Abstract
Den höga förekomsten av tumörrecidiv efter resektion av metastatiska leverskador är fortfarande ett olöst problem. Små tumörcells insättningar, som inte detekteras genom rutinmässig klinisk avbildning, kan stimuleras av leverregenereringsfaktorer efter leverresektion. Det är inte helt klarlagt, men vilka faktorer som är avgörande för tumörrecidiv.
De presenterade musmodellen kan vara värdefullt att undersöka de mekanismer som spelar en roll i utvecklingen av återkommande maligna lesioner efter leverresektion. Modellen kombinerar lätt utföra och reproducerbara tekniker för definierade mängder av levervävnad bort och tumörinduktion (genom injektion) i möss. Djuren behandlades med antingen en enda laparotomi, en 30% leverresektion, eller en 70% leverresektion. Alla djur mottog därefter en tumörcellinjektion i det återstående levervävnaden. Efter två veckor av observation, var levrarna och tumörer utvärderades med avseende på storlek och vikt ochundersöktes genom immunhistokemi.
Efter en 70% leverresektion, var tumörvolymen och vikt ökade signifikant jämfört med en laparotomi enbart (p <0,05). Dessutom immunohistokemi (Ki67) visade en ökad tumörproliferationshastighet i Fristationen gruppen (p <0,05).
Dessa fynd visar påverkan av leverregenereringsmekanismer på intrahepatisk tumörtillväxt. I kombination med metoder som histologiska upparbetning eller RNA-analys, kan den beskrivna musmodell tjäna som grund för en noggrann undersökning av olika faktorer som är inblandade i tumörtillväxt och metastatisk sjukdom återfall i levern. Ett stort antal variabler som längden på postoperativ observation, den cellinje som används för injektion eller tidpunkten för injektion och leverresektion erbjuder flera vinklar när utforska en specifik fråga i samband med efter hepatektomi metastaser. Begränsningarna med detta förfarande är authorization att utföra proceduren på djur, tillgång till ett lämpligt djur testanläggning och förvärv av viss utrustning.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) står för nästan 9% av samtliga elakartade tumörer. Det är den tredje vanligaste cancerformen, både i USA och i hela världen. Global dödlighet från CRC intervallet från 300.000 till över 500.000 per år 1. Tjugo procent av patienterna lider av levermetastaser vid upptäckten av deras kolorektal tumör. Resekerbara metastaser normalt behandlas av en partiell leverresektion 2,3. Förbättrade kirurgiska tekniker, nya multimodala strategier och nya definitioner av resekerbara metastaser gör behandlingen av en partiell leverresektion möjligt för ett ökande antal patienter 4.
Återfall av sekundära lever maligniteter, dock är en utmanande klinisk sequalae i modern gastrointestinal kirurgi. Patienter med CRC som genomgick resektion av levermetastaser har en chans 30-50% att utveckla en ny tumör i deras kvarleva lever fem. Därför finns det ett behov av ytterligare forskning ommekanismer som är involverade i återkommande levermetastaser.
En lever resektion av ca 70% är normalt kompenseras inom några veckor av den återstående levervävnad. Denna regenerering inbegriper multipla mekanismer, inklusive cytokiner såsom interleukin 6 (IL-6), tumömekrosfaktor alfa (TNF-α), hepatocyt tillväxtfaktor (HGF), transformerande tillväxtfaktor beta (TGF-β), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF ), matrismetalloproteaser (MMP-2 och MMP-9) och CXC-kemokiner 6-11. Dessa ämnen stödjer leverregenerering och kan även vara ansvarig för de höga återfallsfrekvens av primära och sekundära lever maligniteter genom att inducera tillväxt av små tumörcells insättningar i den kvarvarande levern som inte upptäcks av rutinmässig klinisk avbildning. Denna orsakssamband har inte visat sig så långt.
Följande hypotes bildades. Efter partiell leverresektion, de faktorer som spridning är ansvariga för levander hypertrofi kan också inducera tillväxten av tidigare oupptäckta tumörceller i levern. En musmodell designades som kombinerade de metoder för leverresektion och tumörinduktion. Trettio atymiska naken-foxn1nu / nu-möss delades in i tre grupper om tio djur vardera. Var och en av dem behandlades med antingen en laparotomi enbart (grupp A), en 30% leverresektion (grupp B) eller en 70% leverresektion (grupp C). Djur i alla grupper mottog därefter en tumörcell injektion i en definierad återstående delen av levern, för att simulera vilande tumörceller. Djur där observerades under två veckor och sedan utvärderades med avseende på tumörtillväxt och leverhypertrofi.
Målet var att skapa en modell som kan användas för att söka efter de molekylära och patogenetiska faktorer som kan spela en roll i efter hepatektomi tumörbildning. Denna metod kan vara till hjälp vid bedömningen: ursprung endokrina faktorer som lever regenerering; de ansvariga mekanismer för intrahepatisk tumeller tillväxt efter leverresektion; och leverresektion volym som behövs för intrahepatisk tumörtillväxt induktion. Följande metod har endast utförts på djur, eftersom de lovar att bidra till förståelsen av grundläggande biologiska principer och utveckling av kunskap som kan förväntas gynna människor genom förbättrade behandlingsalternativ. På grund av de mekanismer som är involverade i dessa frågor, måste det undersökas in vivo, som in vitro-metoder inte kan ge en realistisk återgivning av den mänskliga patologi.
Dessa undersökningar kan leda till upptäckten av relevanta mål för profylaktiska behandlingsalternativ för att minska tumöråterfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Regeringen i mellersta Franken i Bayern, Tyskland, tillåtelse för de förfaranden som beskrivs. Eventuella liknande experiment kräver förhandstillstånd från de behöriga myndigheterna.
Obs: Följande handbok kan användas för tidigare diskuterats grupper A till C. Steg som måste lämnas ut i grupperna A och B är märkta i enlighet med detta.
1. Förberedelser
- Sätt på handskar, placera polystyren dynan under mikroskopet och fokusera linsen på området något över dynan.
- Split den sterila blad och plats hälften under polystyren plattan och den andra hälften precis bredvid den.
- Sterilisera kirurgiska instrument och placera dem på en steril ark intill Polystyren dynan.
- Räta ett gem för att bilda en båge. Vändas upp och ner och tryck in den i polystyren plattan vid den övre änden - precis bredvid där djurets huvud kommer att ligga.
- Placera munstycket av förångaren mellan de två lems av bågen. (Figur 7)
- Inrätta en värmelampa om 40 cm från den plats där djurets huvud kommer att ligga. Kontrollera att värme vid nivån för polystyren dynan inte överstiger 40 ° C.
- Förbered en separat bur för drivs djur.
- Förbereda en definierad mängd och volym (högst 50 | j, l) av tumörceller i ett flexröret och lagra den på is.
2. Anestesi
- Placera musen i en plexiglas låda och börja anestetika på högt flöde isofluran (5% isofluran vid ett flöde av 10 L / min).
- Efter att ha gått igenom de olika stadierna av anestesi, ta bort musen från rutan plexiglas precis efter att det har kommit in i stadiet av agonal andning, som lätt kan kännas igen av en drastisk minskning av andningsfrekvens (<20 / min) och djupa flämtar skaka djurets hela kropp.
- Snabbt placera djuret magen upp till den sterila duken täckt polystyren pad och fortsättaventilation på lågt flöde isofluran genom att föra in musens nos i munstycket för att upprätthålla anestesi. Använd en inandnings fraktion av 1,8-2,2% vid ett flöde av ca 1 l / min.
- Utvärdera anestesidjupet under operationen genom att beräkna andningsfrekvensen, vilket är idealiskt mellan 45 och 60 andetag per minut. Anpassa inandnings isofluran fraktionen i enlighet med om så inte är fallet.
Obs: Förändringar i inandnings isofluran fraktionen tar ungefär 60 sekunder tills de blir effektiva. Undvik att utföra drastiska förändringar snabbt. Istället ändra anestesi ansökan gradvis.
3. Användning
- Desinficera bröstet och buken med en adekvat desinfektionsmedel och byta handskar efteråt.
- Injicera en vikt anpassad volym av karprofen (5 mg / kg kroppsvikt) i djurets lår.
- Försiktigt nypa bukhuden med en tång för att testa om anestesidjupet är tillräckligt.
- dissekera noggrant området runt xiphoid att exponera det från den omgivande vävnaden.
- Placera en vistelse sutur genom xiphoid (från insidan till utsidan) och fäst båda trådarna till hållaren ovanför huvudet djuren med hjälp av klämman.
- Nyp sårhaken lemmar tillsammans och sakta införa "U" -formade upprullningsdon tips längs djurets inre bukväggen.
Obs: Dessa åtgärder exponera levern att underlätta tillgången till de olika lober. Identifieringen av leverns median och vänster sido lob bör nu vara möjligt. - Använd en saltlösning indränkt bomullstuss och tryck försiktigt median lob nedåt. Dissekera ventrala tre fjärdedelar av falciformligament, som nu kommer att synas mellan median loben yta och membranet.
- Nu använder två saltlösning indränkt tops att flytta medianlob och vänster sido lob uppåt mot membranet.
- Visualisera det tunna membranet mellan vänster sido lob och caudatus lob och noggrant analysera det.
Obs: När du utför detta protokoll på djur från grupp A, hoppa till steg 3,18 vid denna tidpunkt. - Placera en storlek 4-0 ligatur diagonalt längs den vänstra sido lob bas.
- Nästa använder bomullstuss att återvända vänster sido loben till sitt ursprungsläge.
- Noggrant binda ligaturen så nära lobens bas som möjligt och bedöma för färgförändring i loben för att testa för adekvat avbruten blodtillförsel.
- Resect vänster sido loben genom att följa linjen av loben bas och notera resekterade lob vikt.
Obs: När du utför detta protokoll på djur från grupp B, hoppa till steg 3,18 vid denna tidpunkt. - Placera en andra ligatur mellan vänster sido lob stump och median lob bas.
- Flytta median lob som well och binda ligatur. Återigen, fastställ färgförändring i loben för att testa för adekvat avbruten blodtillförsel.
- Resect median loben och notera sin vikt.
- Anslut en ml sprutan till 30 G-nål och fylla den med tumörceller från den flexibla röret utan att luta sprutan när som helst.
- Använd tops att flytta tarmslingor till djurets vänstra för att exponera sämre högra loben.
- Sätt i cell laddade sprutan i "tredje hand" enhet i 30 ° vinkel mot vertikalplanet.
- Flytta försiktigt enheten bredvid musen med nålen strax ovanför den nedre högra loben.
- Sakta föra sprutan i tredje hand enheten tills nålens spets är i sämre höger lob centrum del.
- Injicera hela volymen i loben centrum delen över en period av 30-45 sek.
- Komprimera injektionsstället under minst tre minuter tills blödningen har upphört.
- Stäng fascia med en resorberbar 5-0 sutur använder enda knapp knop.
- Stänga huden med en 4-0, icke-resorberbar sutur med användning enda knapp knop.
- Börja ventilera musen på högt flöde syre under ca 1 min.
4. Post-op förfarande
- Placera djuret i en varm miljö (ca 40 ° C) för nästa halv timme för att säkerställa adekvat återhämtning.
- Blanda djurets dricksvatten med 5 mg / ml av metamizol för 72 h postoperativt.
- Undersöka integriteten av suturerna noggrant under minst tre dagar efter ingreppet.
5. observationsperioden och dödshjälp
- Mäta djurets vikt per dag under totalt 14 dagar. Betyg dem om deras välbefinnande och begränsningar respektive.
- Efter 14 dagar, söva djuret följande steg 2,1 och 2,2 i det operativa protokollet ennd fortsätta med institutionens protokoll för avlivning.
- Utför en median laparotomi som beskrivs i steg 3,4. För att underlätta tillgången till buken, förlänga snitt 1-1,5 cm kaudalt. Sätt upprullningsdonet som påpekas i 3.7.
- Dissekera längs resten av falciformligament och skär den nedre hålvenen precis som det lämnar levern cranially.
- Separera levern från membranet, genom att ta tag membranet med pincett och rakt på sak dissekera in i utrymmet mellan levern och muskelvävnad.
- Lyft mobiliserade levervävnad från retroperitoneum och dissekera den av de resterande strukturer är det fortfarande kopplade till: retroperitoneal fettvävnad, den nedre hålvenen och portvenen.
- Inspektera levern efter extraktion för ytterligare vävnad, som falskeligen skulle bidra till dess verkliga storlek och vikt. En extraherad levern och dess tumör visas i figur 6.
- Dissekera tumören utanför inferior högra loben.
- Mäta både tumören och leverparenkym storlek och vikt.
- Bevara ytterligare vävnadsprover från bukhinnan, lymfkörtlar eller andra organ som behövs för vävnadsanalys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår specifika experiment, ingår vi 30 atymiska nakna-foxn1nu / nu möss. De fick en median laparotomi, tumörcells injektioner av 500.000 MC38 tumörceller (upplöst i 50 ul saltlösning), och behandlades därefter med antingen en 70% leverresektion, en 30% leverresektion, eller ingen ytterligare intervention.
Efter 14 dagar, nästan fullständig regenerering av den återstående levern efter 30% eller 70% lever resektioner (leverhypertrofi-index för leverresektion gruppen 30% var 1,06 kontra 0,8 från leverresektion gruppen 70%) observerades.
Efter en enda laparotomi, var den genomsnittliga vikten av intrahepatiska tumörer 332 mg (intervall: 10-608 mg). Den genomsnittliga tumörvikten av intrahepatiska tumörer var 656 mg (intervall: 76-1,873 mg) efter en 30% leverresektion vs 961 mg (intervall: 189 mg-3030 mg) efter en 70% leverresektion med p & #60 0,05 (Figur 1). Efter en 30% leverresektion, tumörvolymen var 950 mm 3 (intervall: 439-2,326 mm 3) jämfört med 1385 mm 3 (intervall: 411-2,366 mm 3) efter en 70% leverresektion, och 511 mm 3 (intervall: 87-1,693 mm 3) efter en laparotomi ensam med p <0,05 (Figur 2).
Vävnadssnitt från tumörvävnaden togs och analyserades via KI 67 immunohistokemi. Celler på bilderna utvärderades beträffande deras proliferationshastighet. Den genomsnittliga proliferationshastighet av tumörceller från laparotomi gruppen var 47% (intervall: 39-56%) jämfört med 61% (intervall: 51-69%) från djur som hade genomgått en lever resektion av 70% (p <0,05) och 53% (intervall: 38 till 69%) från djur som hade genomgått en lever resektion av 30% (p = 0,22), vilket visar en ökad frekvens av cellproliferation i grupper som undergick leverresektion (figurerna 3 - 5).
Figur 1:. Vikten av intrahepatiska tumörer Diagrammet jämför den genomsnittliga tumörvikten bland grupperna A, B och C efter dissektion från levern och visar ökad vikt i tumörer i grupp B och C. Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Volym intrahepatiska tumörer Diagrammet jämför den genomsnittliga tumörvolymen bland grupperna A, B och C efter dissektion från levern och visar ökad volym i tumörer i grupp B och C. Felstaplar representerar SEM. ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: proliferationshastighet i tumörer från grupp A. KI-67 Immunhistokemi av en bild från ett tumörprov från grupp A demonstrerar mild proliferation av tumörceller. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: proliferationshastighet i tumörer från Grupp B. KI-67 Immunhistokemi av en bild från ett tumörprov från grupp B visar måttlig proliferation av tumörceller. Skalstreck = 100 | j, m.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: proliferationshastighet i tumörer från grupp C. KI-67 Immunhistokemi av en bild från ett tumörprov från grupp C visar markant proliferation av tumörceller. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Extraherade Lever / tumörprov från grupp B. Denna lever extraherades 14 dagar efter att ha utfört en 30% leverresektion och samtidig tumörcellinjektion. En stor tumör i den högra underlägsna loben kan ses, medan den högra överlägsen, median och caudatus lobs har gått igenom betydande hypertrofi.
* = Tumör i sämre höger lob, SRL = överlägsen högra loben, ML = median lob, CL = caudatus lob. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7:. ELLER tabell Inställning polystyren dynan täcks av en steril duk. En böjd öppen gem pressas in i dynan vid dess övre ände ligger över andningstuben med sin munstycke. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare experiment som utför kirurgi i gnagare har kunnat identifiera vissa variabler som kan tjäna som källor för partiskhet. För att få tillförlitliga och giltiga resultat, beakta följande försiktighetsåtgärder.
Rutin pre-op fasta kan leda till leversteatos 12, som kan hämma leverregenerering 13,14. Det rekommenderas därför inte. Den högsta mitotiska aktiviteten hos hepatocyter varierar under dagen 15. Om möjligt, genomföra förfaranden vid en viss tidpunkt under dagen för alla grupper. Murin leverregenerering är mest effektiv i djur 4-6 veckor gamla. Djur äldre än 10 månader har en signifikant minskad förmåga till återväxt 16. Använd möss av samma ras, kön och ålder för experiment för att minimera risken för partiskhet. Att arbeta i en steril miljö är i allmänhet viktigt i ett öppet förfarande som denna. Särskilt i nedsatt immunförsvar organismer, såsom athymi c-möss som används i videon, risken för infektion, som kan leda till för tidig död eller partiska resultat, är hög. Sysslar en tre-zon-setup som består av ett preparat, en operation och en återställningsområdet är därför motiverat 17. På grund av dess djupa hepatotoxiska effekter, används ofta buprenorfin rekommenderas inte för handel eller postoperativ smärtstillande behandling 18,19. Använd andra ämnen som carprofen eller metamizol att ge adekvat smärtlindring. Eftersom metamizol inte finns i många länder, kan karprofen även användas för smärtlindring efter ingreppet. Utföra en subkutan injektion av 5 mg / kg kroppsvikt en gång dagligen under tre dagar för att ersätta metamizol.
Postoperativ återhämtning uppnås bäst när återhämtar musen placeras i en varm miljö med enkel tillgång till mat och vatten. Det är idealiskt isolerade från andra möss över natten, för att förhindra att mer dominanta djur från att skada mer sårbara 17.
jove_content "> Även om protokollet är mycket enkelt, det finns några små fallgropar att undvika när du utför denna typ av operation i möss. Dissektion av falciformligament, en struktur som förbinder den ventrala aspekten av median loben till bukväggen, är avgörande för att uppnå lämplig lever flexibilitet. Eftersom detta ligament expanderar till ett område mycket nära den punkt där den nedre hålvenen lämnar levern cranially försiktighet befogat för att förhindra skador på denna stora venen. i genomsnitt dissekera det ungefär tre fjärdedelar av sätt kommer att säkerställa tillfredsställande mobilisering och samtidigt upprätthålla tillräckligt avstånd till fartyget.Att använda rätt mängd av spänning när ligera en lob med en ligatur är en oerhört viktig uppgift när du utför Fristationen protokollet. Ligaturer med luft knutar eller dåligt åtdragna ligaturer kan leda till otillräckligt avbruten blodtillförsel, blödning, chock och död. Samtidigt, en attempt att noggrant dra en ligatur knut kan resultera i ligatur brott med tillhörande skador på omgivande vävnad och organ. Ett effektivt sätt att bedöma ligatur integritet är observationen av cyanotic färgförändring inom den ligerade lob. Välja rätt suturmaterial också spelar en viktig roll. Flätade suturer är mer benägna att komprimera vävnad, medan monofilamentous material kommer snarare dissekera genom den mjuka levervävnaden och orsakar blödning.
En annan kritisk steg när du tar bort leverlober hos möss involverar korrekt placering av ligaturer. Ligering bör utföras vinkelrätt mot huvud fartyg som anlöper loberna. Även om detta är ganska enkelt i median lob, är tillräcklig resektion av den vänstra sido lob mer utmanande. Dess fartyg in i lob i en ventro-caudal riktning. Som ett resultat måste ligaturen tråden placeras längs en tänkt linje mellan den vänstra utfall basen till sämre högra loben av liver.
I median loben kan emellertid resektion äventyra den nedre hålvenen. Eftersom detta stora kärl går genom den dorsala delen av lob, är det utsatt för skada, vilket kan leda till levernekros. Dessutom binder ligatur med alltför mycket spänning i detta område kan resultera i membranbrott och / eller pneumothorax.
Adekvat hantering av tumörceller är också viktigt när man försöker att få jämförbara resultat. Även om de exakta cellodlingstekniker inte är avsedda att vara en del av detta protokoll, är lika viktigt som perfekt förberedelse förväg hanteringen av tumörceller i förfarandet. Vid påfyllning av sprutan med tumörcellerna, är det viktigt att hålla den upprätt vid alla tidpunkter. Större lutning av sprutan kan resultera i tumörceller som sitter fast på sprutor väggen, därför resulterar i förlust av celler vid tidpunkten för injektion. Endast mindre lutning är motiverad vid tidpunkten för injektion, i syfte att sätta in nålen perrätt mot den underlägsna höger lob yta.
Blödning och peritoneala metastaser kan uppstå som en följd av blödning och spill från punktionsstället på levern yta. Hence, är avgörande för att kontrollera blödning från levern parenkymet och förhindra tumörcellvätska läcker in i bukhinnan varsam kompression av loben med en bomullspinne under en period av tre minuter.
Publikationer som innehåller procedur protokoll för intraabdominella verksamhet hos gnagare innehåller sällan information om vilken typ av buken stängning. Ändå är en annan möjlig källa till komplikationer denna aspekt. Även med adekvat smärtlindring, kommer djuren att försöka ta bort främmande föremål i deras bukväggen. Konsekvenserna kan vara intraabdominella infektioner, en öppen buk eller dödsfall. Detta kan förhindras genom att båda utför enstaka avbrutna stygn för sårtillslutning i stället för en löpande sutur och stängning av bukväggen i två skikt.
Kvinnlig atymiska nakna-foxn1nu / nu-möss (tillhandahållen av Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) användes i detta experiment. T-cellsbrist denna ras är känd för tillåter relativt obegränsad tumörtillväxt och därför idealiska förhållanden för tumörimplantation. För att minimera inverkan av rankning slagsmål bland djuren, var endast hondjur används. Preliminära resultat med hjälp av olika stammar som de C57BL / 6 inavlade möss har också visat signifikant, men lägre volym tumörtillväxt. Sålunda kan tekniken mycket sannolikt att praktiskt i ännu fler musstammar.
Men med hjälp av nedsatt immunförsvar organismer i den här inställningen kräver speciella djurhygienåtgärder, som patogener kan störa tumörtillväxt 20. Åtgärder som användningen av indikatordjur för att övervaka förekomsten av patogener 21 som utförs i djurförsök anläggningen vår studie tog ske i kan vara helpfuli upptäcka möjliga källor till bias.
Detta experiment använde en murin kolorektal cancer cellinje kallas MC38 (erhållen från Institutionen för klinisk kemi vid medicinska fakulteten i Mannheim, Tyskland). 5 x 10 5 tumörceller upplöstes i 50 pl koksaltlösning. Koncentrationen bestämdes i preliminära experiment, där detta belopp identifierades som idealisk för fast tumörbildning inom två veckor. Beroende på immunkompetens av de djur som används i dessa experiment (se diskussionen ovan), kan det mycket väl också vara möjligt att använda mänskliga kolorektal cancerceller och därmed skapa en xenograft. Inledande tester utförs i atymiska nakna-foxn1nu / nu-möss med användning av humant SW480 tumörceller kunde framgångsrikt demonstrera tumörtillväxt i kvarlevan levern efter resektion. På grund av den dimension av murina lever, är det rekommenderat att bara använda volymer på upp till 50 l att förebygga komplikationer. En möjlig förbättring på denna punkt skullevara att märka tumörcellerna med luciferas. Beroende på det problem som utreds kan intressant information uppstå när närmare övervakning av tumörcelltillväxt och storlek är möjlig.
Alternativa sätt att ligera leverlober inkluderar klippning metod 22 eller en klippning-suturering hybridteknik 23. Placering av klippning enheter kan dock göra klippningsmetoder svårt. Tillfredsställande sätt sutur ligering fortfarande en lätt att lära sig teknik och är mycket sannolikt att vara det mest kostnadseffektiva sättet att ta bort en lob i detta experiment.
Eftersom levande djur används i detta experiment, kräver tillstånd i förväg av de behöriga myndigheterna. Beroende på regionen, kan detta vara en kostsam och tidskrävande uppgift. Även efter officiellt godkännande, djurförsök är mycket mindre tillgängliga än forskningsmetoder som cellodlings testning eller molekylära metoder. Förutom infrastruktur enmoderna djur testanläggning, särskild utrustning måste tilldelas för att utföra protokollet. Dessutom bör en period av två till fyra veckor planeras att behärska denna teknik. Detta protokoll får tillämplig för ett brett spektrum av cellinjer i ett stort antal av musstammar. Ännu, med avseende på de möjliga modifieringar som nämns ovan, inte varje cellinje kan studeras i varje organism.
Ett huvudmål för undersökande studier med detta protokoll kommer att vara det komplexa tillväxtfaktor system som deltar i leverregenerering och dess exakta effekter på lever malignitet återfall. För att undersöka dessa eventuella korrelationer adekvat, är det nödvändigt att genomföra ett djurförsök, i motsats till olika molekylära metoder eller cellodlingsexperiment. Dessa metoder bör snarare användas gratis hjälp av undersökningen. Även om flera olika leverresektion modeller har publicerats hittills 22-24, denna procedurför första gången genomför samtidig tumörcellinjektion i en väl etablerad verksamhet.
Denna musmodell visar att leverresektion i möss är en ganska enkel, genomförbart och enkelt reproducerbar metod. Leverns regeneration efter mindre och större resektioner kunde kompensera förlusten vävnaden genom hypertrofi inom två veckor. Möss klarar minskningar av upp till 70% lever volym.
Tumörceller kunde växa inuti kvarleva levern och solida tumörer kan etableras. Tumörtillväxt och tumörcellproliferation korrelerad med mängden resekterade levervävnad. Processen för resektion leder till en aktivering av tumörtillväxt i den kvarvarande levern, som uttrycktes genom större tumörvikter och volymer. Denna högre grad av proliferation kunde påvisas genom immunhistokemi undersökningar.
Det är väl känt att mängden av hepatisk regenere factorer släpptes för leverhypertrofi ökar med graden av leverresektion 25,26. Därför kan en koppling mellan leverregenereringsfaktorer och tumörcelltillväxt existerar. Detta är i överensstämmelse med kliniska observationer där metastatisk återfall korrelerar med mängden metastaser i levern innan resektion. Levermetastaser som syns på preoperativ avbildning kan endast återspegla toppen av isberget medan mer, ännu inte insättningar detekterbara tumörcell kan förekomma vid diagnos. Efter leverresektion, kan leverregenereringsfaktorer sedan stimulera tillväxten av dessa tumörceller, som så småningom blir uppenbara som återkommande metastaser.
Även om sambandet nämnts ovan är mycket troligt, har det inte visat sig så här långt. Inverkan av leverregenereringsmekanismer på intrahepatisk tumör framsteg kräver därför ytterligare molekylära analyser. Exakta instruktioner samt en belysande video tillåter en snabbt antagandeav tekniken införs i den här videon. Det kan fungera som en grund för olika typer av studier runt om i världen som försöker att upptäcka den felande länken i denna välkända kedja av händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Särskilda bekräftelser gå till Dr Benjamin Motsch för hans hjälp i tekniska frågor. Författarna vill också tacka för Dr Marcus Forschner och Birk Müller för deras stöd för multimedia, Erica Magelky för sin redaktionella kompetens och Lisa Hornung, Dr Roland Jurgons och professor Stephan von Hörsten (alla från Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) för sin professionalism i djurhantering och omsorg. Vi tackar professor Michael Neumaier vid Institutionen för klinisk kemi, medicinska fakulteten Mannheim vid universitetet i Heidelberg, Tyskland för att ge MC38 tumörceller.
Den nuvarande arbete utfördes för att uppfylla kraven för att erhålla examen "Dr. med." vid Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
