Abstract
metastatik karaciğer lezyonlarının rezeksiyonu sonrası tümör nüksü yüksek oranda çözülmemiş bir sorun olmaya devam etmektedir. Rutin klinik görüntüleme algılanamaz küçük tümör hücre mevduat, karaciğer rezeksiyonu sonrası hepatik rejenerasyon faktörleri tarafından uyarılan olabilir. Bu faktörler tümör nüksü için çok önemli olan, ancak, tam olarak belli değil.
sunulan fare modeli karaciğer rezeksiyonu sonrası tekrarlayan malign lezyonların gelişiminde rol oynayan mekanizmaları keşfetmek için yararlı olabilir. Model farelerde karaciğer doku çıkarılması ve (enjeksiyon yoluyla) tümör indüksiyon tanımlanan miktarlarda-gerçekleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir tekniklerini birleştirir. Hayvanlara tek bir laparotomi,% 30 karaciğer rezeksiyonu, ya da% 70 karaciğer rezeksiyonu ile tedavi edildi. Tüm hayvanlar, kalan, karaciğer dokusuna bir tümör hücresi enjeksiyonu yapılmıştır. gözlem iki hafta sonra, karaciğer ve tümörler, ebat ve ağırlık bakımından değerlendirildiimmünohistokimyasal olarak araştırıldı.
% 70 karaciğer rezeksiyonu sonrası, tümör hacmi ve ağırlığı önemli ölçüde yalnız bir laparotomi (p <0.05) artmıştır. Buna ek olarak, immünhistokimya (Ki67) rezeksiyon grubunda artan bir tümör çoğalma hızı (p <0.05).
Bu bulgular intrahepatik tümör büyümesi üzerine hepatik rejenerasyon mekanizmalarının etkisi göstermektedir. histolojik tetkikleri veya RNA analizi gibi yöntemlerle birlikte, açıklanan fare modeli karaciğer içinde tümör büyümesi ve metastatik hastalık nüksü yer alan farklı faktörlerin yakın bir muayene için temel olarak hizmet verebilir. Post-hepatektomi metastazlarının bağlamında belirli bir soruyu keşfetmek postoperatif gözlem uzunluğu gibi değişkenlerin önemli bir kısmı, enjeksiyon veya enjeksiyon ve karaciğer rezeksiyonu zamanlaması için kullanılan hücre çizgisi birden fazla açıları sunuyoruz. Bu prosedürün sınırlamalar au vardırthorization uygun bir hayvan test tesisi ve bazı ekipmanların alımı için hayvanlar üzerinde prosedür, erişim gerçekleştirmek için.
Introduction
Kolorektal kanser (KRK) tüm habis tümörlerin yaklaşık% 9'unu. ABD'de ve tüm dünyada, en sık görülen üçüncü kanser türüdür. 300.000 CRC aralığından küresel ölüm oranları yıl 1 500.000'den fazla için. Hastaların yüzde yirmisi kendi kolorektal tümör keşfetmeleri üzerine karaciğer metastazı muzdarip. Rezektabl metastazlar normalde kısmi karaciğer rezeksiyonu 2,3 ile tedavi edilir. Geliştirilmiş cerrahi teknikler, yeni modelli stratejiler ve rezeke metastaz yeni tanımlar hastaların 4 giderek artan sayıda olası bir kısmi karaciğer rezeksiyonu tedavisi hale getirmektedir.
sekonder karaciğer maligniteler tekrarlaması, ancak modern gastrointestinal cerrahi zorlu bir klinik sekel olduğunu. Karaciğer metastazlarının rezeksiyonu ÇHS olan hastalar kalan karaciğer 5 yeni tümör oluşma 30 ila% 50 şansı var. Bu nedenle, ilgili daha fazla araştırma için bir ihtiyaç vardırkaraciğer metastazlarının nüks rol alan mekanizmalar.
yaklaşık% 70 arasında bir karaciğer rezeksiyonu, normal olarak geri kalan karaciğer dokusunda bir kaç hafta içinde dengelenir. Bu rejenerasyon büyüme faktörü beta (TGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü dönüştürücü interlökin 6 (IL-6), tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α), hepatosit büyüme faktörü (HGF) gibi sitokinlerin de dahil olmak üzere bir çok mekanizma şunları içerir: (VEGF ), matriks metalloproteazlar (MMP-2 ve MMP-9) ve CXC-kemokinler, 6-11. Bu maddeler karaciğer rejenerasyonu destekleyen ve aynı zamanda rutin klinik görüntüleme tarafından tespit edilmeyen kalan karaciğerde küçük tümör hücresi mevduat büyümesini uyararak primer ve sekonder karaciğer maligniteler yüksek nüks oranları sorumlu olabilir. Bu nedensellik şimdiye kadar kanıtlanmamıştır.
aşağıdaki hipotez kurulmuştur. Kısmi karaciğer rezeksiyonu sonra, çoğalma faktörleri bu canlı sorumludurR hipertrofisi karaciğerde daha önce keşfedilmemiş tümör hücrelerinin büyümesini teşvik edebilir. Bir fare modeli karaciğer rezeksiyonu ve tümör indüksiyon teknikleri kombine hangi tasarlanmıştır. Otuz atimik çıplak-foxn1nu / nu fareler on hayvan, her biri üç gruba ayrıldı. Bunların her biri, tek başına, bir laparotomi (Grup A) ile tedavi edildi,% 30 karaciğer rezeksiyonu (Grup B) ya da% 70 karaciğer rezeksiyonu (Grup C). Tüm gruplarda hayvanlar daha sonra atıl tümör hücrelerini simüle etmek için, karaciğer tanımlanan bir geri kalan kısmı içine bir tümör hücresi enjeksiyonu yapılmıştır. daha sonra, iki hafta içinde gözlenmiştir ve hayvanlar, tümör büyümesi ve karaciğer hipertrofisine değerlendirildi.
Amaç sonrası hepatektomi tümör oluşumunda bir rol oynayabilir moleküler ve patogenetik faktörler aramak için kullanılabilecek bir model oluşturmak oldu. Bu yöntem konusunda faydalı olabilir: karaciğer rejenerasyonunda katılan endokrin faktörlerinin kaynağını; intrahepatik tum sorumlu olan mekanizmalarveya karaciğer rezeksiyonu sonrası büyüme; ve intrahepatik tümör büyümesi indüksiyonu için gereken karaciğer rezeksiyonu hacmi. onlar temel biyolojik prensiplerin anlaşılması ve gelişmiş tedavi seçenekleri ile insanları fayda beklenebilir bilginin gelişmesine katkıda bulunmak söz çünkü aşağıdaki yöntemi sadece hayvanlar üzerinde yapılmıştır. Nedeniyle bu konularda yer alan mekanizmalar, in vitro yöntemler insan patoloji gerçekçi bir temsilini sağlamak olmayabilir gibi, in vivo incelenmesi gerekiyordu.
Bu araştırmalar, tümör nüksü azaltmak için profilaktik tedavi seçenekleri için ilgili hedeflerin keşfine yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bavyera, Almanya, Orta Franken hükümeti, açıklanan prosedürler için izin verdi. Herhangi benzer deneyler ilgili makamlar tarafından ön izin gerektirir.
Not: Aşağıdaki manuel buna göre işaretlenen gruplar A ve B dışarı bırakılmak zorunda C. Adımlar aracılığıyla daha önce tartışılan gruplar A için kullanılabilir.
1. hazırlıklar
- Eldiven giyin mikroskop altında polistiren pedi yerleştirin ve hafifçe pad üzerindeki alana lensi odaklanır.
- Steril levha ve yer yarısı polistiren pedi üzerinde ve buna hemen yanında diğer yarısı bölünmüş.
- cerrahi aletler sterilize ve Polistiren pedi yanında steril bir levha üzerine koyun.
- bir kemer oluşturmak için büyük bir kağıt klipsi unbend. hemen yanında hayvanın kafası yalan yere - ters çevirin ve en sonunda polistiren ped bastırın.
- İki bacak arasındaki buharlaştırıcı ağızlığı yerleştirinkemer s. (Şekil 7)
- Hayvanın kafası yalan yerden 40 cm ile ilgili bir ısıtma lambası ayarlayın. 40 ° C'yi aşmaması polistiren pedi seviyesinde emin ısıyı olun.
- çalıştırılan hayvanlar için ayrı bir kafes hazırlayın.
- esnek bir tüp içinde, tümör hücrelerinin belli bir miktar ve hacim (50 ul maksimum) hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
2. Anestezi
- Bir pleksiglas kutunun içine fare koyun ve (10 L / dk debide% 5 izofluran) yüksek akış izofluran anestezik indüksiyon başlar.
- kolayca solunum hızı (<20 / dk) ve sallayarak derin soluk soluğa ciddi bir azalma tarafından kabul edilebilir agonal nefes aşamasına girdi hemen sonra anestezi farklı aşamalarında gittikten sonra, pleksiglas kutu fare kaldırmak hayvanın tüm vücudu.
- Hızla steril örtü kaplı polistiren ped üzerine hayvan göbek-up yerleştirin ve devamanesteziyi idame ettirmek için ağızlık içine farenin burun takarak düşük akışlı izofluran havalandırma. yaklaşık 1 L / dakikalık bir akış hızında 1.8-2.2% arasında bir nefes alma bölümünü kullanır.
- dakika başına 45 ile 60 solunum arasındaki ideal olan solunum frekansını, hesaplayarak operasyon sırasında anestezi derinliği değerlendirin. Bu durumda değilse buna göre inspiratuar izofluran fraksiyonu uyarlayın.
Not: etkili hale gelene kadar inspiratuar izofluran fraksiyon değişiklikler yaklaşık 60 saniye alır. Hızla köklü değişiklikler bulunmaktan kaçının. Bunun yerine, yavaş yavaş anestezi uygulamasını değiştirin.
3. Operasyon
- yeterli bir dezenfektan ile göğüs ve karın dezenfekte edin ve daha sonra eldiven değiştirmek.
- Hayvanın uyluk içine karprofen bir ağırlık adapte hacmi (5 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edilir.
- Yavaşça anestezi derinliği yeterli olup olmadığını test etmek için bir forseps ile karın cildi tutam.
- Dikkatle çevreleyen dokudan maruz için kılıç şeklinde etrafını incelemek.
- (Içeriden dışarıya) kılıç şeklinde aracılığıyla bir konaklama dikiş yerleştirin ve hayvanlar kelepçe ile kafası yukarıda tutucuya hem konuları ekleyin.
- Birlikte retraktör en uzuvları çimdik ve yavaş yavaş hayvanın iç karın duvarı boyunca "U" şeklindeki geri çekme ipuçları tanıtmak.
Not: Bu tedbirler farklı lobları erişimi kolaylaştırmak için karaciğer maruz bırakmaktadır. karaciğerin medyan ve sol yanal lob tanımlanması artık mümkün olmalıdır. - Bir tuzlu batırılmış pamuklu bir bez kullanın ve yavaşça aşağı doğru medyan lob itin. Şimdi medyan lobunun yüzeyi ve diyafram arasındaki görünür olacak falsiform ligament ventral dörtte üçünü, teşrih.
- Şimdi, medyan kaydırmak için iki tuzlu batırılmış pamuk bezlerden kullanınlob ve yukarı doğru diyafram karşı yanal lob bıraktı.
- sol lateral lob ve kaudat lob arasındaki ince zarı görselleştirmek ve dikkatle incelemek.
Not: Grup A hayvanlar üzerinde bu protokolü yaparken, bu noktada 3.18 adıma atlamak. - sol lateral lobunun tabanı boyunca çapraz bir boyut 4-0 bitişik harfleri yerleştirin.
- Ardından, orijinal pozisyonuna sol yanal lobu dönmek için pamuklu bir bez kullanın.
- Dikkatle mümkün olduğunca lobunun tabanına yakın bitişik harfleri kravat ve yeterli kesintiye kan temini için test lobda renk değişimi değerlendirmek.
- lobunun tabanının çizgisini takip ederek sol yanal lob rezeksiyonu ve rezeke lobunun ağırlığını not edin.
Not: B grubu hayvanların bu protokolü yaparken, bu noktada 3.18 adıma atlamak. - sol lateral lobunun güdük ve medyan lobunun tabanı arasında ikinci bitişik harfleri yerleştirin.
- w medyan lob yeniden konumlandırmakell ve bitişik harfleri kravat. Yine, yeterince kesintiye kan temini için test lobda renk değişimi değerlendirmek.
- medyan lob rezeksiyonu ve ağırlığını not edin.
- 30 G iğne ile 1 ml şırınga bağlayın ve herhangi bir zamanda şırınga eğmeden esnek tüp tümör hücreleri ile doldurun.
- inferior sağ lobu ortaya koymak için hayvanın sol bağırsak döngüler taşımak için pamuklu çubuklarla kullanın.
- dikey 30 ° açıyla "üçüncü el" cihazın içine hücre yüklü şırınga yerleştirin.
- Dikkatle sadece alt sağ lob üzerinde iğne ile fare yanındaki cihazı taşıyın.
- iğne ucu aşağı doğru lobunun orta kısmında kadar yavaş yavaş üçüncü elden cihaz içinde şırınga ilerlemek.
- 30-45 saniyelik bir süre boyunca lobunun merkez parçası haline tüm hacmi enjekte edilir.
- Kanama durana kadar en az üç dakika boyunca enjeksiyon bölgesini sıkıştırın.
- Tek düğme knot kullanarak bir emilebilir 5-0 dikiş ile fasya kapatın.
- Tek düğme knot kullanarak 4-0, rezorbe olmayanlar dikiş ile cilt kapatın.
- yaklaşık 1 dakika boyunca yüksek akış oksijen fare havalandırma başlayın.
4. Ameliyat sonrası prosedürü
- Yeterli iyileşme sağlamak için bir sonraki yarım saat sıcak bir ortamda (yaklaşık 40 ° C) içine hayvan yerleştirin.
- 72 saat postoperatif için metamizol 5 mg / ml hayvanın içme suyu karıştırılabilecek.
- işlemden sonra en az üç gün boyunca yakından dikiş bütünlüğünü inceleyin.
5. Gözlem Dönemi ve Ötenazi
- 14 gün olmak üzere toplam günlük hayvanın ağırlığını ölçün. sırasıyla kendi refahları ve sınırlamalar konusunda onları skor.
- 14 gün sonra, hayvan şu 2.1 ve operatif protokol a 2.2 adımları uyutmaknd hayvan ötenazi için kurumun protokol ile devam edin.
- Adım 3.4 açıklandığı gibi bir medyan laparotomi gerçekleştirin. Karın erişimi kolaylaştırmak için, insizyon 1-1.5 cm kaudale uzatmak. 3.7 de belirttiği gibi Retraktörü yerleştirin.
- falsiform ligament geri kalanı boyunca teşrih ve karaciğer cranially çıkar gibi inferior vena kava kesti.
- diyaframdan, forseps ile diyafram kapma ve açıkça karaciğer ve kas dokusu arasındaki boşluğa diseksiyon ile karaciğer ayırın.
- retroperitoneal kapalı seferber karaciğer doku kaldırın ve hala takılı kalan yapılar onu teşrih: Retroperitoneal yağ dokusu, inferior vena kava ve portal ven.
- sahte gerçek boyut ve ağırlık katkı sağlayacak herhangi bir ek doku için ekstraksiyon sonrası karaciğer kontrol edin. Bir ekstre karaciğer ve tümör Şekil 6'da gösterilir.
- inf kapalı tümörü teşrihSağ lobun erior.
- tümör ve karaciğer parankimi hem boyut ve ağırlık ölçün.
- doku analizi için gereken şekilde ilâve periton doku örnekleri, lenf düğümlerinden veya diğer organlara koruyun
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim özel deneyde, biz 30 atimik çıplak-foxn1nu / nu fareler dahil. Bir medyan laparotomi (tuzlu su, 50 ul içinde çözülmüş) 500.000 MC38 tümör hücrelerinin, tümör hücresi enjekte edildi, ve daha sonra% 70 karaciğer rezeksiyonu,% 30 karaciğer rezeksiyonu, veya başka bir müdahale ile tedavi edildi.
14 gün sonra kalan karaciğer neredeyse tamamen yenilenmesi% 30 veya% 70, karaciğer rezeksiyonu, aşağıdaki gözlenmiştir (% 30 karaciğer rezeksiyonu grubunun karaciğer hipertrofisi endeksi% 70 karaciğer rezeksiyonu gruptan 0.8 karşı 1.06 idi).
Tek bir laparotomi sonrasında, intrahepatik tümörlerin ortalama ağırlığı 332 mg (: 10-608 mg arası) idi. p & # ile% 70 karaciğer rezeksiyonu sonrası:% 30 karaciğer rezeksiyonu vs 961 mg sonra (189 MG-3030 mg aralığı): (76-1,873 mg aralık) intrahepatik tümörlerin ortalama tümör ağırlığı 656 mg idi60 0.05 (Şekil 1). Vs 1385 mm 3 (aralık: 411-2,366 mm 3): 30% karaciğer rezeksiyonu sonrası, tümör hacmi 950 mm 3 (439-2,326 mm 3 aralık) idi% 70 karaciğer rezeksiyonu sonrası ve 511 mm 3 (aralık: p <0.05 (Şekil 2), tek başına bir laparotomi sonrasında 87-1,693 mm3).
tümör dokusundan Doku kesitleri KI-67 immünohistokimya yoluyla alındı ve analiz edildi. slaytlar üzerinde Hücreler kendi çoğalması hızı bakımından değerlendirildi. % 61 (aralık: 51-69%) ile karşılaştırıldığında: laparotomi grubundan tümör hücrelerinin ortalama çoğalması oranı% 47 (39-56% aralığında) idi% 70 karaciğer rezeksiyonu (p <0.05) geçirmiş hayvanlardan ve% 53 (aralık: 38-69%)% 30 (p = 0.22) bir karaciğer rezeksiyonu, karaciğer rezeksiyonu yapılan gruplarda hücre çoğalmasının artması oranı gösteren geçirmiş hayvanlardan (Şekil 3 - 5).
Şekil 1:. İntrahepatik Tümörler Ağırlık şeması karaciğer diseksiyonu sonrası gruplar A, B ve C arasında ortalama tümör ağırlığı karşılaştırır ve gösteriler grup B ve C Hata barlar tümörlerde ağırlığını SEM temsil arttı. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 2:. İntrahepatik Tümörler Ses şeması karaciğer diseksiyonu sonrası gruplar A, B ve C arasında ortalama tümör hacmini karşılaştırır ve gösteriler SEM temsil grup B ve C Hata barlar tümörlerde hacimleri arttı. ank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: A grubundaki bir tümör örneğinden slayt Grup A KI-67 İmmünohistokimya gelen tümörlerde Yayılmasını Önleme Oranı tümör hücrelerinin çoğalmasını hafif göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: B grubu bir tümör örneğinden slayt Grup B. KI-67 İmmünohistokimya gelen tümörlerde Yayılmasını Önleme Oranı tümör hücrelerinin çoğalmasını orta göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 mikron.= "_ Blank" olsun> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: C grubunda bir tümör örneğinden slayt C Grubu KI-67 İmmünohistokimya gelen tümörlerde Yayılmasını Önleme Oranı tümör hücrelerinin belirgin çoğalmasını gösterir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Grup B Çıkarılan Karaciğer / Tümör örneği Bu karaciğer% 30 karaciğer rezeksiyonu ve eş zamanlı tümör hücre enjeksiyonu gerçekleştirdikten sonra 14 gün ekstre edildi. Sağ alt lobda büyük bir tümör görülebilir sağ superior, medyan ve kaudat lob ises önemli hipertrofisi geçtik.
* = Inferior sağ lobda tümör, SRL = üstün sağ lob, ML = medyan lob, CL = kaudat lob. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7:. OR Tablo Kur polistiren pedi steril bir bezle ile kaplıdır. Bir bükülmüş açık ataş onun ağızlık solunum tüpü örten üst ucunda pedin içine bastırılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kemirgenlerde cerrahi uygulayan Önceki deneyler önyargı kaynağı olarak hizmet verebilir belirli değişkenleri belirlemek mümkün olmuştur. geçerli ve güvenilir sonuçlar elde etmek için, aşağıdaki önlemleri göz önünde bulundurun.
Rutin Ameliyat öncesi açlık karaciğer rejenerasyonu 13,14 inhibe edebilir Karaciğer yağlanması 12 yol açabilir. Bu nedenle tavsiye edilmez. Hepatositlerin en yüksek mitotik aktivite gün 15 boyunca değişir. Mümkünse, tüm gruplar için gün boyunca belirli bir zamanda işlemleri yürütmek. Murin rejenerasyon 4-6 haftalık hayvanlarda en etkili yöntemdir. Yaş 10 aydan büyük hayvanların önemli ölçüde yenilenme kapasitesi 16 azalmıştır. yanlılık şansını en aza indirmek için deneyler için aynı ırk, cinsiyet ve yaş fareler kullanın. steril bir ortamda çalışan böyle bir açık prosedür genel olarak önemlidir. Özellikle athymi gibi bağışıklık sistemi baskılanmış organizmalar içinde erken ölüm ya da yanlı sonuçlara yol açabilir video, enfeksiyon riski kullanılan c fareleri, yüksek. Bir hazırlık, bir cerrahi ve bu nedenle 17 garanti bir kurtarma alanının oluşan üç bölgeli-Kur edinerek. Nedeniyle derin hepatotoksik etkileri, yaygın olarak kullanılan Buprenorfin içi veya postoperatif analjezik tedavinin 18,19 için tavsiye edilmez. Yeterli analjezi sağlamak amacıyla karprofen veya metamizol gibi diğer maddeler kullanın. metamizol birçok ülkede mevcut olmadığından, karprofen de işlem sonrası ağrı kontrolü için kullanılabilir. Üç gün metamizol yerine boyunca günde bir kez 5 mg / kg vücut ağırlığı arasında bir subkütan enjeksiyon gerçekleştirin.
kurtarma fare yiyecek ve su kolay erişim ile sıcak bir ortama konulduğunda ameliyat sonrası iyileşme en elde edilir. Ideal daha savunmasız olanlar 17 zarar daha baskın hayvanların önlemek için, bir gecede diğer farelerden izole edilmiştir.
protokol çok basittir olmasına rağmen jove_content ">, farelerde cerrahi bu tür yaparken önlemek için bazı küçük tuzaklar vardır. falsiform ligament diseksiyonu, karın duvarına medyan lobun ventral bağlayan bir yapı, esastır uygun karaciğer esnekliği sağlamak. Bu bağ inferior vena kava cranially, dikkatli bu önemli ven zarar görmesini önlemek amacıyla garantilidir karaciğeri bırakır noktasına çok yakın bir alana genişledikçe. ortalama olarak, yaklaşık dörtte üçü bu diseksiyon yolu tatmin edici seferberlik sağlamak ve aynı zamanda geminin yeterli mesafeyi koruyacaktır.rezeksiyon protokolü yaparken bir ligatür bir lobu bağlanması sırasında gerginlik doğru miktarda kullanarak bir derece önemli bir görevdir. Hava knot ya da kötü sıkılmış bitişik harfler ile ligatürler yetersiz kesintiye kan temini, kanama, şok ve ölüme yol açabilir. Aynı zamanda, bir attemiyice bağ düğüm sıkın pt doku ve organları çevreleyen ilişkili hasar bağ rüptürü yol açabilir. bağ bütünlüğü değerlendirmede etkili bir yoldur bağlanan lob içinde siyanotik renk değişikliği gözlemdir. Doğru dikiş materyali seçme de önemli bir rol oynar. Örgülü sütürler monofilamentous malzemeler oldukça yumuşak karaciğer dokusu ile incelemek ve kanama neden olur, oysa doku sıkıştırmak için olasılığı daha yüksektir.
Diğer önemli adım farelerde karaciğer lobu kaldırma bitişik harfler doğru konumlandırılmasını içermektedir. Ligasyon lob giren ana damarların dik gerçekleştirilen gerektiğini. Bu medyan lobun oldukça basit olsa da, sol lateral lob yeterli rezeksiyon daha zordur. Onun gemileri bir ventro-kaudal yönde lobu girin. Bunun bir sonucu olarak, bağ ipliği l alt sağ lob sol hamle tabanı arasında hayali bir çizgi boyunca yerleştirilmelidiriver.
Orta lob ise, rezeksiyon inferior vena kava tehlikeye atabilir. Bu büyük damar lob dorsal kısmında geçiyor, çünkü karaciğer nekrozuna yol açabilir hasar, eğilimli. Ayrıca, bu alanda çok gerilim ile bitişik harfleri bağlama diyafram kopma ve / veya pnömotoraks neden olabilir.
Benzer sonuçlar elde etmek için çalışırken, tümör hücrelerinin yeterli bir kullanım da önemlidir. Tam hücre kültür teknikleri bu protokolün bir parçası olmak anlamına gelmez rağmen, prosedür içinde tümör hücrelerinin ele önceden mükemmel hazırlık kadar önemlidir. tümör hücreleri şırınga doldururken, her zaman o dik tutmak için hayati önem taşımaktadır. şırınga büyük çaptaki eğerek boşaltma nedenle enjeksiyon sırasında hücre kaybı ile sonuçlanan, şırıngalar duvara yapışan tümör hücreleri ile sonuçlanabilir. Sadece küçük devirme başına iğneyi için, enjeksiyon sırasında garanti altındadırinferior sağ lobunun yüzeyine dik olarak.
Kanama ve periton metastazları karaciğer yüzeyinde delinme sitesinden kanama ve dökülme bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Bu nedenle, üç dakikalık bir süre için bir pamuklu çubuk ile lobun nazik sıkıştırma karaciğer parankimi kanama kontrolü ve periton içine sızan tümör hücre sıvısının önlemek için şarttır.
kemirgenlerde karın içi operasyonları için prosedür protokolleri içeren yayınlar nadiren karın kapatılması türü hakkında bilgi içerir. Ancak, bu boyut komplikasyonlar başka bir olası kaynaktır. Hatta yeterli ağrı kontrolü ile, hayvanlar karın duvarında yabancı cisim çıkarmak için çalışacağız. Sonuçları karın içi enfeksiyon, açık bir karın, hatta ölüm olabilir. Bu yara kapatma yerine, bir dikiş, iki kat halinde karın duvarı kapatılması için her iki performans tek kesintiye dikiş ile önlenebilir.
(Harlan Laboratuvarları BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst tarafından sağlanan) Dişi atimik çıplak-foxn1nu / nu fareler bu deneyde kullanıldı. Bu cins için bilinen T-hücresi eksikliği nispeten sınırsız tümör büyümesini ve tümör implantasyonu için bu nedenle ideal koşulları sağlar. hayvanlar arasında kavgalar sıralamasında etkisini en aza indirmek amacıyla, sadece kadın hayvanlar kullanıldı. C57BL / 6 Inbred Fare gibi farklı suşlar kullanılarak ön sonuçları da anlamlı gösterilen, ancak daha düşük hacimli tümör büyümesi var. Böylece, teknik çok büyük olasılıkla daha fazla fare suşları uygulanabilir bir yöntem olabilir.
Patojenler tümör büyümesi 20 engel olabilecek Ancak, bu ortamda immün sistemi baskılanmış organizmaların kullanıldığı, özel hayvan hijyen önlemleri gerektirir. Hayvanlar üzerinde test tesisi gerçekleştirilen şekilde nöbetçi hayvanların kullanımı gibi önlemler patojenik ajanların 21 varlığını izlemek için bizim çalışmamız helpfu olabilir gerçekleşecek aldıönyargı olası kaynaklarını tespit l.
Bu deney (Mannheim Tıp Fakültesi, Almanya Klinik Kimya Enstitüsü elde edilmiştir) MC38 denilen bir kemirgen kolorektal kanser hücre hattı kullanılır. 5 x 10 5 tümör hücreleri tuz 50 ul içinde çözülmüştür. konsantrasyonu, bu miktar iki hafta içinde katı tümör oluşumu için ideal olarak belirlenmiştir, ön deneylerde belirlenmiştir. Bu deneylerde kullanılan hayvanların imünokompetan bağlı olarak (yukarıya bakınız), çok iyi insan kolorektal kanser hücrelerini kullanmak ve bu nedenle xenograft oluşturmak mümkün olabilir. insan SW480 tümör hücrelerini kullanarak atimik çıplak-foxn1nu / nu farelerde yapılan ilk test başarıyla rezeksiyon sonrasında geri kalan karaciğer tümör büyümesini göstermek mümkün oldu. Bağlı kemirgen karaciğerinde boyutuna, komplikasyonların önlenmesi için 50 ul tek kullanım birimleri için tavsiye edilir. Bu noktada olası bir iyileştirme olurlusiferaz ile tümör hücreleri etiketlemek için olabilir. tümör hücre büyümesi ve büyüklüğü yakın izlenmesi mümkün olduğunda araştırılmaktadır soruna bağlı olarak, ilginç bilgiler ortaya çıkabilir.
Karaciğer lobları bağlanarak alternatif yolları kırpma yöntemi 22 veya kırpma-dikiş hibrit tekniğini 23 arasındadır. cihazları kırpma konumlandırma, ancak, kırpma yöntemleri zor hale getirebilir. Yeterli yapılan sütür ligasyon tekniği öğrenmek için kolay kalır ve bu deneyde bir lobu kaldırılması en maliyet etkin yolu olmak çok muhtemeldir.
Canlı hayvanlar bu deneyde kullanılan Çünkü, uygun yetkililer tarafından önceden izin gerektirir. bölgeye bağlı olarak, bu pahalı ve zaman alıcı bir görev olabilir. Hatta resmi onayından sonra, hayvan deneyleri hücre kültürü testi veya moleküler yöntemler gibi araştırma yöntemleri çok daha az erişilebilir. Bir altyapı ek olarakModern hayvan deneyleri tesisi, özel ekipman protokolünü gerçekleştirmek için tahsis edilmelidir. Ayrıca, iki ila dört haftalık bir süre bu tekniği ana planlanmış olmalıdır. Bu protokol, fare suşlarının çok sayıda hücre çizgilerinin geniş bir aralığı için geçerlidir olabilir. Bununla birlikte, yukarıda sözü edilen Modifikasyonlar ile ilgili olarak, her hücre hattı, her organizmada incelenebilir.
Bu protokolü kullanarak araştırmacı çalışmaların ana hedefi karaciğer rejenerasyonu ve karaciğer malignite nüks üzerine kesin etkileri yer alan karmaşık büyüme faktörü sistemi olacak. yeterli bu olası ilişkiyi araştırmak amacıyla, farklı molekül yöntemleri ya da hücre kültürü aksine, bir hayvan deneyinde uygulamak gereklidir. Bu yöntemler, daha çok araştırma ücretsiz bir araç olarak kullanılır. Çeşitli karaciğer rezeksiyonu modelleri kadar 22-24 yayınlanmış olsa da, bu prosedürİlk kez köklü bir devreye aynı anda tümör hücre enjeksiyonu uygular.
Bu fare modeli, farelerde karaciğer rezeksiyonu oldukça basit, uygun ve kolay bir şekilde tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu göstermektedir. majör ve minör rezeksiyonlarından sonra karaciğer rejenerasyonu iki hafta içinde hipertrofisi doku kaybını telafi etmeyi başardı. Fareler% 70'e varan karaciğer hacmi azalma ile başa çıkabilir.
Tümör hücreleri kalan karaciğer içinde büyümeye başardık ve solid tümörler tespit edilebilir. Tümör büyümesi ve tümör hücresi proliferasyonu rezeke karaciğer dokusunun miktarı ile korelasyon gösterdi. daha tümör ağırlıkları ve hacimleri ile, ifade edildi kalan karaciğer, içinde tümör büyümesinin bir aktivasyonu rezeksiyon kurşun süreci. çoğalma Bu büyük derecesi immunohistokimya sınavlar gösterdiği olabilir.
İyi hepatik rejenerasyon fac miktarı bilinmektedirları, karaciğer rezeksiyonu 25,26 ölçüde karaciğer hipertrofisi artar yayınlandı. Bu nedenle, karaciğer rejenerasyon faktörleri ve tümör hücresi büyümesi ile bir bağlantı mevcut olabilir. metastatik nüks rezeksiyonu öncesinde karaciğer içinde metastaz miktarı ile ilişkilidir nerede klinik gözlemlerle uyum içindedir. daha henüz tespit edilebilen tümör hücre mevduat, tanı anında mevcut olabilir iken preoperatif görüntülemede görünür Karaciğer metastazları sadece buzdağının ucu yansıtabilir. Karaciğer rezeksiyonu sonrasında, karaciğer rejenerasyon faktörleri sonra sonunda tekrarlayan metastaz olarak belirgin hale bu tümör hücrelerinin büyümesini teşvik edebilir.
Yukarıda belirtilen korelasyon çok büyük olasılıkla olsa da, şu ana kadar kanıtlanmış değildir. intrahepatik tümör ilerleme hepatik rejenerasyon mekanizmalarının etkisi bu nedenle daha fazla moleküler analizler gerektirir. Kesin talimatlar yanı sıra örnek bir video hızlı benimsenmesini sağlamakBu video tanıtılan teknik. Bu olaylar bu iyi bilinen zincirinde eksik bağlantıyı keşfetmeye çalışıyoruz dünyada çalışmaların farklı türde için bir temel olarak hizmet verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Özel teşekkür teknik sorular yaptığı yardım için Dr. Benjamin Motsch gidin. Yazarlar ayrıca kendi multimedya desteği için Marcus Forschner ve Birk Müller kabul etmek istiyorum, onun editoryal uzmanlık için Erica Magelky ve Lisa Hornung Dr. Roland Jurgons ve Franz-Penzoldt-Merkezi'nin Üniversitesi'nden Profesör Stephan von Horsten ( hayvan taşıma ve bakım onların profesyonellik için Erlangen). Biz MC38 tümör hücrelerinin sağlamak için Klinik Kimya Enstitüsü, Heidelberg, Almanya Üniversitesi Tıp Fakültesi Mannheim Profesör Michael Neumaier teşekkür ederim.
Bu çalışma derecesini elde etmek için gerekliliklerin yerine getirilmesi gerçekleştirildi "Dr med." Friedrich-Alexander-Üniversitesi Erlangen-Nürnberg (FAU) de.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
