Protocol
Alle tierischen Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health skizzierte genehmigt.
1. Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection
- Euthanize die Maus gemäß den Richtlinien des Instituts.
- Bewegen Sie die Maus in Rückenlage und bringen durch alle vier Beine durch die Maus Fußballen unter dem Sprunggelenk feststecken.
- Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, gründlich die Beine Begießen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der rechten Seite der Mittellinie in den Unterbauch, knapp oberhalb der Hüfte.
- Ziehen Sie den Einschnitt in den Beinen und vorbei am Sprunggelenk.
- Ziehen Sie die Haut zurück und schneiden Sie die Quadrizeps-Muskel proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die Vorderseite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren.
- Mit dem blade der Schere gegen die hintere Seite des Oberschenkels, schneiden Sie die Beinbeuger aus dem Kniegelenk entfernt.
- Ziehen Sie die Haut zurück, und die hinteren Oberschenkelmuskeln zu proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die hintere Seite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren.
- Mit der Zange, halten das distale Ende des Femurs, direkt über dem Kniegelenk. Führen Sie die Klingen der Schere auf beiden Seiten der Femurschaft in Richtung des Hüftgelenks, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, in den Oberschenkelknochen selbst.
- Nach dem Hüftkopf zu erreichen, durch die Schere leicht zu öffnen angezeigt, drehen Sie die Schere mit der oberen Klinge der Schere direkt über dem Hüftkopf Bewegen des Oberschenkels zu verrücken, man aufpassen, nicht die Knochen unterhalb des Hüftkopfes zu schnappen.
- Fassen Sie den oberen Teil des Oberschenkelschaft mit der Zange, schneiden Sie das Weichgewebe aus dem Hüftkopf entfernt es aus der Hüftpfanne zu lösen.
- Ziehen Sie die gesamte Beinknochen, einschließlichFemur, Knie und Schienbein, nach oben und weg vom Körper, Schneiden sorgfältig das Bindegewebe und Muskulatur verbindet das Bein auf die Haut entfernt.
- Vorwagt das Sprunggelenk und wieder die Schere in einer Drehbewegung verwenden, um die Tibia zu verrücken.
- Greifen die distale Ende der Tibia, dabei nicht die Sehnen zu trennen, ziehen Sie die Tibia nach oben und weg vom Körper und dem Stift Bord.
- Schneiden jegliches verbleibende Bindegewebe den langen Knochen am Knie an der Maus befestigt.
- Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe und der Tibia.
- Für alle Anwendungen , die den Knochen erfordern intakt (Histologie, Histomorphometrie, biomechanische Tests, etc.) Zu bleiben, mit Standard-Haus Protokolle (wie in 4-7) um fortzufahren. Um Knochenmark zu isolieren, gehen Sie zu Abschnitt 2.
2. Lange Knochenpräparation für Knochenmark-Isolation
- Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit der Patella abgewandten einnd das proximale Ende (Hüftkopf) nach unten.
- Vorwagt, das Kniegelenk und die Schere in einer Drehbewegung der Tibia zu verrücken und Femur.
- Schneiden Sie Bindegewebe zusammen, um den Oberschenkel und Schienbein zu halten.
- Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit dem vorderen abgewandten Seite und dem proximalen Ende (Hüftkopf Ende) nach unten.
- Führen Sie die Schere, um die Femurschaft zu den Kondylen nach oben.
- Vorsichtig drehen die Schere hin und her die Kondylen, die Patella zu entfernen, und die Epiphyse die Metaphyse zu belichten.
- Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes.
- Mit Hilfe der Pinzette greifen die Tibia mit der vorderen Seite abgewandten und dem distalen Ende (Knöchel Ende) nach unten.
- Wenn die Tibiaepiphyse intakt ist, führen die Schere der Tibia Welle auf die Kondylen.
- Drehen Sie vorsichtig die Schere hin und her die Kondylen zu entfernen und Epiphyse die Metaph aussetzenlyse.
- Entfernen Sie alle Muskeln oder Binde an der Tibia befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes.
3. Bone Marrow Isolation
- Drücken eine 18 G Nadel durch den Boden eines 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Legen Sie die langen Knochen (maximal 2 Oberschenkel- und 2 tibiae) in das Rohr, Knie-Ende nach unten am Ende nach unten und den Deckel schließen.
- Nest der 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugiere die Röhrchen bei nested ≥10,000 xg in einer Mikrozentrifuge für 15 Sekunden.
- Stellen Sie sicher, dass das Knochenmark wurde aus den Knochen durch visuelle Inspektion gesponnen worden. Die Knochen sollte erscheinen weiß und es sollte eine große visuelle Pellet in dem größeren Rohr sein.
- Entsorgen Sie die 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit den Knochen.
- Hängen Sie das Knochenmark in geeigneten Lösung (zB PBS, Kulturmedien, FACS - Puffer) und fahren Sie mit experimentellen Protokoll (DNA, RNA oder Proteinisolierung,FACS-Analyse oder primäre Zellkultur).
Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll ist für eine schnelle Präparation der Maus Femur und Tibia mit einem Minimum an Beschädigung des Knochengewebes optimiert. Diese Technik ist für eine Anzahl von Downstream - Analysen geeignet, einschließlich Biomechanik Studien Histomorphometrie (1A - B) und Histologie (1C) 4,7. Der Vertreter histomophometric micoCT 3D - Rekonstruktion (1A - B) zeigt , dass sowohl die Spongiosa und kortikalen Schale aufrechterhalten werden, die für eine genaue Quantifizierung der standardisierten Strukturparameter für Knochenhistomorphometrie ermöglicht, einschließlich trabekulären Anzahl, Dicke und Beabstandung; Knochenvolumen; und kortikalen Dicke unter anderem Maßnahmen 8. Der Vertreter histologischen Schnitt zeigt eine H & E - gefärbten Formalin-fixierten und entkalkt Tibia (1C). Das Bild zeigt die Integrität sowohl des verkalkten bein und zelluläre Knochenmark für die histologische Analyse.
Das Knochenmark Isolierungsverfahren bewahrt die Sterilität des Knochenmarks Raum, hat eine geringe Handhabung Kontamination zu reduzieren, und nicht das Schneiden des langen Knochens erfordert, wodurch Verlust von Knochenmark-Ausbeute. Das Knochenmark ist geeignet für viele Downstream - Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie 5 und PCR - Analysen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden , um Knochenmark für die primäre Zellkultur von Knochenmarkzellen zu isolieren, einschließlich der Osteoklasten und Osteoblasten (2A - B) 4,6.
Abbildung 1. Histomorphologische und histologische Analysen der Maus langen Knochen. Dreidimensionale microCT Rekonstruktion einer Maus Tibia (A) , um die äußere Rindenschale zeigt und (B trong>) Spongiosa (Maßstab = 0,5 mm). (C) Histologische H & E-Färbung eines entkalkt und schnittene Tibia (4x). Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Primäre Knochenmarkzellkultur für die Differenzierung von Osteoklasten und Osteoblasten. (A) TRAP - Färbung für mehrkernige Osteoklasten nach 7 Tagen in osteoclastogenic Medien (4x). (B) Die alkalische Phosphatase (violette Farbe) für Osteoblasten und Alizarin rot (rote Farbe) Fleck für die Mineralisierung nach 21 Tagen in osteogenen Medien. Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pinboard | |||
| Pins | |||
| 70% Ethanol | |||
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 16 G needle | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| 0.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| Microcentrifuge |
References
- McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
- Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
- Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
- Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
- Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755 (2010).
- Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
- Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).
