Protocol
Все для животных работа была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения.
1. Hind Лимб длинных трубчатых костей Рассечение
- Эвтаназии мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
- Поместите мышь в положении лежа на спине и наклейте закрепив все четыре ноги через мышь подушечки лап ниже голеностопного сустава.
- Спрей мышь с 70% этанола, тщательно обливание ног.
- Сделайте небольшой надрез справа от средней линии в нижней части живота, чуть выше бедра.
- Расширьте надрез вниз по ноге и мимо голеностопного сустава.
- Оттяните кожу и разрезать четырехглавой мышцы, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить переднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
- С Bladе ножниц против задней стороны бедра, отрежьте бицепсы от коленного сустава.
- Оттяните кожу и мышцы подколенного сухожилия, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить заднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
- С помощью щипцов, удерживая дистальный конец бедренной кости, чуть выше коленного сустава. Руководство лезвия ножниц по обе стороны от бедренной кости к тазобедренного сустава, стараясь не врезаться в самой бедренной кости.
- После достижения головки бедренной кости, с указанием ножниц открытия слегка скрутите ножницы с верхним лезвием ножниц, движущихся непосредственно над головки бедренной кости вывихнуть бедренной кости, стараясь не замкнуть кости ниже головки бедренной кости.
- Возьмитесь за верхнюю часть бедренной кости с пинцетом, разрезал мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить его от вертлужной.
- Вытащите всю кость ноги, в том числебедренной кости, колена и голени, вверх и в сторону от тела, тщательно срезая соединительной ткани и мышц, соединяющий ногу к коже.
- Перенапрягать голеностопный сустав и снова использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой кости.
- Схватив дистального конца большеберцовой кости, следя за тем, чтобы не перерезать сухожилия, потяните голень вверх и в сторону от тела и пин-плате.
- Вырезать все оставшиеся соединительной ткани имеется длинный кость мыши в колене.
- Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной и большеберцовой кости.
- Для любых приложений, требующих кости , чтобы оставаться неповрежденными (гистология, Гистоморфометрия, биомеханические тестирование и т.д.) . , Действуйте со стандартными протоколами в доме (как в 4-7). Чтобы изолировать костный мозг, переходите к разделу 2.
2. Длинные косточки Подготовка к изоляции костного мозга
- Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с надколенника лицом прочьй проксимальный конец (головка бедренной кости) вниз.
- Перенапрягать коленного сустава и использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой и бедренной костями.
- Вырезать любой соединительной ткани, проведение бедренной и большеберцовой костей вместе.
- Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с передней стороны, обращенной в сторону и проксимального конца бедренной кости (конец головки) вниз.
- Руководство ножницы вверх бедренной кости к мыщелков.
- Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков, коленной чашечки, и эпифиз выставить метафиза.
- Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.
- Используя пинцет, возьмитесь за голень с передней стороны, обращенной в сторону и дальний конец (конец голеностопа) вниз.
- Если большеберцовой эпифиза цела, руководство ножницами вверх большой берцовой кости вала до мыщелков.
- Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков и эпифиз, чтобы выставить metaphлиз.
- Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к большеберцовой кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.
3. Выделение костного мозга
- Принудительную 18 G иглу через нижнюю часть 0,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Поместите длинные кости (максимум 2 бедрами и голенями 2) в трубку, по колено конец вниз концом вниз и закройте крышку.
- Гнездо 0,5 трубки микроцентрифужных мл в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Центрифуга вложенными пробирки при ≥10,000 XG в микроцентрифуге в течение 15 сек.
- Убедитесь в том, что костный мозг был растягивал из костей с помощью визуального осмотра. Кости должны выглядеть белым и не должно быть большой визуальный осадок в большую трубу.
- Откажитесь от 0,5 мл микроцентрифужных трубку с костями.
- Приостановка костный мозг в соответствующем растворе (например, PBS, культуральные среды, FACS буфер) и продолжить экспериментальный протокол (ДНК, РНК или выделения белка,Анализ FACS, или первичной культуры клеток).
Representative Results
Протокол, описанный здесь, оптимизирован для быстрой рассечения бедренной кости мыши и большеберцовой кости с минимальным повреждением костной ткани. Этот метод подходит для целого ряда последующих анализов, включая исследования биомеханики, гистоморфометрии (рис 1А - В) и гистологии (рис 1C) 4,7. Представитель histomophometric micoCT 3D реконструкция (Рисунок 1А - B) показывает , что как губчатой кости и кортикального оболочки сохраняются , что позволяет точно оценить стандартизированных структурных параметров для гистоморфометрии кости, в том числе губчатой количества, толщины и расстояния; объем костной ткани; и кортикальную толщину, среди прочих мер 8. Представитель гистологические секции показывает H & E окрашивали фиксированные формалином и декальцинированной берцовой (рис 1C). Изображение демонстрирует целостность обоих кальцифицированного Ьодин и клеточный костный мозг для гистологического анализа.
Процедура костного мозга изоляция сохраняет стерильность пространства костного мозга, имеет низкую обработку для снижения загрязнения, и не требует нарезку длинной кости, тем самым уменьшая потери урожая костного мозга. Этот костный мозг подходит для многих последующих применений, в том числе проточной цитометрии 5 и ПЦР - анализ. Кроме того, эта процедура может быть использована для выделения костного мозга для первичной культуры клеток клеток костного мозга, в том числе остеокластов и остеобластов (фиг.2А - B) -4,6.
Рисунок 1. Гистоморфологические и гистологические анализы мышей длинных трубчатых костей. Трехмерная microCT реконструкция большеберцовой кости мыши , показывая (A) наружный кортикальный оболочку и (B Чонг>) губчатая кость (масштаб бар = 0,5 мм). (C) Гистологическое H & E пятно в декальцинированной и секционного большеберцовой кости (4x). Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Первичная костного мозга Культура клеток для дифференциации остеокластов и остеобластов. (A) TRAP окрашивание на многоядерные остеокластов через 7 дней в osteoclastogenic средах (4x). (В) щелочной фосфатазы (фиолетовый цвет) для остеобластов и ализарин красный (красный цвет) пятно для минерализации после 21 дней в остеогенной СМИ. Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США.Iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pinboard | |||
| Pins | |||
| 70% Ethanol | |||
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 16 G needle | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| 0.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| Microcentrifuge |
References
- McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
- Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
- Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
- Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
- Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755 (2010).
- Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
- Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).
