in macula, en heeft het potentieel om de fysiologische functie 4-9 herstellen. Deze chirurgische techniek had een doorbraak bij de ontwikkeling van RPE protocollen differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), waardoor de wetenschapper een onbeperkte bron van cellen voor transplantatie RPE 10. RPE transplantatie wordt nu erkend als een aantrekkelijke first-in-toepassing op de mens voor stamcellen afgeleid geneeswijze. Het oog biedt een uitstekende chirurgische toegang en verfijnde in vivo monitoring tools 11-13.
Om de RPE te transplanteren, een manier is met een minimaal invasieve levering met behulp van een cel suspensie, als alternatief, om beter te bewaren RPE karakteristieken en transplantatie-functie, kunstmatige carrier substrAtes (scaffolds) voor RPE vervanging worden overwogen 4,14,15. Grote diermodellen nodig zijn voor preklinische validatie, maar toch gedetailleerde technische informatie over dierlijke behandeling en chirurgische techniek ontbreekt tot op heden 16-23.
Wij en anderen 11,24 hoewel er aanwijzingen van het tegendeel 25, suggereren het gebruik van een stijf doch elastisch dragersubstraat omdat het werk veiliger, behoudt monolaag integriteit en functionaliteit. Na verloop van tijd hebben we een aantal speciaal ontworpen instrumenten en aanverwante technieken getest op de implantatie van cel-carrier ondersteund RPE transplantaties in de subretinale ruimte (SRS). We gebruik gemaakt van intra-operatieve video-opnamen, in vivo scanning laser Ophthalmoscopie gecombineerd met spectrale domein optical coherence tomography (SLO / SD-oktober), en histologie aan de implantatie succes 14,26,27 te evalueren. Hier bieden wij onze huidige aanbeveling voor subretinale RPE implantaten bij konijnen,die werden getest in 5 verschillende konijnen stammen, 7 cel dragermaterialen en 4 RPE celbronnen in meer dan 150 procedures.
Protocol
Ethiek van de behandeling van dieren in oogheelkundig onderzoek: We verkregen goedkeuring van de ethische commissie van de Medische Faculteit van de Universiteit van Bonn, en zich te houden aan de aangegeven door de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde (ARVO) richtlijnen. Bovendien werden alle procedures goedgekeurd door de staat regelgevende instanties van Noord-Rijnland-Westfalen. De dieren werden binnenshuis gehouden in een gespecialiseerde faciliteit in een kamer met airconditioning met temperaturen tussen 18 - 20 ° C, blootstelling aan reguliere daglicht, in een gestandaardiseerde individuele kooien met vrije toegang tot voedsel en water.
Opmerking: Om de dieren te waarborgen operatieve affiniteit wordt een dier gezondheid scoreblad gevolgd waarin de volgende definitieve dier uitsluitingscriteria bestaat uit: 20% gewichtsverlies in vergelijking met het gewicht van de toelating; schijnbare cyanose van het dier; dier rillingen, heeft krampen of niet kunnen bewegen in coördinatie; . ataxie / paresthesie, bijvoorbeeld, verlamt; apathie; extreme automutilatie (huidwonden, afgehakte ledematen).
</ P>
1. Instrument Sterilisatie
- Plaats de herbruikbare instrumenten in ultrasoonbad.
- Voeg 500 ml gedestilleerd water en 2 ml instrument desinfectiemiddel.
- Clean instrumenten gebruiken sweep-functie voor 15 min.
- Verwijder instrumenten uit ultrasoon bad en spoel grondig met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Plaats instrumenten in een autoclaaf en het gebruik van het standaard programma (sterilisatie van de instrumenten in het kader van 121 ° C gedurende 20 min).
2. Instrument Voorbereiding
- Opzetten en onderhouden van een steriel veld, door te werken in een afgesloten ruimte, het dragen van chirurgische scrubs, masker en haren te bedekken. Ontsmet uw handen voor het dragen van steriele chirurgische handschoenen. Voor gedetailleerde aanpak te zien 28.
- Plaats gesteriliseerde instrumenten op een steriel laken.
- Plaats 1 ml injectiespuit gevuld met 40 mg triamcinolon bevestigd aan een 27 G naald voor injectie, 10 ml spuit met Balance zoutoplossing (BSS) en 5 ml spuit of glijmiddel op laken.
- Plaats 3-0 zijde, 7-0 Vicryl, oculaire sticks (tot conjunctivale / sclerale bloeden te stoppen), twister gaas sponzen, wondsluitstrips (de vitrectomie tip buis fixeren), en kroonluchter endoillumination fiber draad op een laken.
- Uitpakken 25 G kroonluchter endoilluminator en verbinding maken met lichte machine met behulp van steriele technieken (zie stap 2.1). Sluit vitrectomie set inclusief high speed vitrector en Venturi cassette om vitrectomie machine met behulp van steriele technieken (zie stap 2.1).
- Open 500 ml BSS flesje en sluit oplossing Venturi Cassette volgens instructies van de fabrikant.
3. Voorbereiding van anesthesie en positionering van de Animal
- Weeg dier nauwkeurige medicatie dosering te verzekeren.
- Bereid intramusculaire (IM) verdoving met behulp van 1 spuit met 27 G naald met 0,35 mg / kg ketamine en 0,25 mg / kg medetomidine voor de start. Flip de spuit te mengen.
- Bereid 2 spuiten met 1/3 tHij doseert de anesthesie tijdens de operatie te handhaven.
- Bereid spuit met 20 ml van 5% glucose-oplossing en 18 G naald voor subcutane injectie als een intraveneuze infusie alternatief.
- Geef 3 x 1 druppel mydriatische oogdruppels voorafgaand aan vitrectomie voor pupil dilatatie.
- Cover konijn met een deken om te kalmeren voordat verdoving injectie, te injecteren in de achterste ledematen (bilspier) en massage rond de plaats van injectie gedurende 30 sec.
Opmerking: Het eerste schot van IM verdoving duurt ongeveer 1-2 uur. Afhankelijk van het konijn omvang, geneesmiddeltolerantie, vetlaag, stress en lichaamstemperatuur. Het eerste teken van de narcose vervagen is een nystagmus (moet worden gecontroleerd door de chirurg), de volgende injecties duurt ongeveer 30 - 45 min. - Bevestigen juiste verdoving, door na te gaan hypnose, hyporeflexie, analgesie en spierverslapping van het dier.
- Geef subcutane injectie (Pt. 3.3) in de nek huidplooi, zodra het konijn is bewusteloos.
- methylc toevoegenellulose smeermiddel elke 5-10 min in geopereerde oog, voeg smeermiddel en tape deksels in niet-geopereerde oog.
- Plaats de bedekte konijn op de operatietafel bedekt met een afdekking, zoals een katoenen deken in een optimale positie (neus enigszins verhoogde door een mal van de deken, zodat het niveau oogoppervlak) voor chirurgische microscoop. Lijn oog loodrecht doel microscoop.
- Zorg voor een goede kerntemperatuur van het lichaam met behulp van rectale thermometer (normothermia 39 ± 1 ºC) 29.
- Cut wimpers met een schaar (wat zalf op blade) om postoperatieve infecties te verminderen.
- Ontsmet het oog via 2-3 druppels 0,1 g / ml povidonjood topicaal gedurende 1 min en spoel met steriel BSS.
- Bedek oog met steriele doek met voorgesneden opening in het midden voor het oog en dek af met (sticky) incisie afdekdoek 12 x 17 cm.
4. Vitrectomie
- Proptose en veilige oog met 3-0 zijde met behulp van inverted remklauw en het uitvoeren van een conjunctivale peritomy.
- Incise het bindvlies met een Vannas schaar dicht bij limbus maar ver genoeg van de bloedvaten (~ 1 mm afstand).
- Ontleden het bindvlies door een "T-cut". Eerst vergroten peritomy de schaar parallel limbus en conjunctiva incisie de verticaal in de vorm van een "T" ca. 6-7 mm. scheiden het bindvlies zorgvuldig botweg.
- Voer een sclerotomie met behulp van een 23 G microvitreoretinal (MVR) mes om 8 uur op rechteroog / OD (04:00 op linkeroog / OS) door voorzichtig het plaatsen van de scherpe punt van het mes in de richting van de oogzenuw. trekken langzaam het mes in dezelfde richting en te voorkomen dat de uitbreiding van de sclerotomie.
- Invoegen en hechtdraad op maat zijpoort-infusie canule 27 met behulp van 7-0 zijden hechtdraad en zet de intra-oculaire druk (IOD) bij 24 mmHg.
- Voer een sclerotomie 25 G platte kop trocart om 2 uur op OD (10 o '; Klok op OS) zoals in stap 4,2.
- Plaats 25 G kroonluchter licht in platte kop trocar, fixeer met plakband en zet de lichtbron op ca. 30%.
- Indien nodig, verwijder edematous hoornvliesepitheel met behulp van een # 20 scalpel voor een betere intra-oculaire visualisatie.
- Voer een sclerotomie vergelijkbaar met stap 4.2 om 10 uur op de OD (02:00 op OS), (pre-) plaats U-vormige 7-0 hechtingen rond sclerotomie zonder binden van de knoop, en steek vitrectomie snijder tip.
- Begin vitrectomie 30 rond de ingangspoort, dan verder over de optische schijf en de fibrae medullares met behulp van high speed vitrector door het snijden van het glasvocht in kleine stukjes bij max. 2000 - 3000 delen / min, opzuigen bij max. 200 mmHg met de genoemde parameter setup van de vitrectomie machine (tabel 1)
- Voer een glasvochtloslating (PVD) door het scheiden van het glasvocht van het netvlies door het houden van de hoge snelheid vitrector over de achterste paal eennd (indien mogelijk voorzichtig) overste van de schijf 31, terwijl aspireren alleen bij max. 200 mmHg zonder te snijden.
- Injecteer ca. 50 ul (20 mg) triamcinolon of verdund fluoresceïne (ca. 0,1 mg / ml) intravitreaal om verwijdering van de zwevende glaslichaam via achterpool en midperiphery visualiseren en te vergemakkelijken (bij totaal) tijdens vitrectomie. Vermijd oversteken onder de lens. Inspringen perifere glasvocht scheren door een (ervaren) assistent wordt aanbevolen als gas tamponnade gewenst is.
- Voeg 20 eenheden / ml heparine en 0,5 mg epinefrine om uiteindelijke concentratie van 0,001 mg / ml in de BSS infusieoplossing parallel of na stap 4,10.
Let op: Als heparine / epinefrine niet intra-oculaire worden geïnjecteerd hun effecten zijn vertraagd, afhankelijk van infusie debiet.
5. Laden Shooter
Let op: De hierin beschreven werk valt niet onder de principes van de Verklaring van Helsinki vallen; het niet menselijke patiënten te betrekken. Hier, standard RPE cellen werden geïsoleerd uit foetale menselijke ogen, gekweekt en gedifferentieerd op ongecoat 10-um-dikke polyesterfilm (PET) inzetstukken volgens onze eerder gepubliceerde protocol 14. Een toestemming om te werken met de humane foetale materiaal werd verkregen van de ethische commissie van de Universiteit van Bonn. Als alternatief hES-RPE werden verscheept van de Skottman lab (manuscript in prep.), Waar ze werden gekweekt volgens de beschreven door Vaajasaari et al techniek 32.; voor deze cellen een toestemming is verkregen van de R. Koch Instituut, Berlijn, Duitsland.
- Spoel celkweek voorafgaand aan de voorbereiding van het implantaat 3x met oogheelkundige kwaliteit BSS.
- Vul een standaard celkweek schotel (100 x 20 mm) met 10 ml oogheelkundige leerjaar BSS.
- Voeg de celkweek inzetstuk in de BSS en centreren de schotel onder een lichtmicroscoop.
- Pons een 2,4 x 1,1 mm implantaat met een stompe, ovaal, op maat gemaakte naald op een vlakke, boonvormige substraat te verkrijgenmet twee lange randen en twee ronde randen.
- Voorzichtig overspoelen de naald door de tweede poort met BSS voor het spoelen van het implantaat in de BSS gevuld maat gemaakte laadstation (figuur 1).
- Optioneel snij een ronde uiteinde van het implantaat (<0,5 mm), om er maar een derde rand te verkrijgen.
- Zorg ervoor dat het implantaat in de juiste richting door te verzekeren dat de monolaag ondersteboven op de celdrager. Om te veranderen positioneren zorgvuldig gebruik maken van twee scalpels.
- Duw het implantaat voorzichtig en volledig in de schutter instrument met de naaldhouder totdat alle implantaat binnenkant van de punt is bevestigd. De plunjer moet blijven teruggetrokken.
- Houd de "geladen" shooter tip in laadstation onder BSS tot het moment van de implantatie.
6. Implantatie
- Aanpak neurale retina met uitschuifbare 41 G subretinale injectienaald verbonden met een gasdichte injectiespuit (ervoor zorgen dat alle luchtbellen zijn geëvacueerduit een buis!).
- Injecteren BSS (met calcium en magnesium / CM) subretinally en daardoor een blaar netvliesloslating (BRD) van ongeveer 2 te maken - 3 disc diameter (DD). Twee BRD per oog kan veilig worden verhoogd.
- Vergroot retinotomy tot 1,5 mm met verticale 23 G VR-schaar. De subretinale ruimte is nu toegankelijk voor implantatie of verdere manoeuvreren.
- Extend sclerotomie (precies) met een 1,4 mm incisie mes om 20 G aanpak.
- Poging die door de sclerotomie met behulp van een 20 G shooter dummy, te vergroten als nodig is om een soepele, maar toch knus overgang van het geplaatste shooter te verzekeren.
- Pas met de geladen shooter 27 tot sclerotomie idealiter op 24 mmHg.
- Aanpak retinotomy rand en verwijder het implantaat subretinally vanuit een epiretinaal positie.
- Stel het implantaat met halfgesloten 23 G schaar, pincet of 41 G-naald om zeker te zijn is goed gepositioneerd onder de retina- redelijk weg van de retinotomy.
7.Ending Operation
- Verwijder 25 G kroonluchter en infuuscanule.
- Hechten alle sclerotomies.
- Injecteer 25 pi (10 mg) triamcinolon door 08:00 sclerotomie (vóór hechten laatste sclerotomie).
- Controleren / afstellen IOP door palpatie en injecteer BSS via 30 G naald / spuit, indien nodig.
- Suture bindvlies met 7-0 Vicryl.
- Verwijder proptosing 3-0 zijde sling langzaam (Vermijd diep orbitale veneuze plexus!).
- Voeg dexamethason / antibiotische zalf onder deksel.
- Positie 1 uur bedekt met deken geopereerde oog naar boven (w / o gas) of omlaag (met lucht / gas).
- Do dier onbeheerd niet verlaten totdat het voldoende bewustzijn borstbeen recumbence handhaven herwint.
- Do konijn niet vervoeren voor de verdoving volledig verdwijnt, kan deze worden versneld door het injecteren van medetomidine omkeren middel gelijk aan hoeveelheid medetomidine gegeven.
8. Post-operatieve Animal Care
- Houdenkonijnen onder geschikte omstandigheden (temperatuur, licht, voedsel, water, ruimte, enz.) en nauwlettend toezicht in een gespecialiseerde faciliteit.
- Zorg ervoor dat dier is goed uitgerust, dwz., Geen uitgebreide periodes van voedsel of water ontbering.
- Kijk voor eventuele wonden of verwondingen, vooral op injectieplaats.
- Houd wonden droog om infecties te voorkomen. Antibiotica geven wanneer infectie wordt vermoed: dexamethason 1 mg / g, neomycinesulfaat 3500 IU / g, polymyxine B sulfaat 6000 IU / g zalf werd tweemaal per dag gedurende 1 week postoperatief aangebracht op het oogoppervlak.
- Voeg dexamethason / antibiotische zalf voor de komende 7 dagen na de operatie twee keer per dag voor een betere oculaire oppervlak regeneratie en minder postoperatieve pijn.
- Geef systemische analgetica (Carprofene 4 mg / kg tweemaal daags) voor de eerste 48 uur.
- Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen aan borstbeen recumbence handhaven.
- Heeft een dier niet terug datheeft een operatie ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
- Hebben dieren niet bloot aan onnodig leed.
9. SLO / SD-oktober Guidance
- Voor te bereiden en te injecteren intramusculaire (IM) verdoving met behulp van 1 spuit met 27 G naald met 0,175 mg / kg ketamine en 0,125 mg / kg medetomidine voor de start. Flip de spuit te mengen.
- Voeg een smeermiddel tenminste elke 5 min in oog hydrateren en om vrijer SD-oktober imaging, eventueel een aangepaste contactlens kan worden gebruikt.
- Bevestig een stalen platform aan de hoofdsteun aan het dier stabiliseren in de gewenste positie.
- Plaats konijn op stalen platform, het plaatsen van zijn oog loodrecht op probe.
- Houd het hoofd van het konijn van de lagere jukbeen (mandibula), het vermijden van de luchtpijp.
- kanteling van het hoofd dier met ongeveer 45º naar de SD-oktober sonde naar de kijkhoek op het implantaat te optimaliseren.
- Gebruik een 30-graden lens en de volgende parameters voor optiMAL oktober imaging [HS]: 30 graden instellingen voor enkele lijn scant met ART-modus ingesteld op 100 (gemiddeld) en 20 x 20 graden instellingen voor volume scans met ART-modus ingesteld op 15; hoge resolutie-modus is niet noodzakelijk.
- Gebruik SLO infrarode reflectantie beeldvorming om het brandvlak van het implantaat (fig. 2A) vinden; optimale scherpstelling wordt bereikt wanneer (alle) het implantaat randen zijn scherp 14.
- Voeg dexamethason 1 mg / g, neomycine sulfaat 3500 IU / g, polymyxine B-sulfaat 6000 IU / g zalf onder deksel als u klaar bent.
Representative Results
De resultaten van de beschreven werkwijze voor implantatie subretinale zijn in Tabel 2 getoond Engraftment onder het netvlies had een succespercentage van ongeveer 61% bij een kern vitrectomie werd uitgevoerd en steeg tot 76%, bij glasvochtloslating geïnduceerd. Deze cijfers omvatten ca. 21% van de dieren die ofwel intra-operatief of in de eerste postoperatieve 3 dagen stierven. Deze techniek kan worden gebruikt om twee steigers op verschillende gebieden gelijktijdig retinale implantaat in een oog.
De konijnen ondergingen postoperatief in vivo opvolging via SD-OCT en histologische verwerking zoals beschreven door Stanzel et al. 27 (figuur 2). Fig. Scanning laser oftalmoscoop infrarood reflectie beeld van geïmplanteerde gekweekt RPE op een polyester membraan (PET) 2A toont na een ongecompliceerde transplantatie. Dehalo rond implantaat correspondeert met atrofie fotoreceptor. Fig. 2B toont corresponderende SD-oktober, bericht het netvlies, vooral de buitenste nucleaire laag (ONL) dunner, hyper reflecterende band op SD-oktober boven implantaat, terwijl de neurale netvlies aangrenzend aan het implantaat toont bijna normale reflectie bands. Deze resultaten suggereren een atraumatische aflevering. Fig. 2C Hematoxiline / eosine (H / E) kleuring van de implantaten die subretinale littekens en ONL atrofie rond de retinotomy plaats waarschijnlijk het gevolg van iatrogene manipulatie toont een aaneengesloten maar onregelmatig gepigmenteerde laag over PET. Membraan van Bruch onder het implantaat bleek ook aaneengesloten te zijn, en de choriocapillaris bevat enkele verspreide erytrocyten. Deze morfologische resultaat zijn vergelijkbaar met de SD-oktober en versterking van de thesis van een atraumatische aflevering.
vijg ure 1: Laden Shooter met Human iPSC-RPE gekweekt op PET Cell Carrier. A) toont ponsen uit een implantaat met behulp van op maat gemaakte naald. B) Bean-vormige implantaat gesneden uit celkweek. C) Positionering van het implantaat vóór het laden. D) Laden van shooter met implantaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Figuur 2: gekweekte humane hES-RPE op PET Cell Carrier 4 weken in Rabbit Subretinal Space. A) image infrarood reflectie SLO Shows, de groene lijn markeert de dwarsdoorsnede getoond in Fig. 2B. B) Overeenkomstige SD-oktober C) H / E vlek, zie tekst of 26,27 voor meer informatie.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameter | gebruikte instellingen |
| vitrectomie | 6000 sneden / min |
| Vacuüm | 200 mmHg |
| Rise tijd | 1 seconde |
| Lucht | 24 mmHg |
| Irrigatie | 24 cmH 2 O |
| DiathErmy | 30% |
Tabel 1: Parameter Instellen van de vitrectomie Machine.
| vitrectomie | Implant | konijnen bediend | succesvolle implantaat | gefaald implantaat | Dood | Slaagkans% |
| Core vitrectomie | PET | 30 | 19 | 4 | 7 | 63.33 |
| PET + RPE | 70 | 42 | 12 | 16 | 60 | |
| PVD, ± plasmine w / PPV | PET | 28 | 21 | 2 | 5 | 75 |
| PET + RPE | 22 | 17 | 2 | 3 | 77,27 |
Tabel 2: Samenvatting van de laatste 150 activiteiten, waaronder Methode en Implant Type.
Discussion
Met behulp van een konijn model, is een veilige en reproduceerbare methode gepresenteerd voor transvitreal levering van gekweekte RPE op mobiele dragers in de subretinale ruimte met een op maat ontworpen shooter instrument. De beschreven methode biedt een korte / geoptimaliseerd chirurgische techniek voor het eenvoudig te leren, omdat het gaat om standaard technieken bij vitrectomie met subretinale manoeuvres. Uitkomst wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door een schone vitreoretinale interface en intra-oculaire infuus dat vloeistof turbulentie vermijdt over de implantatie, het induceren van bleb netvliesloslating (BRD) bij lage IOP, het voorkomen van netvlies en schade sclera door de droogte en de juiste positionering van het konijn.
Wij waarschuwen Aangezien verscheidene intra-operatieve complicaties allen tijde voorkomen, belemmeren het succes van de implantatie, bijvoorbeeld intra- oculaire bloedingen, anaesthesie vervagen in essentiële stappen zoals de implantatie inklappen van BRD vanwege instrument manipulatie of oculaire hypotonie, rAbbit overlijden als gevolg van overmatige doses van de anesthesie, lage bloeddruk tijdens lange operatie waardoor hypoxische hersenschade of hyperthermie. Maar deze complicaties af met de tijd als ze snel worden aangepakt en opgelost door het verhogen van de ervaring van het chirurgisch team.
Sommige complicaties zou kunnen worden verminderd door het volgen van een paar eenvoudige, maar cruciale stappen. Smeermiddel worden toegevoegd om de 5-10 min cornea, sclera en conjunctivale beschadiging tijdens gebruik te voorkomen, en het handhaven van een duidelijke intraoculaire media, kan gedroogde / zwart sclera oorzaak van wonddehiscentie, wat leidt tot oculaire hypotonie en zijn / of intra-operatieve lekkage van sclerotomies. Heparine moet worden toegevoegd om de vorming van fibrine een film die bijzonder subretinale implantatie uitdagende en tegelijk toevoegen van epinefrine verminderen bloeden onder heparine 16 maakt voorkomen. Te lange heparine / epinefrine belichtingstijden (> 1 uur) te worden vermeden cornea ede voorkomenma door endotheliale decompensatie 33, hypertensieve crisis of intra-operatieve fataliteit. Nauwgezet glasvocht verwijderd dient te worden uitgevoerd op instrumenten (ingang) poort aan het netvlies en / of choroïdale detachementen te voorkomen. Intra-oculaire instrumenten moeten worden wees in de richting posterior pool tot lens touch (oorzaken iatrogene cataract) of (post ter plaatse) schade aan het netvlies te voorkomen. Een intraoculair zijpoort infusiecanule worden gebruikt, omdat het vermindert de straalstroom rond het implantatiegebied, waardoor ongecontroleerde scheuren van de retinotomy en ineenstorting van de BRD voorkomen. BRD inductie in de middellijn (verticale as van de oogzenuw) of in de buurt van optische vezels medullaire moet worden vermeden om uitgebreide iatrogene netvliesloslatingen voorkomen. Ten slotte, last but not least BRD moet worden geïnduceerd bij lage IOP, om subretinale BSS injectie te vermijden gebruik van buitensporig debieten die kunnen leiden tot schade aan het netvlies (bijv., Door rekken).
Veel onderzoek variabelen zoals mobiele carrier varianten, foetale, volwassene of stamcel afgeleid RPE cel bronnen, keuzemogelijkheden voor immunosuppressiva, enz., kan worden verkend 14,26,27,34. Verdere verbetering zoals serum-vrij RPE kweekmethoden, karakterisering van xenoRPE in subretinale ruimte, het verwijderen van de gastheer RPE laag 14 of strategieën voor het implantaat verankering zijn de huidige work in progress.
Tot op heden zijn de beschreven technieken zijn gebruikt op 5 verschillende konijn stammen, met inbegrip van chinchilla bastaard, Chinchilla bastard / KBL hybriden, Nieuw-Zeeland White / Rode Kruis, Nieuw-Zeeland White (albino) en Nederlands gordel. Zowel mannelijke als vrouwelijke konijnen werden geopereerd met konijnen tenminste 1,5 kg of 2 maanden (afhankelijk van soort). De meeste operaties waren op gepigmenteerde konijnen (chinchilla bastard of chinchilla bastaard hybriden) met gewichten tussen 2,5-3 kg.
Al het konijn stammen hebben we de kans om te werken met moesten lijken sommige eigenaardigheden hebben. Gezien de exclusive beschikbaarheid van gepigmenteerde konijnen van de chinchilla bastard stam in Duitsland in 2009-13, hebben we de meeste ervaring met deze dieren verzameld. Helaas is niet meer beschikbaar omdat de fokkerij is stopgezet, maar steekt zeer goed Nieuw Zeelandse witte / Rode Kruis behalve voordeliger dikker sclera en groter oog volumes in de laatste. Chinchilla bastard hybriden hebben aanzienlijke intra-operatieve fibrine vorming en vereisen heparine / epinefrine gebruik zoals hierboven beschreven om ervoor te zorgen succesvolle subretinale manoeuvres. Dit protocol is ook uitgevoerd in niet-gepigmenteerde albino konijnen (New Zealand White), echter bijzonder BRD Creatie en subretinale implantatie moeilijker gezien verminderd contrast waardering. De haalbaarheid van het induceren van een glasvochtloslating leek niet konijn stam afhankelijk in onze handen.
Transvitreal subretinale levering is waarschijnlijk de toekomst chirurgische strategie van keuze gezien is het de meest comm onderweg tegenwoordig klinisch om het netvlies. Als gevolg hiervan vele andere groepen zoals technieken hebben ingediend voor gekweekte RPE op carrier ondersteunt in dierlijke werk 11,15,23,35. Aramant et al. 36 een instrument dat in plaats plaatst duwt de hydrogel-ingekapselde zachte implantaat om haar subretinale doelplaats. Het ontwerp van Thumann et al. Maakt gebruik van een holle spatel, die de vervoerder ondersteunde implantaat releases door drijvende het uit door middel van vloeistofinjectie 19. Beide voormalige strategieën vereisen subretinale inbrengen van het instrument, dat naar onze mening is meer kans op complicaties, in vergelijking met een epiretinally appositioned instrument. Montezuma et al. 22 beschreef een subretinale inserter instrument voor de levering van subretinale chip implantaten bij varkens, maar verder geen werk is sinds om het beste van onze kennis gepubliceerd. We hebben kunnen de beschreven techniek uitbreiden enige wijziging varken geweest.
jove_content "> Ons geprefereerde cel dragers 10 micron dikke polyester (PET) membranen. Vanuit chirurgisch perspectief, dit materiaal gunstige stijfheid en elasticiteit parameters, naast de brede toepassingsgebied in celcultuur experimenten. We hebben vergelijkbare ervaringen met uitgebreide tetrafluorethyleen (ePTFE) 37 of nanovezel membranen electrospun uit PET, poly-melkzuur / capronolactic acid (PLCL) of poly -. melkzuur-co-glycolzuur (PLGA), alsook samengestelde nanovezel (PLGA of PET) en ultradunne PET 26 Wanneer PET membranen worden gebruikt ons metallic schutter instrument, ze hebben incidentele neiging tot elektrostatische lading, die het uitwerpen uitdagingen van de schutter 27. Ultradunne polyimide membranen kunnen in onze handen niet worden geïmplanteerd in de subretinale ruimte met de hierboven geschetste protocol vertonen ( manuscript in voorbereiding).Marmor et al. hebben systematisch bestudeerd spontane resorption van subretinale vloeistof in iatrogene gelokaliseerde netvliesloslatingen 38-41. Zelfs na manipulatie in de subretinale ruimte werden deze gevonden te worden opgenomen door postoperatieve dag 4 in rustig ingrepen. Laser retinopexie niet uitgevoerd om de randen van de retinotomy verzekeren. Hoewel de contra-intuïtief in vergelijking met de menselijke ingreep, wordt de lucht / gas tamponnade niet vereist. Tenzij zorgvuldige verwijdering van perifere glasachtige kan worden bereikt, met name in de hogere kwadrant, kan in feite leiden tot grote netvliesscheuren afkomstig van de retinotomy plaats. Het is alleen aan te raden om de vloeistof lucht uitwisseling met de daaropvolgende 20% SF6-gas tamponnade uit te voeren om intraoperative iatrogene netvliesloslatingen of bij een bepaalde positie van het implantaat moet worden beveiligd redden.
Hoewel de mechanisch geïnduceerde ablatie van de neurale retina en RPE fotoreceptor schade bij konijnen 42,43 veroorzaken, de omvang varieert (zelfs regelmatig BSS) dehankelijk van factoren zoals IOP, spuittype gebruikte injectievolume met daarbij geïnduceerde retinale strekken, enz. We hebben ook getest het vaak aanbevolen Ca / Mg-vrij BSS gefaciliteerd onthechting 42-44, maar vond dat het veroorzaakt intraoperatieve lens vertroebeling (met name bij verhoogde temperatuur), en aanzienlijk vertraagt of zelfs schaadt het netvlies re-bevestiging 27. Langzame subretinale injectie van 20-30 ul volume van de reguliere BSS met een 100 ul spuit wordt daarom aanbevolen; injectienaald bewegingen moet minimaal zodat de retinotomy afdichtingen rondom het zijn en het voorkomen van Bruch's membraan schade. Sommige van de iatrogene schade kan worden opgelost door RPE wondgenezing, en de waargenomen relatieve behoud van ONL dikte na herbevestiging, suggereert dat de RPE / fotoreceptor complex deze stoornis kan tolereren, zoals ook beschreven door anderen 45.
-Cellen gebaseerde therapieën of netvlies protheses nodig preklinische animal testen voorafgaand aan de reglementaire goedkeuring en de veiligheid van de mens studies te beginnen. De voormalige verschillen van land tot land. Het konijn model hier beschreven, kan dienen als een kostenefficiënte en minder uitdagend platform voor het vaststellen van of zelfs het uitvoeren van alle eisen door de regelgevende instanties. Bovendien kan zij vervolgens dienen voor de opleiding van chirurgen in de uiteindelijke multicenter klinische onderzoeken of verdere verbeteringen van de techniek langs de weg.
Disclosures
RB, BVS, ZL, NE en Geuder AG hebben een Europese octrooiaanvraag ingediend op de schutter. NB is een werknemer van Geuder AG. Publicatie vergoedingen voor deze video-artikel werd betaald door Geuder AG.
Acknowledgments
Ondersteund door Rüdiger Foundation subsidies in 2008 en 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, Chinees Scholarship Raad nr 2008627116 (ZL) en een onbeperkte subsidie door Geuder AG, Heidelberg (afb. 2). De leden van het laboratorium H. Skottman's, worden Universiteit van Tampere Finland erkentelijkheid voor het verstrekken van hES afgeleid RPE weergegeven in figuur 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75 L |
| DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23 L |
| Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1 |
| Needle | BD | 305196 305136 |
18 G x1 27 G x5 |
| Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
| Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60 x 40 cm x2 12 x 17 cm |
| Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66 x 5 mm |
| Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
| Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
| Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
| Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25 G incl. trocar |
| Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
| Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
| Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23 G |
| Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
| Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 23 G x1 |
| 3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
| Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
| Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
| Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x 23 G 1x 20 G |
| 7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
| Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
| Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
| Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
| Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41 G |
| VR scissor | Geuder | G-36542 | 25 G |
| Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23 G |
| Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23 G |
| Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
| Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
| Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
| Flute needle | DORC | 1281.SD | 20 G (Vacuum) |
| Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100 µl |
| Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg Engineering |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
| Drugs and solutions | |||
| Name | Company | Active agent | Comments |
| Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2 L |
| Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2 L |
| Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10 ml (100 mg/ml) |
| Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10 ml (1 mg/ml) |
| Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10 ml (5 mg/ml) |
| Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10 ml |
| Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10 ml (5 mg/ml) |
| Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10 g |
| PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500 ml |
| Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100 ml |
| Heparin-Natrium-25,000 | Ratiopharm | Heparin | 5 ml (2,500 unit/ml) |
| Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1 ml (1 mg/ml) |
| Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1 ml (40 mg/ml) |
| Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10 ml |
| Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30 ml (1 g/10 ml) |
| Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10 ml |
References
- Fine, A. M., et al. Earliest symptoms caused by neovascular membranes in the macula. Arch Ophthalmol. 104, 513-514 (1986).
- Lim, L. S., Mitchell, P., Seddon, J. M., Holz, F. G., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 379, 1728-1738 (2012).
- Holz, F. G., Strauss, E. C., Schmitz-Valckenberg, S., van Lookeren Campagne, M. Geographic Atrophy: Clinical Features and Potential Therapeutic Approaches. Ophthalmology. 121, 1079-1091 (2014).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res. Prog Retin Eye Res. 26, 516-554 (2007).
- da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Prog Retin Eye Res. 26, 598-635 (2007).
- Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Maculoplasty for age-related macular degeneration: reengineering Bruch's membrane and the human macula. Prog Retin Eye Res. 25, 539-562 (2006).
- Gouras, P. The retinal pigment epithelium. Marmor, M. F., Wolfensberger, T. J. , University Press. Oxford. 492-507 (1998).
- Lund, R. D., et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Prog Retin Eye Res. 20, 415-449 (2001).
- Blenkinsop, T. A., Corneo, B., Temple, S., Stern, J. H. Ophthalmologic stem cell transplantation therapies. Regen Med. 7, 32-39 (2012).
- Hirami, Y., et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458, 126-131 (2009).
- Carr, A. J., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in neurosciences. 36, 385-395 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Jha, B. S., Bharti, K. Regenerating Retinal Pigment Epithelial Cells to Cure Blindness: A Road Towards Personalized Artificial Tissue. Curr Stem Cell Rep. , 1-13 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2, 64-77 (2014).
- Hynes, S. R., Lavik, E. B. A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, 763-778 (2010).
- Szurman, P., et al. Experimental implantation and long-term testing of an intraocular vision aid in rabbits. Arch Ophthalmol. 123, 964-969 (2005).
- Bhatt, N. S., et al. Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates. Am J Ophthalmol. 117, 214-221 (1994).
- Nicolini, J., et al. The anterior lens capsule used as support material in RPE cell-transplantation. Acta Ophthalmol Scand. 78, 527-531 (2000).
- Thumann, G., et al. The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes. Biomaterials. 30, 287-294 (2009).
- Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Survival of allogeneic porcine retinal pigment epithelial sheets after subretinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 985-992 (2004).
- Pritchard, C. D., Arner, K. M., Langer, R. S., Ghosh, F. K. Retinal transplantation using surface modified poly(glycerol-co-sebacic acid) membranes. Biomaterials. 31, 7978-7984 (2010).
- Montezuma, S. R., Loewenstein, J., Scholz, C., Rizzo, J. F. Biocompatibility of Materials Implanted into the Subretinal Space of Yucatan Pigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
- Brantfernandes, R. A., et al. Safety study in Mini Pigs of transplanted Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium (hESC-RPE). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 312 (2012).
- Lu, B., Zhu, D., Hinton, D., Humayun, M. S., Tai, Y. C. Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices. 14, 659-667 (2012).
- Boochoon, K. S., Manarang, J. C., Davis, J. T., McDermott, A. M., Foster, W. J. The influence of substrate elastic modulus on retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Journal of biomechanics. 47, 3237-3240 (2014).
- Liu, Z., Yu, N., Holz, F. G., Yang, F., Stanzel, B. V. Enhancement of retinal pigment epithelial culture characteristics and subretinal space tolerance of scaffolds with 200 nm fiber topography. Biomaterials. 35, 2837-2850 (2014).
- Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 490-500 (2012).
- AORN Recommended Practices Committee. Recommended practices for maintaining a sterile field. AORN J. 83 (2), 402 (2006).
- Hong, S. B., et al. Physiologic characteristics of cold perfluorocarbon-induced hypothermia during partial liquid ventilation in normal rabbits. Anesth Analg. 94, 157-162 (2002).
- Machemer, R. The development of pars plana vitrectomy: a personal account. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233, 453-468 (1995).
- Los, L. I., van Luyn, M. J., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'alae canalis Cloqueti'. Exp Eye Res. 69, 343-350 (1999).
- Vaajasaari, H., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Iverson, D. A., Katsura, H., Hartzer, M. K., Blumenkranz, M. S. Inhibition of intraocular fibrin formation following infusion of low-molecular-weight heparin during vitrectomy. Arch Ophthalmol. 109, 405-409 (1991).
- Thieltges, F., et al. Subretinal implantation of human embryonic stem cell derived RPE on ultrathin polyester carriers in rabbits. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, 1824 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2, 205-218 (2014).
- Seiler, M. J., Aramant, R. B. Intact sheets of fetal retina transplanted to restore damaged rat retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, 2121-2131 (1998).
- Stanzel, B. V., et al. SD-OCT Complements Histology in Evaluation of Potential Bruch's Membrane Prosthetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 5241 (2010).
- Marmor, M. F., Abdul-Rahim, A. S., Cohen, D. S. The effect of metabolic inhibitors on retinal adhesion and subretinal fluid resorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 19, 893-903 (1980).
- Frambach, D. A., Marmor, M. F. The rate and route of fluid resorption from the subretinal space of the rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22, 292-302 (1982).
- Kita, M., Negi, A., Marmor, M. F. Lowering the calcium concentration in the subretinal space in vivo loosens retinal adhesion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 23-29 (1992).
- Marmor, M. F. Control of subretinal fluid: experimental and clinical studies. Eye. 4 (Pt 2), 340-344 (1990).
- Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 1328-1337 (2001).
- Szurman, P., et al. Ultrastructural Changes after Artificial Retinal Detachment with Modified Retinal Adhesion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 4983-4989 (2006).
- Fang, X. Y., et al. Effect of Ca(2+)-free and Mg(2+)-free BSS Plus solution on the retinal pigment epithelium and retina in rabbits. Am.J.Ophthalmol. 131, 481-488 (2001).
- Ivert, L., Kjeldbye, H., Gouras, P. Long-term effects of short-term retinal bleb detachments in rabbits. Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 240, 232-237 (2002).
