Protocol
Alle dierlijke werk werd in overeenstemming met de in de Guide geschetst voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health aanbevelingen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Hind Limb Long Bone Dissection
- Euthanaseren de muis in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
- Plaats de muis in een liggende positie en bevestig door pinning alle vier de poten door de muis voetzooltjes onder het enkelgewricht.
- Spuit de muis met 70% ethanol, goed dousing de benen.
- Maak een kleine incisie aan de rechterkant van de middellijn in de onderbuik, net boven de heup.
- Verleng de incisie langs de been en langs het enkelgewricht.
- Trek de huid en snijd de quadriceps spieren verankerd aan proximaal uiteinde van het femur op de voorste zijde van het dijbeen bloot te leggen en pin uit het been, het plaatsen van de pen in een hoek van 45 graden van het bord.
- Met het blade van de schaar tegen de dorsale zijde van het dijbeen, snijd de hamstrings van het kniegewricht.
- Trek de huid en de hamstrings verankerd aan het proximale einde van het dijbeen naar de achterste zijde van het dijbeen bloot te leggen en pin uit het been, het plaatsen van de pen in een hoek van 45 graden van het bord.
- Met de tang, houdt het distale uiteinde van het femur, net boven het kniegewricht. Leid de bladen van de schaar op beide zijden van de femorale schacht naar het heupgewricht, zorg dat in de femur zelf te snijden.
- Na het bereiken van de heupkop, aangegeven door de schaar iets openen, draai de schaar met het bovenblad van de schaar bewegen direct over de heupkop naar het dijbeen ontwrichten, en let op het bot onder de heupkop niet te breken.
- Pak de bovenkant van de femorale as met de tang, snijd het zachte weefsel weg van de femurkop om deze uit het acetabulum.
- Trek de hele been bot, met inbegripfemur, knie en scheenbeen, en weg van het lichaam, zorgvuldig wegsnijden van het bindweefsel en spieren verbinden het been aan de huid.
- Soms gedwongen het enkelgewricht en weer gebruik maken van de schaar in een draaiende beweging aan het scheenbeen ontwrichten.
- Grijpen de distale einde van het scheenbeen, zorg ervoor dat u de pezen verbreken, trekt u de tibia omhoog en weg van het lichaam en het prikbord.
- Snijd de resterende bindweefsel vastmaken van het pijpbeen de muis bij de knie.
- Verwijder extra spier- of bindweefsel bevestigd aan het femur en de tibia.
- Voor alle toepassingen die het been nodig hebben om intact (histologie, histomorfometrie, biomechanische testen, enz.) Blijven doorgaan met standaard in-house protocollen (zoals in 4-7). Beenmerg te isoleren, gaat u verder met deel 2.
2. Lange Bone Voorbereiding van Bone Marrow Isolation
- Met behulp van de tang, pakt het dijbeen met de knieschijf afgekeerd eennd het proximale einde (heupkop) naar beneden.
- Soms gedwongen het kniegewricht en gebruik de schaar in een draaiende beweging van de tibia en femur ontwrichten.
- Snijd elke bindweefsel houdt het bovenbeen en onderbeen samen.
- Met behulp van de tang, pakt het dijbeen met de voorste afgekeerde zijde en het proximale uiteinde (heupkop end) naar beneden.
- Leid de schaar de femurschacht aan de condylen.
- Voorzichtig draai de schaar heen en weer naar de knobbels, de knieschijf te verwijderen, en de epifyse naar de metafyse bloot te leggen.
- Verwijder extra spier- of bindweefsel bevestigd aan het femur via forceps, scharen en Kimwipes.
- Met behulp van de tang, pak de tibia met de voorste afgekeerde zijde en het distale einde (enkel end) naar beneden.
- Als het scheenbeen epiphysis intact is, begeleiden de schaar de tibia schacht naar de condylen.
- Voorzichtig draai de schaar heen en weer om de knobbels te verwijderen en epifyse naar de metaph bloottion.
- Verwijder extra spier- of bindweefsel aan de tibia behulp forceps, scharen en Kimwipes.
3. Bone Marrow Isolation
- Duw een 18 G naald door de bodem van een 0,5 ml microcentrifugebuis.
- Plaats de lange botten (maximaal 2 scheen- en 2 tibiae) in de buis, knie-end naar beneden eind naar beneden en sluit het deksel.
- Nest de 0,5 ml microcentrifugebuis in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Centrifugeer de buizen bij geneste ≥10,000 xg in een microcentrifuge 15 seconden.
- Controleer of het beenmerg is gekomen uit de botten werden gesponnen door visuele inspectie. De botten moeten verschijnen wit en er moet een grote visuele pellet in de grotere buis.
- Gooi de 0,5 ml microcentrifugebuis met de beenderen.
- Suspendeer het beenmerg in geschikte oplossing (bijvoorbeeld PBS, kweekmedia FACS buffer) en vult experimentele protocol (DNA, RNA of eiwit isolatie,FACS-analyse, of primaire celkweek).
Representative Results
De hier beschreven protocol geoptimaliseerd voor snelle ontleding van de muis femur en tibia met minimale schade aan het botweefsel. Deze techniek is geschikt voor een aantal downstream analyses, waaronder biomechanica studies, histomorfometrie (Figuur 1 A - B) en histologie (figuur 1C) 4,7. De representatieve histomophometric micoCT 3D reconstructie (Figuur 1 A - B) toont aan dat zowel de poreuze bot en corticale mantel worden gesteld dat een accurate kwantificering van de gestandaardiseerde structurele parameters voor bothistomorfometrie, zoals trabeculaire aantal, dikte en afstand; volume bot; en corticale dikte, naast andere maatregelen 8. De vertegenwoordiger histologisch deel toont een H & E gekleurde formaline gefixeerde en ontkalkt tibia (figuur 1C). De afbeelding toont de integriteit van zowel de verkalkte béén en cellulaire beenmerg voor histologische analyse.
Het beenmerg isolatie procedure behoudt de steriliteit van het beenmerg ruimte, heeft een lage handling ter beperking van verontreiniging, en doet het snijden van de lange bot niet nodig, waardoor het verlies van beenmerg opbrengst verminderen. Het beenmerg is geschikt voor vele verdere toepassingen, waaronder flowcytometrie 5 en PCR-analyses. Bovendien kan deze werkwijze worden gebruikt om beenmerg te primaire celkweek van beenmergcellen, waaronder osteoclasten en osteoblasten (Figuur 2A - B) isoleren 4,6.
Figuur 1. Histomorfometrische en histologische analyses van muis pijpbeen. Driedimensionale microCT reconstructie van een muis tibia toont (A) de buitenste corticale schil en (B trong>) trabeculair bot (schaal bar = 0,5 mm). (C) histologische H & E kleuring van een ontkalkt en deelbaar tibia (4x). Afbeeldingen met dank aan Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Primaire Bone Marrow Cultuur van de Cel voor differentiatie van osteoclasten en osteoblasten. (A) TRAP kleuring voor meerkernige osteoclasten na 7 dagen in osteoclastogenic media (4x). (B) Alkaline fosfatase (paarse kleur) voor osteoblasten en alizarinerood (rode kleur) vlek voor mineralisatie na 21 dagen in osteogene media. Afbeeldingen met dank aan Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pinboard | |||
| Pins | |||
| 70% Ethanol | |||
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 16 G needle | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| 0.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| Microcentrifuge |
References
- McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
- Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
- Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
- Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
- Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755 (2010).
- Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
- Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).
