Protocol
Tüm hayvan çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen tavsiyeleri doğrultusunda Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon
- kurumsal kurallara uygun olarak fare Euthanize.
- Bir yatar pozisyonda fare yerleştirin ve ayak bileği ekleminin altında fare pençe yastıkları sayesinde dört bacağı iğneleyerek yapıştırın.
- iyice bacaklarını dousing,% 70 etanol ile fare püskürtün.
- Sadece kalça üzerinde, alt karın bölgesinde orta hatta sağa doğru küçük bir kesi yapmak.
- bacak aşağıya ve ayak bileği ekleminin geçmiş kesi uzatın.
- Cildi geri çekin ve kurulu 45 derecelik bir açıyla pimi yerleştirerek, femur ön tarafını ortaya çıkarmak ve bacak dışarı pin femur proksimal ucuna demirlemiş kuadriseps kas kesti.
- blad ilefemur arka tarafına karşı makas e uzak diz ekleminden hamstrings kesti.
- kurulu 45 derecelik bir açıyla pimi yerleştirerek, cilt ve femur arka tarafını ortaya çıkarmak ve bacak dışarı pin femur proksimal ucuna demirlemiş hamstring kasları geri çekin.
- forseps ile, sadece diz ekleminde üzerinde, femur distal ucunu tutun. femur kendi içine kesmek için dikkatli olmak, kalça ekleminin doğru femur şaft iki tarafında makas bıçakları rehberlik eder.
- hafif açarak makas ile gösterilen femur başı, ulaştıktan sonra, femur başı aşağıda kemik snap dikkatli olmak, femur yerinden femur başının üzerine doğrudan hareketli makas üst bıçak ile makas bükün.
- , Forseps ile femur şaft üstünü tutun asetabulumun ayırmak için uzak femur başı yumuşak doku kesti.
- dahil olmak üzere tüm bacak kemiği çekinfemur, yukarı ve vücuttan uzak diz, ve tibia, özenle bağ dokusu kesip atmak ve kas cilde bacak bağlamak.
- tibia yerinden bir büküm hareket makas kullanmak tekrar ayak bileği eklemini overextend ve.
- özen, tibia distal ucunu kavrama, tendonları sever yukarı ve vücuttan ve pin kurulu tibia çekmeye değil.
- dizden fare uzun kemik takılması kalan Bağ dokusu kesin.
- herhangi bir ek kas veya femur tibia ve bağlı bağ dokusu çıkarın.
- Kemik gerektiren herhangi bir uygulama bozulmamış (vb histoloji, histomorfometri, biyomekanik test.) Kalması için, (4-7 gibi), standart in-house protokolleri ile devam edin. kemik iliği izole etmek, 2. bölüme geçin.
2. Uzun Kemik Hazırlık Kemik İliği İzolasyon
- forseps kullanarak, patella uzak bir bakacak femur kavramaknd proksimal ucu (femur başı) aşağı.
- Diz eklemini overextend ve tibia yerinden ve femur bir büküm hareket makas kullanın.
- Birlikte femur ve tibia tutan herhangi bir bağ dokusu kesti.
- forseps kullanarak dönük ön tarafında proksimal ucunda (femoral baş ucu) aşağı femur kavramak.
- kondillerin femoral şaft makas yukarı Kılavuzu.
- Yavaşça kondilleri, patellanın kaldırmak için ileri ve geri makas döndürmek ve epifiz metafizi ortaya çıkarmak.
- herhangi bir ek kas veya forseps, makas, ve Kimwipes kullanarak femur bağlı bağ dokusu çıkarın.
- forseps kullanarak dönük ön tarafı ve distal ucu (ayak bileği sonu) aşağı kaval kavramak.
- tibia epifiz sağlam ise, kondillerin için tibia şaft kadar makas rehberlik.
- Yavaşça kondilleri kaldırmak için ileri ve geri makas döndürmek ve epifiz metaph maruzSalman kararı.
- herhangi bir ek kas veya forseps, makas, ve Kimwipes kullanarak tibia bağlı bağ dokusu çıkarın.
3. Kemik iliği İzolasyonu
- 0.5 ml mikrosantrifüj tüp altından geçerek 18 G iğne itin.
- tüpe (2 femur ve 2 tibia'daki maksimum) uzun kemikleri koyun, diz sonu down bitirmek ve kapağı kapatın.
- Yuva, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü.
- 15 saniye boyunca bir mikrosantrifüj içinde ≥10,000 xg'de iç içe geçmiş tüpler santrifüjleyin.
- Kemik iliği görsel muayene ile kemiklerin dışarı bükülmüş olduğunu doğrulayın. kemikler, beyaz görünmelidir ve büyük tüp büyük bir görsel pelet olmalıdır.
- kemiklerle 0.5 ml'lik ependorf tüp atın.
- Uygun çözelti içinde kemik iliği (örneğin, PBS, kültür ortamı, FACS tamponu) ve deneysel protokol (DNA RNA ya da protein izolasyon devam AskıyaFACS analizi veya birincil hücre kültürü).
Representative Results
Burada açıklanan protokol kemik dokusunun zarar minimum fare femur ve tibia hızlı diseksiyon için optimize edilmiştir. Ve histoloji (Şekil 1C) 4,7 - Bu teknik biyomekanik çalışmaları, histomorfometri (B Şekil 1 A) dahil olmak üzere alt analiz, bir dizi için uygundur. Örnek histomophometric micoCT 3D rekonstrüksiyonu (Şekil 1A - Oda) süngerimsi kemik ve kortikal kabuk hem trabeküler sayı, kalınlık ve boşluk da dahil olmak üzere, kemik histomorfometrisi için standart yapısal parametrelerin doğru sayılmasını sağlayan ileri sürmüştür olduğunu göstermektedir; kemik hacmi; diğer önlemler 8 arasında ve kortikal kalınlık. Temsilcisi histolojik bölüm, bir H & E lekeli formalin ile fikse ve dekalsifiye tibia (Şekil 1C) gösterir. Görüntü kalsifiye b hem bütünlüğünü göstermektediron ve histolojik analiz için hücresel kemik iliği.
kemik iliği izolasyon prosedürü, kemik iliği alanı sterilite koruyan kirlenmeyi azaltmak için düşük bir işleme sahiptir ve bu nedenle, kemik iliği verim kaybının azaltılması, uzun bir kemik kesimi gerektirmez. Bu kemik iliği 5 ve PCR analizleri akış sitometrisi dahil olmak üzere birçok alt uygulamalar için uygundur. 4,6 - Buna ek olarak, bu işlem osteoklastlar ve osteoblastlar (B Şekil 2A) gibi kemik iliği hücreleri, primer hücre kültürü için, kemik iliği ayırmak için kullanılabilir.
(A) dış kortikal kabuk ve gösteren bir fare tibia Şekil 1. Histomorfolojik ve Fare Uzun Kemik histolojik Analizleri. Üç boyutlu MikroBT'lerin rekonstrüksiyon (B trong>) trabeküler kemik (Ölçek çubuğu = 0.5 mm). Bir sertliği alınmış ve kesitli tibia (4x) (C) histolojik H & E boyama. Görüntüler Katherine Weilbaecher Tıp, ABD Washington Üniversitesi nezaket. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Osteoklast ve osteoblastlar Ayrımında için Şekil 2. Primer Kemik İliği hücre kültürü. Osteoclastogenic medya (4x) 'de 7 günden sonra çok çekirdekli osteoklastlar için (A) TRAP boyaması. (B) osteoblast ve osteojenik medyada 21 gün sonra mineralizasyonu için alizarin kırmızı (kırmızı renk) leke Alkali fosfataz (mor renk). Katherine Weilbaecher görüntüleri nezaket Tıp, ABD Washington Üniversitesi.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pinboard | |||
| Pins | |||
| 70% Ethanol | |||
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 16 G needle | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| 0.5 ml Microcentrifuge tube | |||
| Microcentrifuge |
References
- McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
- Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
- Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
- Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
- Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755 (2010).
- Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
- Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).
