Protocol
وقد وافق كل عمل الحيوانية رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة.
تشريح 1. هند الاطراف طويل العظام
- الموت ببطء الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- ضع الماوس في موقف ضعيف ويضعوا التي تعلق كل أربع أرجل من خلال منصات الماوس مخلب أدناه مفصل الكاحل.
- رذاذ الفأر مع 70٪ من الإيثانول، يسكب دقيق الساقين.
- إجراء شق صغير على يمين خط الوسط في أسفل البطن، وذلك فوق الورك.
- تمديد شق أسفل الساق والماضي مفصل الكاحل.
- سحب الجلد وقطع عضلة الفخذ ترتكز على نهاية القريبة من عظم الفخذ لفضح الجانب الأمامي من الفخذ ويعلقون الخروج من المحطة، ووضع دبوس في زاوية 45 درجة من المجلس.
- مع هؤلاء الاشخاص(ه) من مقص ضد الجانب الخلفي من الفخذ، وقطع أوتار الركبة بعيدا عن مفصل الركبة.
- سحب الجلد والعضلات في اوتار الركبة ترتكز على نهاية القريبة من عظم الفخذ لفضح الجانب الخلفي من الفخذ ويعلقون الخروج من المحطة، ووضع دبوس في زاوية 45 درجة من المجلس.
- مع ملقط، عقد نهاية البعيدة للعظم الفخذ، وذلك فوق مفصل الركبة. توجيه شفرات المقص على جانبي جسم الفخذ نحو مفصل الورك، والحرص على عدم قطع في عظمة الفخذ نفسها.
- بعد الوصول إلى رأس الفخذ، التي أشار إليها مقص فتح قليلا، تحريف مقص مع شفرة العليا من مقص تتحرك مباشرة على رأس الفخذ إلى خلع عظم الفخذ، والحرص على عدم التقاط العظم تحت رأس الفخذ.
- فهم الجزء العلوي من جسم الفخذ مع ملقط، وقطع الأنسجة اللينة بعيدا عن رأس الفخذ لتحريرها من الحق.
- سحب عظم الساق بأكملها، بما في ذلكعظم الفخذ والركبة، والساق، وحتى بعيدا عن الجسم، قطع بعناية بعيدا النسيج الضام والعضلات التي تربط المحطة على الجلد.
- تجهد مفصل الكاحل ومرة أخرى استخدام مقص في حركة التواء لخلع الساق.
- استيعاب النهاية البعيدة من الساق، مع الحرص على عدم قطع الأوتار، وسحب الساق وحتى بعيدا عن الجسم ومجلس دبوس.
- قطع أي نوع من الأنسجة الضامة المتبقية ربط العظام الطويلة على الماوس عند الركبة.
- إزالة أي عضلة إضافية أو النسيج الضام تعلق على عظم الفخذ والساق.
- للحصول على أي التطبيقات التي تتطلب العظام لتبقى سليمة (علم الأنسجة، histomorphometry واختبار النشاط الحيوي، الخ.)، والمضي قدما مع البروتوكولات في المنزل القياسية (كما هو الحال في 4-7). لعزل نخاع العظم، انتقل إلى القسم 2.
2. إعداد العظام الطويلة لنخاع العظم عزل
- باستخدام ملقط، فهم عظم الفخذ مع الرضفة تواجه بعيداالثانية نهاية الداني (رئيس الفخذ) إلى أسفل.
- تجهد مفصل الركبة واستخدام المقص في حركة التواء لخلع الساق والفخذ.
- قطع أي النسيج الضام عقد عظم الفخذ والساق معا.
- باستخدام ملقط، فهم عظم الفخذ مع الجانب الأمامي تواجه بعيدا والنهاية القريبة (الفخذ نهاية الرأس) أسفل.
- توجيه مقص فوق رمح الفخذ إلى اللقم.
- تناوب بلطف المقص ذهابا وإيابا لإزالة اللقم، الرضفة، والكردوس لفضح الكردوس.
- إزالة أي عضلة إضافية أو النسيج الضام تعلق على عظم الفخذ باستخدام ملقط، مقص، وKimwipes.
- باستخدام ملقط، فهم الساق مع الجانب الأمامي تواجه بعيدا والنهاية البعيدة (نهاية الكاحل) إلى أسفل.
- إذا الكردوس قصبي غير سليمة، توجيه مقص فوق رمح الساق إلى اللقم.
- تناوب بلطف المقص ذهابا وإيابا لإزالة اللقم والكردوس لفضح metaphيسيس.
- إزالة أي عضلة إضافية أو النسيج الضام تعلق على الساق باستخدام ملقط، مقص، وKimwipes.
3. نخاع العظم عزل
- دفع على إبرة G 18 من خلال الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مل microcentrifuge ل.
- وضع العظام الطويلة (بحد أقصى 2 عظام الفخذ والظنبوب 2) في أنبوب، وصولا في نهاية الركبة نهاية أسفل وإغلاق الغطاء.
- عش أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لفي أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- أنابيب الطرد المركزي المتداخلة في ≥10،000 x ج في microcentrifuge لمدة 15 ثانية.
- تحقق من أن نخاع العظام قد خرجت العظام عن طريق التفتيش البصري. يجب أن تظهر عظام بيضاء، وينبغي أن يكون هناك بيليه البصرية كبير في أنبوب أكبر.
- تجاهل أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لمع العظام.
- تعليق نخاع العظام في حل مناسب (على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني، وسائل الإعلام والثقافة، وFACS العازلة)، والمضي قدما في البروتوكول التجريبي (DNA، RNA، أو العزلة البروتين،تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، أو زراعة الخلايا الأولية).
Representative Results
هو الأمثل لبروتوكول الموصوفة هنا لتشريح السريع لعظم الفخذ والساق الماوس مع حد أدنى من الأضرار التي لحقت الأنسجة والعظام. هذا الأسلوب هو مناسبة لعدد من التحليلات التحويلية، بما في ذلك دراسات الميكانيكا الحيوية، histomorphometry (الشكل 1A - B)، والأنسجة (الشكل 1C) 4،7. وhistomophometric ممثل micoCT 3D إعادة الإعمار (الشكل 1A - B) يدل على أن كلا من العظام إسفنجي وقذيفة القشرية يتم الاحتفاظ تسمح الكميات دقيقة من المعلمات الهيكلية موحدة لhistomorphometry العظام، بما في ذلك عدد التربيقي، سمك، والمباعدة بين الولادات. حجم العظام. وسماكة القشرية، ضمن تدابير أخرى 8. يظهر مقطع تمثيلي نسيجية والثابتة الفورمالين وdecalcified الساق H & E الملون (الشكل 1C). توضح الصورة وسلامة كل من ب متكلسةواحد ونخاع العظام الخلوي للتحليل النسيجي.
الإجراء نخاع العظام العزلة يحافظ على عقم مساحة النخاع العظمي، له معالجة منخفضة للحد من التلوث، ولا يتطلب قطع من العظام الطويلة، وبالتالي تقليل فقدان العائد نخاع العظام. هذا نخاع العظم هو مناسبة للعديد من التطبيقات المصب، بما في ذلك التدفق الخلوي 5 و PCR تحليل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لعزل نخاع العظام للثقافة الخلية الأولية من خلايا نخاع العظام، بما في ذلك الخلايا الآكلة وبانيات (الشكل 2A - B) 4،6.
الشكل 1. Histomorphological والتحليلات النسيجية من الماوس لونغ العظام. إعادة الإعمار microCT ثلاثي الأبعاد من الساق الماوس تظهر (أ) قذيفة القشرية الخارجية و (ب ترونج>) العظام تربيقية (مقياس بار = 0.5 ملم). (C) نسيجية H & E وصمة عار على الساق decalcified ومقطوع (4X). صور من باب المجاملة كاثرين Weilbaecher، جامعة واشنطن مدرسة الطب، الولايات المتحدة الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الابتدائية نخاع العظم الثقافة الخليوي لتمايز الخلايا الآكلة وبانيات. تلطيخ (A) TRAP لالآكلة متعددة النوى بعد 7 أيام في وسائل الإعلام osteoclastogenic (4X). (ب) الفوسفاتيز القلوية (اللون الأرجواني) لبانيات والأحمر الأليزارين (اللون الأحمر) وصمة عار لتمعدن بعد 21 يوما في وسائل الإعلام عظمي المنشأ. صور من باب المجاملة كاثرين Weilbaecher، جامعة واشنطن مدرسة الطب، الولايات المتحدة الأمريكية.ديزيل / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pinboard | |||
| Pins | |||
| 70% Ethanol | |||
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 16 G needle | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| 0.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| Microcentrifuge |
References
- McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
- Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
- Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
- Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
- Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755 (2010).
- Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
- Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).
