Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

doi: 10.3791/53936 Published: April 14, 2016

Protocol

Все для животных работа была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения.

1. Hind Лимб длинных трубчатых костей Рассечение

  1. Эвтаназии мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
  2. Поместите мышь в положении лежа на спине и наклейте закрепив все четыре ноги через мышь подушечки лап ниже голеностопного сустава.
  3. Спрей мышь с 70% этанола, тщательно обливание ног.
  4. Сделайте небольшой надрез справа от средней линии в нижней части живота, чуть выше бедра.
  5. Расширьте надрез вниз по ноге и мимо голеностопного сустава.
  6. Оттяните кожу и разрезать четырехглавой мышцы, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить переднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
  7. С Bladе ножниц против задней стороны бедра, отрежьте бицепсы от коленного сустава.
  8. Оттяните кожу и мышцы подколенного сухожилия, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить заднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
  9. С помощью щипцов, удерживая дистальный конец бедренной кости, чуть выше коленного сустава. Руководство лезвия ножниц по обе стороны от бедренной кости к тазобедренного сустава, стараясь не врезаться в самой бедренной кости.
  10. После достижения головки бедренной кости, с указанием ножниц открытия слегка скрутите ножницы с верхним лезвием ножниц, движущихся непосредственно над головки бедренной кости вывихнуть бедренной кости, стараясь не замкнуть кости ниже головки бедренной кости.
  11. Возьмитесь за верхнюю часть бедренной кости с пинцетом, разрезал мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить его от вертлужной.
  12. Вытащите всю кость ноги, в том числебедренной кости, колена и голени, вверх и в сторону от тела, тщательно срезая соединительной ткани и мышц, соединяющий ногу к коже.
  13. Перенапрягать голеностопный сустав и снова использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой кости.
  14. Схватив дистального конца большеберцовой кости, следя за тем, чтобы не перерезать сухожилия, потяните голень вверх и в сторону от тела и пин-плате.
  15. Вырезать все оставшиеся соединительной ткани имеется длинный кость мыши в колене.
  16. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной и большеберцовой кости.
  17. Для любых приложений, требующих кости , чтобы оставаться неповрежденными (гистология, Гистоморфометрия, биомеханические тестирование и т.д.) . , Действуйте со стандартными протоколами в доме (как в 4-7). Чтобы изолировать костный мозг, переходите к разделу 2.

2. Длинные косточки Подготовка к изоляции костного мозга

  1. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с надколенника лицом прочьй проксимальный конец (головка бедренной кости) вниз.
  2. Перенапрягать коленного сустава и использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой и бедренной костями.
  3. Вырезать любой соединительной ткани, проведение бедренной и большеберцовой костей вместе.
  4. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с передней стороны, обращенной в сторону и проксимального конца бедренной кости (конец головки) вниз.
  5. Руководство ножницы вверх бедренной кости к мыщелков.
  6. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков, коленной чашечки, и эпифиз выставить метафиза.
  7. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.
  8. Используя пинцет, возьмитесь за голень с передней стороны, обращенной в сторону и дальний конец (конец голеностопа) вниз.
  9. Если большеберцовой эпифиза цела, руководство ножницами вверх большой берцовой кости вала до мыщелков.
  10. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков и эпифиз, чтобы выставить metaphлиз.
  11. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к большеберцовой кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.

3. Выделение костного мозга

  1. Принудительную 18 G иглу через нижнюю часть 0,5 мл трубки микроцентрифужных.
  2. Поместите длинные кости (максимум 2 бедрами и голенями 2) в трубку, по колено конец вниз концом вниз и закройте крышку.
  3. Гнездо 0,5 трубки микроцентрифужных мл в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  4. Центрифуга вложенными пробирки при ≥10,000 XG в микроцентрифуге в течение 15 сек.
  5. Убедитесь в том, что костный мозг был растягивал из костей с помощью визуального осмотра. Кости должны выглядеть белым и не должно быть большой визуальный осадок в большую трубу.
  6. Откажитесь от 0,5 мл микроцентрифужных трубку с костями.
  7. Приостановка костный мозг в соответствующем растворе (например, PBS, культуральные среды, FACS буфер) и продолжить экспериментальный протокол (ДНК, РНК или выделения белка,Анализ FACS, или первичной культуры клеток).

Representative Results

Протокол, описанный здесь, оптимизирован для быстрой рассечения бедренной кости мыши и большеберцовой кости с минимальным повреждением костной ткани. Этот метод подходит для целого ряда последующих анализов, включая исследования биомеханики, гистоморфометрии (рис 1А - В) и гистологии (рис 1C) 4,7. Представитель histomophometric micoCT 3D реконструкция (Рисунок 1А - B) показывает , что как губчатой ​​кости и кортикального оболочки сохраняются , что позволяет точно оценить стандартизированных структурных параметров для гистоморфометрии кости, в том числе губчатой ​​количества, толщины и расстояния; объем костной ткани; и кортикальную толщину, среди прочих мер 8. Представитель гистологические секции показывает H & E окрашивали фиксированные формалином и декальцинированной берцовой (рис 1C). Изображение демонстрирует целостность обоих кальцифицированного Ьодин и клеточный костный мозг для гистологического анализа.

Процедура костного мозга изоляция сохраняет стерильность пространства костного мозга, имеет низкую обработку для снижения загрязнения, и не требует нарезку длинной кости, тем самым уменьшая потери урожая костного мозга. Этот костный мозг подходит для многих последующих применений, в том числе проточной цитометрии 5 и ПЦР - анализ. Кроме того, эта процедура может быть использована для выделения костного мозга для первичной культуры клеток клеток костного мозга, в том числе остеокластов и остеобластов (фиг.2А - B) -4,6.

Рисунок 1
Рисунок 1. Гистоморфологические и гистологические анализы мышей длинных трубчатых костей. Трехмерная microCT реконструкция большеберцовой кости мыши , показывая (A) наружный кортикальный оболочку и (B Чонг>) губчатая кость (масштаб бар = 0,5 мм). (C) Гистологическое H & E пятно в декальцинированной и секционного большеберцовой кости (4x). Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Первичная костного мозга Культура клеток для дифференциации остеокластов и остеобластов. (A) TRAP окрашивание на многоядерные остеокластов через 7 дней в osteoclastogenic средах (4x). (В) щелочной фосфатазы (фиолетовый цвет) для остеобластов и ализарин красный (красный цвет) пятно для минерализации после 21 дней в остеогенной СМИ. Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США.Iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors 
Dissection forceps
Kimwipes Kimberly-Clark 34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11, (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14, (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30, (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27, (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5, (12), e15755 (2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122, (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28, (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43, (4), 244-258 (2002).
Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).More

Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter