Abstract
ارتفاع نسبة عودة الورم بعد استئصال الآفات الكبد النقيلي لا يزال يشكل مشكلة لم تحل بعد. الودائع الخلايا السرطانية الصغيرة، التي لا يمكن كشفها بواسطة التصوير السريري الروتيني، قد يحفزه العوامل تجديد الكبد بعد استئصال الكبد. وليس واضحا تماما، ولكن الذي عوامل حاسمة لعودة الورم.
قد يكون نموذج الفأر قدم المفيد استكشاف الآليات التي تلعب دورا في تطور الآفات الخبيثة المتكررة بعد استئصال الكبد. نموذج يجمع بين تقنيات سهلة إلى أداء وقابلة للتكرار كميات محددة من إزالة أنسجة الكبد وتحريض الورم (عن طريق الحقن) في الفئران. تم علاج الحيوانات إما مع البطن واحدة، 30٪ استئصال الكبد، أو 70٪ استئصال الكبد. وتلقى جميع الحيوانات في وقت لاحق حقن الخلايا السرطانية في أنسجة الكبد المتبقية. بعد أسبوعين من المراقبة، تم تقييم الكبد والأورام لحجم ووزن وفحصها من قبل المناعية.
بعد 70٪ استئصال الكبد، وزاد حجم الورم والوزن بشكل ملحوظ مقارنة البطن وحدها (ع <0.05). وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت المناعية (Ki67) زيادة معدل انتشار الورم في مجموعة استئصال (ع <0.05).
تظهر هذه النتائج تأثير آليات تجديد الكبد على نمو الورم داخل الكبد. جنبا إلى جنب مع أساليب مثل workup النسيجي أو تحليل الحمض النووي الريبي، يمكن للنموذج الفأر وصفت بمثابة الأساس لفحص دقيق من العوامل المختلفة المشاركة في نمو الورم وتكرار المرض المنتشر داخل الكبد. وهناك عدد كبير من المتغيرات مثل طول الملاحظة بعد العملية الجراحية، خط الخلية المستخدمة للحقن أو توقيت الحقن واستئصال الكبد تقدم زوايا متعددة عند استكشاف سؤالا محددا في سياق الانبثاث بعد استئصال الكبد. قيود من هذا الإجراء هي الاتحاد الافريقيthorization لتنفيذ الإجراء على الحيوانات، والوصول إلى منشأة التجارب على الحيوانات المناسب والحصول على بعض المعدات.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) يمثل ما يقرب من 9٪ من جميع الأورام الخبيثة. وهو ثالث أكثر أنواع السرطان شيوعا، سواء في الولايات المتحدة وحول العالم. معدلات الوفيات العالمية من مجموعة CRC من 300،000 إلى أكثر من 500،000 سنويا 1. عشرين في المئة من المرضى الذين يعانون من الانبثاث الكبد على اكتشاف الورم القولون والمستقيم. يتم التعامل مع الانبثاث Resectable عادة جزئي 2،3 استئصال الكبد. تحسين التقنيات الجراحية واستراتيجيات متعددة الوسائط الجديدة وتعريفات جديدة الانبثاث resectable تجعل العلاج لاستئصال الكبد الجزئي من الممكن بالنسبة لعدد متزايد من المرضى (4).
تكرار الأورام الخبيثة في الكبد الثانوية، ومع ذلك، هو sequalae السريري تحديا في جراحة الجهاز الهضمي الحديثة. المرضى الذين يعانون من اتفاقية حقوق الطفل الذي خضع لاستئصال النقائل الكبد لديهم فرصة 30 إلى 50٪ من تطوير ورم جديد في الكبد بقايا من 5. لذلك، هناك حاجة لإجراء المزيد من البحوث علىالآليات التي تشارك في تكرار الانبثاث الكبد.
يتم تعويض واستئصال الكبد حوالي 70٪ عادة في غضون بضعة أسابيع من أنسجة الكبد المتبقية. ويشمل هذا تجديد آليات متعددة، بما في ذلك السيتوكينات مثل انترلوكين 6 (IL-6)، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، عامل النمو الكبدية (HGF)، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF )، metalloproteases المصفوفة (MMP-2 و MMP-9) وCXC-كيموكينات 6-11. هذه المواد تدعم تجديد الكبد ويمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن معدلات تكرار عالية من الأورام الخبيثة في الكبد الأولية والثانوية عن طريق حفز نمو الودائع الخلايا السرطانية صغيرة في الكبد المتبقية التي لم يتم الكشف عنها بواسطة التصوير السريري الروتيني. لم تثبت هذه العلاقة السببية حتى الآن.
تأسست الفرضية التالية. بعد استئصال الكبد الجزئي، وعوامل الانتشار التي هي المسؤولة عن العيشقد ص تضخم أيضا تحفز نمو الخلايا السرطانية المكتشفة سابقا في الكبد. تم تصميم نموذج الفأر الذي يجمع بين تقنيات استئصال الكبد وتحريض الورم. تم تقسيم ثلاثين عارية foxn1nu / الفئران نو athymic إلى ثلاث مجموعات من عشرة حيوانات لكل منهما. كان يعامل كل منهم إما مع البطن وحدها (المجموعة الأولى)، 30٪ استئصال الكبد (المجموعة الثانية) أو استئصال الكبد 70٪ (المجموعة الثالثة). تلقى الحيوانات في جميع الفئات في وقت لاحق حقن الخلايا السرطانية في جزء المتبقي محددة من الكبد، لمحاكاة الخلايا السرطانية النائمة. الحيوانات حيث لاحظت لمدة أسبوعين ومن ثم تقييمها لنمو الورم وتضخم الكبد.
كان الهدف هو خلق نموذج التي يمكن استخدامها للبحث عن العوامل الجزيئية وإمراضي التي قد تلعب دورا في تشكيل الورم في مرحلة ما بعد استئصال الكبد. قد تكون هذه الطريقة مفيدة في تقييم: أصل من العوامل الغدد الصماء تشارك في تجديد الكبد. الآليات المسؤولة عن توم داخل الكبدأو النمو بعد استئصال الكبد. والكبد حجم استئصال اللازم لداخل الكبد تحريض نمو الورم. وقد تم تنفيذ الأسلوب التالي فقط على الحيوانات لأنها نعد لتساهم في فهم المبادئ البيولوجية الأساسية وتطوير المعرفة التي من المتوقع أن يستفيد البشر من خيارات العلاج أفضل. ويرجع ذلك إلى الآليات التي تشارك في هذه الأمور، كان لا بد من دراستها في الجسم الحي، كما هو الحال في المختبر أساليب قد لا توفر تمثيل واقعي للأمراض البشرية.
قد تؤدي هذه التحقيقات إلى اكتشاف الأهداف ذات الصلة لخيارات العلاج الوقائي لخفض تكرار الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
حكومة فرانكونيا الأوسط في بافاريا، ألمانيا، إذن لإجراءات وصفها منح. تتطلب أي تجارب مماثلة إذن مسبق من السلطات المختصة.
ملاحظة: دليل التالية يمكن استخدامها للجماعات التي نوقشت سابقا من A إلى C. خطوات التي يجب أن تترك في مجموعة A و B يتم وضع علامة وفقا لذلك.
1. التحضيرات
- وضعت على قفازات، ضع وسادة البوليسترين تحت المجهر، وتركيز العدسة على منطقة أعلى قليلا من لوحة.
- تقسيم ورقة معقمة ومكان النصف خلال لوحة البوليسترين، والنصف الآخر فقط لأنها المقبل.
- تعقيم الأدوات الجراحية ووضعها على ورقة معقمة القادمة إلى لوحة البوليسترين.
- استقام مشبك الورق كبير لتشكيل قوس. تحويلها رأسا على عقب واضغط عليه في لوحة البوليسترين في نهاية القمة - بجوار حيث رأس الحيوان ستقع.
- وضع لسان حال المرذاذ بين أطرافه اثنينالصورة من القوس. (الشكل 7)
- اقامة مصباح التدفئة حوالي 40 سم من مكان رأس الحيوان ستقع. تأكد من الحرارة على مستوى لوحة البوليسترين لا تتجاوز 40 درجة مئوية.
- إعداد قفص منفصل للحيوانات تشغيلها.
- إعداد تعريف كمية وحجم (بحد أقصى 50 ميكرولتر) من الخلايا السرطانية في أنبوب المرن وتخزينها على الجليد.
2. التخدير
- ضع الماوس في مربع من الزجاج ويبدأ الاستقراء مخدر على الأيزوفلورين تدفق عالية (5٪ الأيزوفلورين في تدفق 10 لتر / دقيقة).
- بعد أن يمر في مراحل مختلفة من التخدير، وإزالة الماوس من مربع من الزجاج فقط بعد أن دخلت مرحلة التنفس احتضارية، والتي يمكن بسهولة أن معترف بها من انخفاض حاد في معدل التنفس (<20 / دقيقة) وصيحات عميقة تهز جسم الحيوان بأكمله.
- المكان بسرعة الحيوان البطن حتى على العقيمة ثنى تغطيتها لوحة البوليسترين والاستمرارالتهوية على الأيزوفلورين منخفضة التدفق عن طريق إدراج خطم الماوس، إلى لسان حال للحفاظ على التخدير. استخدام جزء الشهيق من 1،8-2،2٪ في تدفق حوالي 1 لتر / دقيقة.
- تقييم عمق التخدير أثناء العملية عن طريق حساب وتيرة التنفس، وهو مثالي بين 45 و 60 نفسا في الدقيقة. تكييف جزء الأيزوفلورين الشهيق وفقا لذلك إذا كان هذا ليس هو الحال.
ملاحظة: التغييرات في جزء الأيزوفلورين الشهيق يستغرق حوالي 60 ثانية حتى تصبح سارية المفعول. تجنب تنفيذ تغييرات جذرية بسرعة. بدلا من ذلك، تعديل تطبيق التخدير تدريجيا.
3. عملية
- تطهير الصدر والبطن مع مطهر مناسب وتغيير القفازات بعد ذلك.
- حقن حجم المكيف للوزن كاربروفين (5 ملغم / كغم من وزن الجسم) في الفخذ الحيوان.
- قرصة بلطف الجلد في منطقة البطن مع ملقط لاختبار إذا كان عمق التخدير كافية.
- بعناية تشريح المنطقة المحيطة الخنجري لفضح ذلك من الأنسجة المحيطة بها.
- وضع خياطة البقاء من خلال الخنجري (من الداخل الى الخارج) وإرفاق كل من المواضيع على التجنيب فوق الحيوانات الرأس باستخدام المشبك.
- قرصة أطرافه ضام معا وإدخال ببطء "U" نصائح ضام على شكل طول جدار البطن الداخلي الحيوان.
ملاحظة: هذه الإجراءات تعرض الكبد لتسهيل الوصول إلى فصوص مختلفة. تحديد الفص الجانبي المتوسط والأيسر الكبد الآن يجب أن يكون ممكنا. - استخدام قطعة من القطن غارقة في المياه المالحة، ودفع بلطف الفص المتوسط نزولا. تشريح ثلاثة أرباع البطنية من الرباط المنجلي، والتي سوف تكون مرئية الآن بين سطح الفص المتوسط والحجاب الحاجز.
- الآن، استخدام اثنين من مسحات القطن غارقة في المياه المالحة لتحويل المتوسطالفص وترك الفص الجانبي صعودا ضد الحجاب الحاجز.
- تصور غشاء رقيق بين الفص الجانبي الأيسر والفص المذنب وتشريح بعناية.
ملاحظة: عند تنفيذ هذا البروتوكول على الحيوانات من المجموعة (أ)، والقفز إلى الخطوة 3.18 عند هذه النقطة. - وضع ربطة حجم 4-0 قطريا على طول قاعدة الفص الجانبي الأيسر ل.
- بعد ذلك، استخدام ممسحة قطنية للعودة الفص الجانبي الأيسر إلى موقعها الأصلي.
- بعناية ربط ربطة أقرب إلى قاعدة فصوص ممكن وتقييم لتغيير اللون في الفص لاختبار لإمدادات الدم توقف على نحو كاف.
- بتر الفص الجانبي الأيسر باتباع خط قاعدة الفص ونلاحظ وزن الفص مقطوعة ل.
ملاحظة: عند تنفيذ هذا البروتوكول على الحيوانات من المجموعة (ب)، والقفز إلى الخطوة 3.18 عند هذه النقطة. - وضع ربطة الثاني بين الجذع الفص الجانبي الأيسر وقاعدة الفص المتوسط و.
- إعادة الفص المتوسط كما ثالذراع وربطة عنق ربطة. مرة أخرى، وتقييم لتغيير اللون في الفص لاختبار لإمدادات الدم توقف على نحو كاف.
- بتر الفص المتوسط وملاحظة وزنه.
- ربط حقنة 1 مل على إبرة 30 G وملء مع الخلايا السرطانية من الأنبوب المرن دون إمالة حقنة في أي وقت.
- استخدام قطعة قطن لتحريك الحلقات المعوية إلى اليسار الحيوان من أجل فضح الفص الأيمن السفلي.
- إدراج حقنة محملة الخلايا في الجهاز "اليد الثالثة و" في زاوية لعمودي 30 درجة.
- بعناية تحرك الجهاز بجانب الماوس مع إبرة فوق الفص الأيمن السفلي.
- ببطء دفع الحقنة داخل الجهاز ومن ناحية ثالثة حتى رأس الإبرة هو في جزء مركز الفص الأيمن السفلي ل.
- حقن وحدة التخزين بالكامل إلى جانب مركز الفص على مدى فترة من 30-45 ثانية.
- ضغط الحقن لمدة ثلاث دقائق على الأقل حتى توقف النزيف. إزالة خياطة الوقف وضام.
- إغلاق اللفافة مع 5-0 خياطة resorbable باستخدام عقدة زر واحدة.
- إغلاق الجلد مع خياطة 4-0، غير resorbable باستخدام عقدة زر واحدة.
- بدء التهوية الماوس على تدفق الأوكسجين عالية لمدة 1 دقيقة.
4. بعد المرجع الإجراء
- وضع الحيوان في بيئة دافئة (حوالي 40 درجة مئوية) لمدة نصف ساعة المقبلة لضمان استرداد المناسب.
- خلط مياه الشرب الحيوان مع 5 ملغ / مل من ميتاميزول لما بعد الجراحة 72 ساعة.
- فحص سلامة من الغرز بشكل وثيق لمدة ثلاثة أيام على الأقل بعد العملية.
5. فترة المراقبة والقتل الرحيم
- قياس وزن الحيوان يوميا ليصبح المجموع 14 يوما. يسجل لهم بشأن سلامتهم والقيود المفروضة على التوالي.
- بعد 14 يوما، تخدير يلي الحيوان الخطوات 2.1 و 2.2 من بروتوكول المطبق هو لالثانية المضي قدما بروتوكول المؤسسة للقتل الرحيم للحيوانات.
- إجراء عملية فتح البطن وسيطة كما هو موضح في الخطوة 3.4. لتسهيل الوصول إلى البطن، وتمديد سم caudally شق 1-1.5. إدراج ضام كما أشار في 3.7.
- تشريح على طول بقية الرباط المنجلي وقطع الوريد الأجوف السفلي فقط فور خروجها من cranially الكبد.
- فصل الكبد من الحجاب الحاجز، عن طريق الاستيلاء على الحجاب الحاجز مع ملقط وتشريح بصراحة في الفضاء بين الكبد والأنسجة العضلية.
- رفع أنسجة الكبد تعبئة قبالة خلف البريتوان وتشريح تشغيله الهياكل المتبقية انها ما زالت متمسكة: الأنسجة الدهنية خلف الصفاق، والوريد الأجوف السفلي والوريد البابي.
- تفقد الكبد بعد لاستخراج أي نوع من الأنسجة الإضافية، التي من شأنها أن تسهم زورا إلى حجمها الفعلي والوزن. يتم عرض على الكبد واستخراج ورم في الشكل (6).
- تشريح الورم من الوقود النووي المشعerior الفص الأيمن.
- قياس حجم ووزن كل من الورم وحمة الكبد.
- الحفاظ على عينات إضافية من أنسجة الغشاء البريتوني، والعقد اللمفاوية أو الأجهزة الأخرى حسب الحاجة لتحليل الأنسجة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجربة معينة لدينا، وشملت 30 عارية foxn1nu / نو الفئران athymic. حصلوا على البطن وسيطة، حقن الخلايا السرطانية من 500،000 الخلايا السرطانية MC38 (المنحلة في 50 ميكرولتر من المياه المالحة)، ويعاملون بعد ذلك إما مع استئصال 70٪ الكبد، 30٪ استئصال الكبد، أو أي تدخل آخر.
بعد 14 يوما، وتجديد شبه كامل للكبد المتبقية يلي 30٪ أو 70٪ استئصال الكبد (الكبد وتضخم مؤشر من 30٪ في مجموعة استئصال الكبد و1.06 مقابل 0.8 من 70٪ في مجموعة استئصال الكبد) لوحظ.
بعد فتح البطن واحد، وكان متوسط وزن الأورام داخل الكبد 332 ملغ (المدى: 10-608 ملغ). وكان متوسط وزن الورم من الأورام داخل الكبد 656 ملغ (المدى: 76-1،873 ملغ) بعد 30٪ استئصال الكبد مقابل 961 ملغ (المدى: 189 mg- 3030 ملغ) بعد استئصال الكبد 70٪ مع ع & #60؛ 0.05 (الشكل 1). بعد 30٪ استئصال الكبد، وكان حجم الورم 950 مم 3 (المدى: 439-2،326 ملم 3) مقابل 1385 مم 3 (المدى: 411-2،366 ملم 3) بعد 70٪ استئصال الكبد، و 511 مم 3 (المدى: 87-1،693 مم 3) بعد فتح البطن وحدها مع ع <0.05 (الشكل 2).
أخذت أقسام الأنسجة من نسيج الورم وتحليلها عبر KI-67 المناعية. وجرى تقييم الخلايا على الشرائح بخصوص معدل انتشارها. وكان متوسط معدل انتشار الخلايا السرطانية من مجموعة البطن 47٪ (المدى: 39-56٪) مقارنة ب 61٪ (المدى: 51-69٪) من الحيوانات التي خضعت لاستئصال الكبد بنسبة 70٪ (P <0.05) و 53٪ (المدى: 38-69٪) من الحيوانات التي خضعت لاستئصال الكبد بنسبة 30٪ (ع = 0.22)، مما يدل على زيادة معدل تكاثر الخلايا في المجموعات التي خضعت لاستئصال الكبد (الشكلان 3 - 5).
الشكل 1: وزن داخل الكبد الأورام يقارن الرسم البياني متوسط وزن الورم بين المجموعات A، B و C بعد تشريح من الكبد ويظهر زيادة الوزن في الأورام من مجموعة B و C. أشرطة الخطأ تمثل SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حجم الأورام داخل الكبد ويقارن الرسم البياني متوسط حجم الورم بين المجموعات A، B و C بعد تشريح من الكبد وزيادة البرامج مجلدات في الأورام من مجموعة B و C. أشرطة الخطأ تمثل SEM. عنخ "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): انتشار في معدل الأورام من المجموعة الاولى KI-67 المناعية شريحة من عينة ورم من المجموعة (أ) يدل على انتشار خفيف من الخلايا السرطانية. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: انتشار في معدل الأورام من المجموعة الثانية. KI-67 المناعية شريحة من عينة ورم من المجموعة (ب) يدل على انتشار معتدلة من الخلايا السرطانية. شريط مقياس = 100 ميكرون.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: انتشار في معدل الأورام من المجموعة الثالثة KI-67 المناعية شريحة من عينة ورم من مجموعة C يدل على انتشار ملحوظ للخلايا السرطانية. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: المستخرجة عينة الكبد / ورم من المجموعة الثانية تم استخراج هذه الكبد 14 يوما بعد إجراء استئصال الكبد 30٪ ومتزامنة حقن الخلايا السرطانية. ويمكن رؤية الورم كبير في الصحيح الفص السفلي، في حين أن الصحيح متفوقة والوسيط والمذنبة الفصوقد ذهب الصورة من خلال تضخم كبير.
* = ورم في الفص الأيمن السفلي، SRL = الفص الأيمن متفوقة، ML = متوسط الفص، CL = المذنبة الفص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: أو إعداد جدول تغطي لوحة البوليسترين بواسطة قطعة قماش معقمة. يتم الضغط على عازمة فتح مشبك الورق إلى لوحة في نهايته العليا التي تغمر أنبوب التنفس مع سان حال لها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكانت التجارب السابقة إجراء العمليات الجراحية في القوارض قادرة على تحديد بعض المتغيرات التي يمكن أن تكون مصادر للتحيز. من أجل الحصول على نتائج موثوقة وصحيحة، والنظر في الاحتياطات التالية.
روتين ما قبل المرجع الصيام يمكن أن تؤدي إلى تشحم الكبد 12، والتي قد تحول دون تجديد الكبد 13،14. ولذلك لا ينصح به. أعلى نشاط الإنقسامية من خلايا الكبد يختلف طوال اليوم 15. إذا كان ذلك ممكنا، وإجراء الإجراءات في وقت معين خلال اليوم لجميع الفئات. الفئران تجديد الكبد هو الأكثر فعالية في الحيوانات 4-6 أسابيع من العمر. الحيوانات التي يزيد عمرها عن 10 شهرا من العمر لديها الانخفاض الكبير في القدرة تجديد 16. استخدام الفئران للجنس نفسه، والجنس والعمر للتجارب لتقليل فرصة من التحيز. العمل في بيئة معقمة المهم عموما في إجراء مفتوحة مثل هذه. خصوصا في الكائنات المناعة، مثل athymi الفئران ج المستخدمة في الفيديو، وخطر العدوى، مما قد يؤدي إلى الوفاة المبكرة أو نتائج متحيزة، مرتفع. اتباع ثلاث منطقة في الإعداد تتألف من إعداد، لعملية جراحية ومنطقة الانتعاش بالتالي له ما يبرره 17. نظرا لآثارها السمية الكبدية عميقة، لا ينصح يشيع استخدامها البوبرينورفين للداخل الجزيئات أو بعد العملية الجراحية العلاج مسكن 18،19. استخدام مواد أخرى مثل كاربروفين أو ميتاميزول لتوفير تسكين الألم المناسب. منذ ميتاميزول غير متوفر في العديد من البلدان، كاربروفين يمكن أيضا أن تستخدم للسيطرة على الألم بعد العملية. إجراء الحقن تحت الجلد من 5mg / كغم من وزن الجسم مرة واحدة يوميا لمدة ثلاثة أيام لاستبدال ميتاميزول.
وأفضل طريقة لتحقيق الانتعاش بعد العملية الجراحية عندما يتم وضع الماوس يتعافى في بيئة دافئة مع سهولة الوصول إلى الغذاء والماء. وهو معزول بشكل مثالي من الفئران الأخرى بين عشية وضحاها، لمنع الحيوانات أكثر هيمنة من إيذاء هم أكثر عرضة 17.
jove_content "> على الرغم من أن البروتوكول هو بسيط جدا، وهناك بعض العثرات الصغيرة لتجنب عند تنفيذ هذا النوع من الجراحة في الفئران. تشريح الرباط المنجلي، بنية ربط الجانب البطني من الفص المتوسط لجدار البطن، أمر ضروري ل تحقيق المرونة الكبد المناسبة. كما يوسع هذا الرباط إلى منطقة قريبة جدا من النقطة التي يترك الوريد الأجوف السفلي الكبد cranially، هناك ما يبرر الحذر من أجل منع تلف هذا المنطلق الرئيسي. وفي المتوسط، تشريح هو حوالي ثلاثة أرباع فإن طريقة ضمان تعبئة مرضية، وفي الوقت نفسه الحفاظ على مسافة كافية للسفينة.باستخدام كمية مناسبة من التوتر عندما ligating الفص مع ربطة مهمة بالغة الأهمية عند تنفيذ بروتوكول بتر. اربطة مع عقدة الهواء أو الأربطة ضعيفة شددت يمكن أن يؤدي إلى انقطاع تدفق الدم بشكل كاف، والنزف والصدمة والموت. في نفس الوقت، وهو attemحزب العمال لتشديد بدقة عقدة ربطة قد يؤدي إلى تمزق رباط مع الأضرار المرتبطة الأنسجة المحيطة والأعضاء. وسيلة فعالة لتقييم سلامة الربطة هي مراقبة تغير اللون مزرقة داخل الفص ligated. اختيار المواد خياطة الصحيحة أيضا يلعب دورا هاما. هم أكثر عرضة لضغط الأنسجة، في حين أن المواد monofilamentous سوف يحللون وليس من خلال أنسجة الكبد لينة ويسبب نزيف خيوط مضفر.
خطوة أخرى حاسمة عند إزالة فصوص الكبد في الفئران تتضمن تحديد المواقع الصحيحة من الأربطة. يجب أن يؤديها عمودي على السفن الرئيسية دخول فصوص ربط. في حين أن هذا واضح ومباشر وليس في الفص المتوسط، استئصال كاف من الفص الجانبي الأيسر هو أكثر تحديا. سفنها تدخل الفص في اتجاه ventro الذيلية. ونتيجة لذلك، يجب وضع موضوع رباط على طول خط وهمي بين قاعدة اندفع اليسار إلى الفص الأيمن السفلي لللإيفر.
في الفص المتوسط، ومع ذلك، بتر قد تعرض الوريد الأجوف السفلي. لأن هذه السفينة الرئيسية يمر عبر الجزء الظهري للشحمة الأذن، وأنها معرضة للتلف، مما قد يؤدي إلى نخر الكبد. وعلاوة على ذلك، ربط ربطة مع الكثير من التوتر في هذه المنطقة، قد يؤدي إلى تمزق الحجاب الحاجز و / أو استرواح الصدر.
معالجة كافية من الخلايا السرطانية مهم أيضا عند محاولة الحصول على نتائج مماثلة. وإن لم يكن من المفترض تقنيات زراعة الخلايا الدقيقة لتكون جزءا من هذا البروتوكول، والتعامل مع الخلايا السرطانية داخل الإجراء لا يقل أهمية عن إعداد مثالية مسبقا. عند ملء الحقنة مع الخلايا السرطانية، فمن الأهمية بمكان أن يبقيه منتصبا في جميع الأوقات. إمالة الرئيسية للحقنة قد يؤدي إلى الخلايا السرطانية التمسك الجدار الحقن، وبالتالي يؤدي إلى فقدان الخلايا في وقت الحقن. هناك ما يبرر إمالة طفيفة فقط في وقت الحقن، وذلك لادخال الإبرة فيpendicular إلى سطح الفص الأيمن السفلي ل.
قد يحدث نزيف والبريتوني الانبثاث نتيجة للنزيف وتسرب من موقع ثقب على سطح الكبد. وبالتالي، ضغط لطيف من الفص مع قطعة من القطن لمدة ثلاث دقائق أمر ضروري للسيطرة على النزيف من لحمة الكبد ومنع السوائل الخلايا السرطانية تسرب في الصفاق.
المنشورات التي تحتوي على بروتوكولات إجراء عمليات داخل البطن في القوارض نادرا ما تحتوي على معلومات حول نوع من إغلاق البطن. ومع ذلك، وهذا الجانب هو مصدر محتمل آخر من المضاعفات. حتى مع السيطرة على الألم كافية، والحيوانات محاولة لإزالة الأجسام الغريبة في جدار البطن بهم. قد تكون العواقب العدوى داخل البطن، والبطن مفتوحة أو حتى الموت. يمكن الوقاية من هذا من قبل كل من طريقة تنفيذ غرز توقف واحدة لإغلاق الجرح بدلا من خياطة تشغيل وإغلاق جدار البطن في طبقتين.
واستخدمت الإناث athymic الفئران عارية-foxn1nu / نو (المقدمة من هارلان مختبرات BV، Kreuzelweg 53، NL-5961 NM هورست) في هذه التجربة. نقص خلايا T يعرف هذا الصنف ليسمح نمو الورم غير مقيد نسبيا وشروط بالتالي مثالية لزرع الورم. من أجل الحد من نفوذ كبار معارك بين الحيوانات، واستخدمت فقط إناث الحيوانات. وقد أظهرت النتائج الأولية باستخدام سلالات مختلفة مثل الفئران الفطرية C57BL / 6 أيضا كبير، بعد انخفاض نمو الورم حجم. وبالتالي، من المحتمل جدا أن تكون هذه التقنية عمليا في المزيد من سلالات الفئران.
ومع ذلك، واستخدام الكائنات الحية المناعة في هذا الإعداد يتطلب احتياطات خاصة للنظافة الحيوان، ومسببات الأمراض قد تتداخل مع نمو الورم 20. تدابير مثل استخدام الحيوانات الحارس لمراقبة وجود العوامل المسببة للأمراض 21 كما يؤديها في منشأة التجارب على الحيوانات استغرق دراستنا تجري في يمكن ان يكون مفيدالتر في الكشف عن المصادر المحتملة للتحيز.
استخدمت هذه التجربة خط خلايا سرطان القولون والمستقيم الفئران دعا MC38 (تم الحصول عليها من معهد الكيمياء السريرية في كلية الطب في مدينة مانهايم، ألمانيا). وتم حل 5 × 10 5 الخلايا السرطانية إلى 50 ميكرولتر من المياه المالحة. تم تحديد تركيز في التجارب الأولية، حيث تم تحديد هذا المبلغ مثالية لتشكيل الأورام الصلبة في غضون أسبوعين. اعتمادا على أهلية المناعة في الحيوانات المستخدمة في هذه التجارب (انظر المناقشة أعلاه)، قد بشكل جيد للغاية أيضا يكون من الممكن استخدام خلايا سرطان القولون والمستقيم الإنسان، وبالتالي خلق طعم أجنبي. كان الاختبار الأولي التي أجريت في عارية foxn1nu الفئران athymic / نو باستخدام الخلايا السرطانية SW480 الإنسان قادرة على إثبات بنجاح نمو الورم في الكبد بعد استئصال بقايا. بسبب البعد من كبد الفئران، فمن المستحسن أن أحجام الاستخدامات الوحيدة تصل إلى 50 ميكرولتر لمنع المضاعفات. وتعزيز الممكن في هذه المرحلة من شأنهيكون لتسمية الخلايا السرطانية مع وسيفيراز. اعتمادا على المشكلة التي يتم التحقيق فيها، قد تنشأ معلومات مثيرة للاهتمام عندما توثيق ورصد نمو الخلايا السرطانية وحجم ممكن.
وتشمل وسائل بديلة لligating فصوص الكبد طريقة لقطة 22 أو تقنية الهجين لقطة-خياطة 23. تحديد المواقع أجهزة قطة، ومع ذلك، قد تجعل طرق لقطة صعبة. يقوم كاف ربط الخيط لا يزال وسيلة سهلة لتعلم تقنية، ومن المحتمل جدا أن يكون معظم التكلفة وسيلة فعالة لإزالة الفص في هذه التجربة.
لأنه يتم استخدام الحيوانات الحية في هذه التجربة، فإنه يتطلب الحصول على إذن مسبق من السلطات المختصة. اعتمادا على المنطقة، وهذا يمكن أن يكون مهمة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. حتى بعد الموافقة الرسمية، التجارب على الحيوانات لا تزال بعيدة يصعب الوصول إليها من طرق البحث مثل اختبار ثقافة خلية أو الأساليب الجزيئية. وبالإضافة إلى البنية التحتية للالحديث منشأة التجارب على الحيوانات، ومعدات خاصة لابد من تخصيص من أجل أداء البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ينبغي تحديد مواعيد لإتقان هذه التقنية فترة من أسبوعين إلى أربعة أسابيع. قد ينطبق على مجموعة واسعة من خطوط الخلايا في عدد كبير من سلالات الفئران هذا البروتوكول. ومع ذلك، وفيما يتعلق التعديلات المحتملة المذكورة أعلاه، قد تدرس ليس كل خط الخلية في كل كائن حي.
وهناك الهدف الرئيسي من الدراسات الاستقصائية باستخدام هذا البروتوكول أن يكون نظام عامل النمو معقدة تشارك في تجديد الكبد والآثار بالضبط على تكرار الورم الخبيث في الكبد. من أجل تحقيق هذه الارتباطات المحتملة على نحو كاف، فمن الضروري لتنفيذ تجربة الحيوان، وعلى النقيض من الأساليب الجزيئية مختلفة أو تجارب زراعة الخلايا. يجب أن يكون بدلا من استخدام هذه الطرق كوسيلة مجانية من التحقيق. على الرغم من أن العديد من النماذج استئصال الكبد المختلفة وقد نشرت حتى الآن 22-24، هذا الإجراءلأول مرة تنفذ في وقت واحد حقن الخلايا السرطانية في عملية راسخة.
يوضح هذا نموذج الفأر أن استئصال الكبد في الفئران هي طريقة بسيطة إلى حد ما، من الممكن وقابلة للتكرار بسهولة. كان تجديد الكبد بعد استئصال صغرى وكبرى قادرة على تعويض فقدان الأنسجة التي تضخم في غضون أسبوعين. يمكن أن الفئران التعامل مع تخفيضات حجم الكبد لمدة تصل إلى 70٪.
وكانت الخلايا السرطانية قادرة على النمو داخل الكبد بقايا ويمكن أن تنشأ الأورام الصلبة. نمو الورم وانتشار الخلايا السرطانية ترتبط مع كمية من أنسجة الكبد مقطوعة. عملية الرصاص استئصال لتفعيل نمو الورم داخل الكبد المتبقية، وهو ما عبر عنه، من خلال أكبر الأوزان ورم وحدات التخزين. يمكن أن يظهر هذا درجة أكبر من الانتشار عن طريق الامتحانات المناعية.
ومن المعروف أن كمية من القوات المسلحة الكونغولية تجديد الكبدالاختصاصات أفرجت عن زيادة تضخم الكبد مع مدى استئصال الكبد 25،26. ولذلك، فإن العلاقة بين العوامل تجديد الكبد ونمو الخلايا السرطانية قد تكون موجودة. هذا هو في التوافق مع الملاحظات السريرية حيث يرتبط تكرار النقيلي مع كمية من الانبثاث داخل الكبد قبل الاستئصال. الانبثاث الكبد التي هي واضحة في التصوير قبل الجراحة قد تعكس سوى غيض من فيض بينما أكثر من ذلك، لم الودائع الخلايا السرطانية للكشف، قد تكون موجودة عند التشخيص. بعد استئصال الكبد، قد العوامل تجديد الكبد ثم تحفيز نمو هذه الخلايا السرطانية، والذي أصبح واضحا في نهاية المطاف كما الانبثاث المتكررة.
على الرغم من أن العلاقة المذكورة أعلاه من المرجح جدا، لم يثبت حتى الآن. وبالتالي فإن تأثير آليات تجديد الكبد عن التقدم الورم داخل الكبد يتطلب المزيد من التحليلات الجزيئية. تعليمات دقيقة وكذلك شريط فيديو توضيحي تسمح التبني السريعهذه التقنية التي أدخلت في هذا الفيديو. ويمكن أن تكون بمثابة الأساس لأنواع مختلفة من الدراسات حول العالم أن تحاول اكتشاف الحلقة المفقودة في هذه السلسلة المعروفة للأحداث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
شكر وتقدير خاص إلى الدكتور بنيامين Motsch لمساعدته في المسائل الفنية. فإن الكتاب أود أيضا أن نعترف الدكتور ماركوس Forschner وبيرك مولر لدعم الوسائط المتعددة الخاصة، إيريكا Magelky للحصول على الخبرة التحريرية لها وليزا HORNUNG الدكتور رولاند Jurgons والبروفيسور ستيفان فون Hörsten (كل من فرانز بنزولت سنتر، جامعة الاحتفالات) على مهنيتهم في التعامل مع الحيوان والرعاية. نشكر الأستاذ مايكل Neumaier في معهد الكيمياء السريرية، كلية الطب مانهايم من جامعة هايدلبرغ، ألمانيا لتوفير خلايا MC38 الورم.
تم تنفيذ هذا العمل في استيفاء متطلبات الحصول على درجة "دكتور ميد". في فريدريك الكسندر-جامعة إيرلانغن نورنبرغ (وحدة التحليل المالي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
