Behavior

Hemiparkinsonianラットにおける脳深部刺激効果のモーターの成果を評価するための新しいアプローチ：階段室とシリンダーテスト

Published: May 31, 2016 doi: 10.3791/53951

Marta Rattka¹, Felix Fluri¹, Miloš Krstić¹, Esther Asan², Jens Volkmann¹

¹Department of Neurology, University Hospital Wuerzburg, ²Institute of Anatomy and Cell Biology, University Wuerzburg

Abstract

視床下核の脳深部刺激は、パーキンソン病のための有効な治療選択肢です。私たちの研究室では、hemiparkinsonian（一方的な病変）ラットで異なる神経刺激パターンをスクリーニングするためのプロトコルを確立しました。それは、右の内側前脳束に6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）を注入視床下核への慢性刺激電極を移植し、ケーブルに結合した外部神経刺激の24時間の期間の終了時にモータの成果を評価することによって、一方的なパーキンソン病斑を作成で構成されてい。刺激は、定電流刺激を行いました。振幅は、副作用のために、個々の閾値を下回る20％に設定しました。モータアウトカム評価がShallertにし、モントーヤに応じて階段試験で到達業者の評価によって応じ円筒試験における自発的な足の使用の評価によって行われました。このプロトコルを詳細に階段ボックスの訓練を説明し、Cylinderテスト、ならびにhemiparkinsonianラットの両方での使用。階段テストは細かい運動技能障害のために、より敏感であるように思われると神経刺激の間に変化するより高い感度を示すため、両方のテストの使用が必要です。一方的なパーキンソンモデルと2行動試験の組み合わせは、標準化された方法で異なる刺激パラメータの評価を可能にします。

Introduction

視床下核（STN）の脳深部刺激はパーキンソン病¹および他の運動障害のための有効な治療選択肢です。基礎となるメカニズムはまだ十分に理解し、多因子であるが、主要な機能は、刺激電極^2-4付近の軸索の繰り返し脱分極によって神経ネットワーク活動の変調です。高周波数（> 100 Hz）で刺激が最も脳の目標及びDBSのほとんどの適応症のための有益な効果のために必要とされます。刺激量で覆われている他の繊維、の不注意による同時活性化から深部脳刺激の結果の副作用は、錐体路などのさまざまな機能を、補助します。したがって、副作用素子^5,6の同時活性化を回避しつつ、優先的に有益な神経要素を活性化する刺激パラメータを開発することが望ましいです。神経生理学は、このような微細なTUNIを提供することがありますが、DBSのオプションngを、科学の進歩は、プログラミング戦略は、主に患者の「試行錯誤」により評価し、市販のDBSデバイスの限られたプログラミングオプションによって制限されているため、過去20年の間に最小限されてではなく、神経生理学的知見を使用していますかつ体系フルパラメータ空間を探索する実験的な設定を定義しました。

DBS研究の翻訳障害を克服するために、我々は、臨床探査の前にパーキンソン症候群の齧歯類モデルにおける代替刺激パラメータをスクリーニングするためのプロトコルを提案しています。ラットにおける片側パーキンソン病は、右の内側前脳束^7,8に6-ヒドロキシドーパミン注射を使用してモデル化されます。得られた病変が、hemiparkinsonianとしてさらに説明、低用量のアポモルフィン注射後の回転スコアの評価によってアポモルフィン試験で評価し、チロシンヒドロキシラーゼimmunohistによって死後に確認されましたochemistry。低死亡率および罹患率を保有しながら、この方法は、適用が容易で再現性の高いです。結果として得られる運動障害は^、7,8非常に離散的です。動物は、自発的な探査や複雑な把握行動^9,10の両方の間に反対側の左足のわずかな障害を呈します。

脳深部刺激プロトコルテストの有効性を評価するためには、モータ性能の迅速かつ信頼性の変化を測定できるように、別の神経刺激設定で時間をかけて繰り返すことができる必要とされます。いくつかのグループが非常に変動し、一貫性のない成果^11-14ラット¹¹で運動機能を評価するために、異なる刺激のアプローチと異なるテストを提案しました。これは、妥当性と相補性を予測する高で一連のテストを選択することが私たちを余儀なくされました。さらに、深部脳刺激条件下でのモータ結果の評価のために、試験は、ANIによって行うことができた好ましMALSは、刺激発生器にケーブルを介して接続されています。これらの目的のために、我々は足の使用の非対称性のための1つの試験や熟練到達するための1つの試験からなる当社の試験電池を設置しました。研究デザインは、図1に示されています。

自発的な足の使用のために我々は、垂直探査中の足の使用のために広く使用されている試験であるShallert ¹⁵によって記述円筒試験を行いました。動物のいかなるトレーニングは必要ありません。より複雑な把持動作の評価のために我々はモントーヤ¹⁶に従って階段テストを確立しました。私たちのプロトコルはKloth ¹⁷に応じて変更されます。ラットを試験箱からペレットに到達するには12日間の期間のために訓練されています。トレーニング期間の後に試験を食べたペレットの数として記載成功率をカウントすることにより、複雑な把持動作を測定するために適用することができます。記事では、BEH階段ボックス内の詳細なトレーニングだけでなく、両方の性能を提示しますナイーブ、hemiparkinsonianと脳深部刺激条件の下でavioralテスト。

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Protocol

（：55.2から2531.01 11分の76承認番号）の動物実験は、動物保護ガイドラインと欧州共同体理事会のガイドラインに従ってウンターフランケンのヴュルツブルク大学と法的な州当局によって承認されました。すべての努力は、使用する動物の痛みや不快感を最小限にするために行われました。

注：他の場所¹⁸に記載の電極の移植を行いました。

1.シリンダー試験（図2）

0.1％酢酸溶液でシリンダーを洗浄することにより、透明なプラスチックガラスシリンダー（19センチメートル：40センチ、直径、高さ）を準備します。
実験の日、各ラットの識別番号とカードを準備します。
シリンダーの後ろに90°の角度で二つのミラーを配置します。
カメラとシリンダとの間の距離は足の素晴らしい眺めを可能にするように、シリンダーの前にカメラを置きます。
輸送箱にラットを置きます。
注：動物はストレスを避けるために、試験前に実験者によって処理されるべきです。
輸送ボックスを使用して、シリンダにホームケージからラットを輸送。
シリンダ（ 図3）にラットを置きます。
1. 常に活動の概日違いを回避するために、1日の同じ時間にすべての行動試験を行います。動物がケーブルによって刺激発生器に接続されている場合は、ケーブルが実験中にねじれがないことを確認してください。
カメラの「録画」ボタンを押してください。カメラに実験およびラットの識別番号の実際の日付でカードを表示します。記録を開始します。
5分後、シリンダーから動物を削除し、輸送ボックスを使用して、ホームケージに戻します。
0.1％酢酸溶液でシリンダーを清掃してください。
左右の足の壁に接触（パーセントで足の使用）と同様にRをカウントすることにより、記録した映像から足の使用を評価しますイヤリング（またはシリンダ壁に支持することなく、後足の上に立って）。シリンダテストは、適切なソフトウェアによって自動的に評価することができます。
注：健康なラットは均等に両方の足を使用しています。 hemiparkinsonianラットは、より少ない程度の病変による影響を受けた足を使用しています。

2.階段テスト（図4）

獲得フェーズ
1. 前訓練への一日は、階段の試験に用いたペレットを動物に慣れます。
  1. オプション：食餌制限（自由摂食レベル¹⁶の90％で、体重を維持するための標準的な実験用飼料10〜15 g）を使用し、動物のモチベーションを高めるために。しかし、これは、正のトレーニング効果を達成するために必須ではありません。この研究は、食事制限なしで行いました。
2. 透明なプラスチックのガラスの階段ボックスを準備し（高さ：34.5センチメートル、長さ：35.5センチメートル、幅12センチ、幅の狭い室6 cm）の0.1％の交流でボックスを清掃することによりETIC酸溶液。注：階段ボックスが狭い区画内の隆起したプラットフォームと2階段で二区画-ボックスです。狭い区画内の階段上の左のステップは、右のステップは右足で、唯一の左の足に到達することができます。
  注：標準の階段ボックスは、それがケーブルを介して刺激されたラットを用いた実験のために使用される場合には、蓋なしで高いボックスを使用し、蓋を二つの区画で構成されています。
3. 階段を削除し、8 45 mgのペレットと各手順の井戸を埋めます。
4. 階段を挿入し、高めのプラットフォーム上で8つの追加ペレットを置きます。
5. 輸送箱にラットを置きます。
6. 輸送ボックスを使用して階段ボックスにホームケージからラットを輸送。
7. 階段ボックス（ 図5）にラットを置きます。
8. 5分後、階段ボックスから動物を削除し、輸送ボックスを使用して、ホームケージに戻します。
9. どのように多くの注意ペレットは、左右の階段からプラットフォームと（最終的に）から食べました。
10. 8 45 mgのペレットと各ステップ上のウェルを充填することにより、階段を補充します。
11. 0.1％酢酸溶液で階段ボックスをきれいにし、プラットフォーム上で追加のペレットを配置します。
12. この手順（アクイジション・フェーズ）行の3日間を繰り返します。
  注：記載された全ての実験は、雄のSprague Dawleyラットで実施しました。異なるトレーニングモジュールの所要時間は異なる系統、性別およびベンダーのラットで異なることができます。
自由選択のテスト
1. 0.1％酢酸溶液で階段ボックスを清掃してください。
2. 階段を削除し、8 45 mgのペレットと各手順の井戸を埋めます。
3. 輸送箱にラットを置きます。
4. 輸送ボックスを使用して階段ボックスにホームケージからラットを輸送。
5. 階段ボックスにラットを置きます。
6. 5分後、階段から動物を削除しますケースボックスと輸送ボックスを使用して、ホームケージにそれを戻します。
  左右の階段から食べたどのように多くのペレットに注意してください。
7. 注：動物がまだペレットを把握に問題がある場合は、それらを簡単に達することができるプラットフォーム上でいくつかの詳細を追加します。
8. 8 45 mgのペレットと各ステップ上のウェルを充填することにより、階段を補充します。
9. 次の動物のための0.1％酢酸溶液で階段ボックスを清掃してください。
10. この手順（自由選択相）行の3日間を繰り返します。
  注：提示された結果は、モジュール間の休止期間なく行わ訓練によって得ました。いくつかのグループは、トレーニングプロセスをサポートするため、連結のための休止日を好みます。
強制選択テスト
1. 0.1％酢酸溶液で階段ボックスを清掃してください。
2. 階段を削除し、8（モジュールの最初の3日間）または4（連続したTHRと左側階段上の各手順の井戸を埋めますモジュールのEE日）45 mgのペレット。
  1. 減損が発生する側の強制選択テストを実行します。
    注：私たちは右半球にパーキンソン病変を行うため、選択的に左足を訓練します。
3. 輸送箱にラットを置きます。
4. 輸送ボックスを使用して階段ボックスにホームケージからラットを輸送。
5. 階段ボックスにラットを置きます。
6. 5分後、階段ボックスから動物を削除し、輸送ボックスを使用して、ホームケージに戻します。
7. 左の階段から食べたどのように多くのペレットに注意してください。
8. 8または4 45mgのペレット（ペレットの数は、トレーニング日に依存します）との各ステップ上のウェルを充填することにより、階段を補充します。
9. 次の動物のための0.1％酢酸溶液で階段ボックスを清掃してください。
10. この手順を繰り返し（強制選択相）行の6日間。
データ収集

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Representative Results

すべての動物は、ドーパミン作動性病変と電極の位置の両方の死後組織学的検査を受けました。 STN内部の正しい電極配置（ 図6）と完全なドーパミン作動性病変（>黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの90％の損失）と動物のみが結果セクション（ 図7）に含まれていました。

病変条件で円筒試験は、病変左足の使用は15.11パーセント（平均）に約50％（ナイーブ、健康なラット）から減少したことを示しました。パーキンソン病患者における標準プロトコルである24時間の刺激期間（パルス幅60マイクロ秒）以下の定期的な130 Hzの刺激の下で、足の使用は21.9％（ 図8）に増加しました。高い標準偏差にこの差は統計的に有意ではありません。 rearingsの数にはdifferenを示しませんでしたシャムと刺激条件が、このパラメータ間のCESは、ラットの活性の測定として、さらなる研究に含まれます。性能は明らかに刺激ケーブル（ 図9）によって乱されませんでした。

私たちの脳深部刺激研究で用いた全ての動物は、12日の説明タイムライン内に到達ペレットを学ぶことができました。 lesioning前の平均成功率は28ペレット（48.2パーセント）のうち13.5でした。 lesioning後の平均成功率は2.4ペレット（8.6％）に有意に減少しました。これは、24時間の刺激期間（ 図10）の末尾で通常の130 Hzの刺激の下で7ペレット（25％）に再び増加しました。性能は、刺激ケーブル（ 図7）によって乱されませんでした。 2つのモータテストはhemiparkinsonianラットにおける運動障害の評価に相補的であったとデフォルトtherap下の改善に基づいて、良好な予測妥当性を持っていました eutic条件。刺激ケーブルは試験性能（ 図11）に影響を与えないように見えました。

図1：研究デザイン hemiparkinsonianラットで異なる刺激プロトコルの実験を行うための単一の手順では、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：シリンダーテスト・セットアップのミラーを配置し、シリンダボックスこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3：シリンダー試験円筒試験中hemiparkinsonianラットこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：階段室テストのセットアップ左側の階段上のペレットを配置階段ボックス。上記の（A）は側面図、（B）図を示す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：階段試験 hemiparkinsonianラット階段テスト中。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6： 刺激部位冠動脈ラットの脳切片（チオニン染色）黒丸で示した右STNおよび移植手術中に記録された対応するスパイク信号に。。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7：チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン作動性ニューロンのマーカー酵素のための6-OHDA病変免疫組織化学のドキュメント 。ラット脳後部の冠動脈セクションER一方的な6-OHDA病変。左健側（ル）と病変右側（RI）の比較。黒質緻密部（SNC）内の線条体におけるドーパミン作動性繊維（a）およびドーパミン作動性ニューロンの片側損失、（c）に 。スケールバー=100μmである。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8： 足は、シリンダテストを使用する円筒試験の結果は、反対のように足パーセントでの使用（100％ -同側の足を使用する[％]）（原因病変に影響を受けた）表現、様々な条件の下で（病変対130 Hzの刺激）。。データは、平均±SEMとして与えられ、N = 7されてくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9：刺激ケーブル付きシリンダーテスト Aは、シリンダテスト中にhemiparkinsonianラットを刺激した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10
図10： 階段試験での成功率が階段試験の結果は、様々な条件（健康的な病変および130 Hzの刺激）の下で把握したペレットの数として表現しました。（一方向ANOVA + t検定）データは、平均±SEMとして与えられ、N = 7、P <0.05（*）は、統計的に有意とみなしました。3951 / 53951fig10large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図11
図11：刺激ケーブル A と階段テストでは、階段のテスト中にhemiparkinsonianラットを刺激した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

この記事では、シリンダおよび階段テストの詳細なトレーニングプロトコルについて説明します。後者が原因ラット^16,17に到達業者に複雑な把持動作と細かい運動の動きを評価するために設計されています。成果の測定は、客観的な測定であるテスト、中に食べたペレットの数として表現されます。プロトコルは、パーキンソン病および他の運動疾患モデルのラットモデルにおいて使用することができます。円筒試験は、ラットでの足の使用を評価するための簡単なアプローチを必要とします。それはトレーニングを必要とせず、ビデオテープから盲検評価することによって、高度に標準化された方法で使用することができます。我々はいくつかの理由のために、これらの他の中のテスト（オープンフィールド、単一のペレット到達テスト、および歩行分析）を選択します。両方のテストは確実に私たちのパーキンソンモデル¹⁰で作成した足の障害を示しています。これらは、結果が比較的ロバストであり、試験結果は、非常に客観的な方法で得ることができます。両方のテストはSHで繰り返し使用することができますORTの時間間隔。学習フェーズ中に階段試験、ペレット把持増加すると、個々のプラトーレベルに安定するので、プラトーに達した後、それは時間^16,20にわたってトレーニング依存性の改善を検討することなく使用することができます。

円筒試験を適用することは容易であるが、ラットは退屈と非アクティブになったことができます。動物は暗闇（赤色光でテストを実行する）、または、明暗サイクルの後半に動機付けすることができます。 rearingsの測定は、ラットの正常な活動を監視することが有用です。成功した階段の訓練のためには、アクイジション・フェーズの間に動物をやる気にさせる非常に重要です。ラットが最初に把持アプローチでいくつかのペレットをつかむことができることを保証することが重要です。即時正の報酬は後の段階では良いトレーニング効果をもたらします。ラットがタスクに興味を持っていないときにもう一つの重要なステップが発生します。この場合、まで穏やかな食事制限を適用する必要があるかもしれません適切なモチベーションのレベルに到達します。

私たちの研究デザインのためのもう一つの重要な問題は、確立された手法の良い予測妥当性でした。設計は、新規な刺激プロトコルのスクリーニングプラットフォームとして使用されるように計画されました。脳深部刺激はパーキンソン病のためだけでなく、振戦、うつ病、強迫性障害、ジストニアおよび他の多くの条件のためだけでなく、治療の選択肢ですが、その背後に有効性を横たわっメカニズムが不十分^1,21を理解まま。小説に対処するために、合理的なベースの刺激は、良好な動物モデルが必要とされて近づきます。

より現実的なアプローチは、刺激装置にケーブルを介して接続された動物によって実行することができる行動のセットアップを選択することが私たちを余儀なくされました。シリンダーは、この目的のために適切でした。市販の階段ボックスは、したがって、我々は高いと蓋なしでオリジナルの箱、のコピーを設計し、ふたを持っています。これは、テストすることができます深部脳刺激中のパフォーマンス。ケーブル駆動刺激の問題は、前臨床研究では一般的です。そこケーブルなしで刺激を可能にするいくつかのデバイスがありますが、それらの使用は、まだ^{22から24に}制限されています。私たちの研究のために我々は異なる刺激パターンを設定しても、長期的な刺激を実行する必要があります。それが動物に触れることなく、様々な刺激機能の簡単な再プログラミングを可能にするため、現時点ではこれが唯一のケーブル駆動の刺激によって行うことができます。この点で、この研究デザインは、脳深部刺激ラットの運動の成果を扱うほとんどの研究グループに適しています。

要約すると、この原稿は異なる実験DBS条件下でhemiparkinsonianラットの運動の成果を研究するための完全な長さのプロトコルを提示します。これは、階段ボックス内の訓練のための詳細なプロトコルと同様に、円筒試験の使用を記載します。説明トレーニング方法に関連する問題が異なるの際にラットを発生することがあります株、性別やベンダが使用されています。ラットは行動試験^20,25,26の彼らのパフォーマンスの性別や歪みに応じて異なります。雌ラットでは発情周期はまた、日常のパフォーマンス²⁷に影響を与えます。この制限に対処するために、メスのラットは発情周期^28を desynchronizes男性ずに収納することができます。また、異系交配するラット系統内の個々の学習曲線に応じたトレーニングフェーズの持続時間を調整する必要ができます。多くの場合、行動試験で使用される食物制限は慎重に適用する必要があります。絶食は、モチベーションを高める反面^20,29を把握の精度を低下させることができます。記載行動電池は、hemiparkinsonianモデルと組み合わせて、異なる治療選択肢とモータ結果への影響を研究するために使用することができます。視床下核の脳深部刺激のために、この研究デザインは、高い予測妥当性を持っています。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Staircase box without lid	Glas Keil, Germany		custom made
Cylinder box	Glas Keil, Germany		custom made
Dustless precision pellets, 45 mg	Bio Serv	F0021