Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Morfogenes är den process som formar embryot och tillsammans med tillväxt och differentiering driver ontogeni från ett befruktat ägg till en mogen multicellulär organism. De morfogenetiska processer under djur utveckling kan analyseras bäst genom avbildning av intakta levande exemplar 1-3. Detta beror på att en sådan helt embryo avbildning bevarar alla komponenter som driver och reglerar utveckling, inklusive gradienter av signalmolekyler, extracellulär matris, kärl, innervation samt mekaniska egenskaperna hos den omgivande vävnaden. För att överbrygga vågen, vid vilken morfogenes inträffar, snabba subcellulära händelser måste fångas på en minut tidsskala inom ramen för utvecklingen av hela vävnaden över timmar eller dagar. För att uppfylla alla dessa krav, var en modern tillämpning 4 av det ortogonala planet belysningsmikroskop 5 utvecklats. Ursprungligen var det namnet Selektiv Plane Belysning Microscopy (SPIM) 4; nu en allomfattande term Ljusblad fluorescensmikroskopi (LSFM) används typiskt. LSFM möjliggör avbildning med hög tidsupplösning, medan inducera mindre fototoxicitet än laserscanning eller roterande skiva konfokala mikroskop 6,7. Numera finns det redan många implementationer av den grundläggande principen för ljus ark belysning och det har använts för att avbilda en mängd olika prover och processer som tidigare otillgängliga för forskare 8-11.
Vi vill först belysa flera viktiga fördelar LSFM över konventionella konfokalmikroskopi metoder:
Att förvärva meningsfulla resultat från levande avbildning mikroskopiska experiment, är det viktigt att observationen endast minimalt påverkar provet. Men många organismer, inklusive zebrafisk är mycket känsliga för laserljusexponering, vilket gör det svårt att avbilda dem i en konfokalmikroskop med hög tidsupplösning utan fototoxicitet effekter som avstannat eller försenad utveckling 6,7. LSFM är för närvarande fluorescens bildteknik med de minst störande effekter på prov 7. Eftersom den tunna laserljus blad belyser endast den del av provet som avbildas vid en viss tidpunkt, är ljus ark mikroskop med hjälp fotoner mycket effektivt. Följaktligen tillåter den låga ljusexponering under längre tidsförlopp observationer av sund prover, t ex 12-17. Dessutom, tack vare den minimala invasivitet av LSFM antalet förvärvade bilder inte längre styrs av hur mycket ljus provet kan tolerera, utan snarare av hur mycket data kan bearbetas och lagras.
På samma sätt för att hålla provet i nära fysiologiska förhållanden, kommer LSFM med alternativa strategier väl lämpade för levande embryon provmontering. I LSFM tekniker är embryona typiskt inbäddade i en tunn kolonn av låg andel agaros. den mounting in i agaros cylindrar medger fullständig frihet för rotation, så provet kan observeras från den perfekta vinkeln (i LSFM kallat vy) och från olika vyerna samtidigt. Multiview imaging och efterföljande multiview fusion är till nytta särskilt för stora, spridnings prover och gör det möjligt att fånga dem med hög, isotrop upplösning. En sammanfattning av andra möjliga LSFM monterings strategier kan hittas i den officiella mikroskop bruksanvisningen, i kapitlet om provberedning skriven av labbet av E. Reynaud. Det är en rekommenderad läsning, speciellt om målet är att bild olika prover än vad som beskrivs här.
Bilden förvärvet i LSFM är brett fält, kamerabaserat, i motsats till laserskanning konfokalmikroskop. Detta resulterar i en högre signal-brusförhållande (SNR) för förvärvade bilder och kan vara mycket snabb (tiotals till hundratals bilder per sekund). Den höga känsligheten hos LSFM möjliggör avbildning av svagt fluorescerande samp ytterligareles, som transkriptionsfaktorer uttryckta på endogena nivåer 18 eller, inom en snar framtid, endogena proteiner taggade med hjälp crispr / Cas9. Den höga SNR är också viktigt för framgångsrik nedströms bildanalys. Den höga hastigheten krävs inte bara att fånga snabba intracellulära processer, men också för att avbilda hela embryot från flera vyer tillräckligt snabbt. En sömlös sammansmältning av de flera vyer kan endast uppnås, om det observerade fenomenet inte förändras under förvärv av dessa flera z stackar som kommer från separata vyer.
Fördelarna med LSFM vanligtvis inte ske på bekostnad av bildkvaliteten. Den laterala upplösning LSFM är något sämre än upplösningen av en konfokalmikroskop. Detta beror på att målen detektions används i LSFM har lägre numerisk öppning (vanligen 1,0 eller mindre) jämfört med 1,2-1,3 i vatten eller kisel dopp mål för standard konfokala inställningar. Dessutom, på grund av det breda detekteringsfältet i LSFM (absence av ett nålhål), det finns mer out-of-focus ljus jämfört med ett konfokalt mikroskop. Mängden av out-of-focus ljus bestäms av den ljusplåttjockleken. Ändå är dessa nackdelar kompenseras av högre SNR i LSFM. I praktiken resulterar detta i liknande kvalitetsbilder jämfört med t ex roterande skiva konfokala förvärv 15. Följaktligen möjliggör detta tillförlitlig utvinning av funktioner som cellmembran eller kärnor, t ex för cellinje spåra 15,19.
Den axiella upplösning på LSFM bestäms, förutom detekteringsmålet, av ljuset plåttjockleken. Den axiella upplösning på LSFM kan i vissa fall överträffar lösningen av konfokala mikroskop. Först, förbättringen i upplösning kommer när ljuset arket är tunnare än den axiella upplösningen hos detekteringsmålet, vilket vanligtvis inträffar för stora prover avbildas med en låg förstoring mål. Det andra sättet, hur LSFM kan ACHieve bättre axiell upplösning, är multiview fusion, i vilken upplösning information av hög xy från olika vyer kombineras i en bildstapel. Den resulterande sammanslagna stapeln har en isotropisk upplösning närmar värdena för upplösning i sidled 20,21. Strategin för registrering av flera vyer på varandra som beskrivs i denna artikel är baserad på användning av fluorescerande polystyrenpärlor som förvaltnings markörer inbäddade i agarosen runt provet 20,21.
Som ett resultat av LSFM kommersialisering, är denna teknik nu tillgänglig för en bred publik av forskare 22. Därför är motivationen för att skriva detta protokoll för att göra denna teknik tillgänglig för utvecklingsbiologer som saknar praktisk erfarenhet LSFM och att få dessa forskare börjat använda denna teknik med sina prover. Vår protokoll använder kommersiella ljus ark mikroskop, som utgör en konceptuellt enkel mikroskop thatt är lätt att använda. Vi skulle dessutom vilja nämna andra nya protokoll för avbildning zebrafisk med hembyggda LSFM uppställningar, som kan vara lämpliga för att svara på vissa frågor 23-25. En annan post alternativ till LSFM är de öppna plattformarna 26,27, som använder de öppna principer tillgång till bringa ljus ark mikroskop till en bredare gemenskap. Dokumentationen av både hårdvara och mjukvaruaspekter kan hittas på http://openspim.org och https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
I detta protokoll använder vi teleost zebrafisk som ett modellsystem för att studera utvecklingsprocesser med LSFM. Morfogenes av zebrafisk ögat är ett exempel som understryker många av fördelarna med LSFM. LSFM har redan använts tidigare för att undersöka ögonens utveckling i medaka 28 och i zebrafisk 29,30. I ett tidigt skede av ögonens utveckling är det komplicerat att orientera embryot korrekt för konventionell mikroskopi,som skrymmande äggula inte tillåter embryot att ligga på sidan med ögat mot målet. Men med LSFM montering i en agaroskolonn, provet kan reproducerbart placerade. Dessutom, under övergången från optisk vesikel till den optiska koppen stadiet genomgår ögat stora morfogenetiska omflyttningar tillsammans med tillväxt, vilket kräver att fånga en stor z stack och en stor synfält. Även för dessa utmaningar LSFM är överlägsen konventionell konfokal avbildning. Processen för optiska kopp bildning är tredimensionell, därför är det svårt att förstå och visualisera enbart genom avbildning från en vy. Detta gör multiview avbildning med isotrop upplösning fördelaktigt. Efter optisk kopp bildning, blir näthinnan allt känsligare för laserexponering. Således är den låga fototoxicitet i samband med LSFM en stor fördel för långsiktig avbildning.
Här presenterar vi en optimerad protokoll för avbildning av en till tre dagar gammal zebrafisk embryon ennd larver med fokus på ögonens utveckling. Vår metod möjliggör inspelning av tidsförlopp filmer som täcker upp till 12-14 timmar med hög spatial och temporal upplösning. Viktigt, visar vi också en rörledning för databehandling, som är ett viktigt steg i LSFM, eftersom denna teknik ger alltid stora datamängder, ofta i terabyte intervallet.
1. Kritiska steg och felsökning för datainsamling
De typiska avbildnings inställningar för en GFP och RFP som uttrycker prov återfinns i tabell 3. I det beskrivna mikroskopet inställningsljus arket är statisk, som bildas av en cylindrisk lins. De två belysnings målen är luft linser och detekteringsmålet är en vatten-dopplins. Zoom 1,0 med 20X / 1.0 eller 40X / 1.0 mål ger 230 nm och 115 nm pixelstorlek och ett synfält på 441 x 441 pm eller 221 x 221 pm respektive. Det rekommenderas att använda standardljusplåttjocklek med centrum till gräns förhållandet 1: 2. För 20X / 1,0 denna tjocklek motsvarar 4,5 | im och för 40X / 1,0-3,2 | j, m i mitten. Om utskriftshastighet är inte det primära prioritet, använda separata spår i händelse av en flerfärgad prov för att undvika överhörning av fluorescensemission mellan kanalerna. Den högsta hastigheten för förvärv är begränsat till 50 msek per z steg avrörelsehastighet z-drivrutinen. Om målet är att uppnå maximal utskriftshastighet i fallet med exempelvis två spår med dubbelsidig belysning, exponeringstiden måste ställas in så att summan av alla bilder som tas per z steg är under 50 msek. Å andra sidan, om bara en enda bild förvärvas per z steg, är det inte fördelaktigt att ställa in exponeringstiden kortare än 50 ms.
1920 x 1920 bildstorlek |
16-bitars |
Pivot skanna på |
Dubbelsidig belysning online fusion |
10X / 0,2 belysnings mål |
20X / 1.0 W Plan-Apochromat upptäckt mål |
Spår 1: Excitation 488 nm typiskt 2% av 100 mW laser, 550 nm SP emissionsfilter |
Spår 2: Excite 561 nm typiskt 3% av 75 mW laser, 585 nm LP emissionsfilter |
Exponeringstid på upp till 100 ms |
Z stack tjocklek 50-100 um |
1-1,5 um z stegstorlek i den kontinuerliga z körläge |
Inkubation vid 28,5 ° C |
Tabell 3: Imaging inställningar.
Kontroll av provet efter försöket
Det är viktigt att säkerställa att provet är fortfarande frisk vid slutet av experimentet. Som en första avläsning, kontrollera hjärtslag av provet under ett stereoskop. Med ett par vassa pincett provet kan tas ut ur agarosen och flyttade till inkubatorn att utveckla ytterligare för att kontrollera om det påverkades av avbildning. Alternativt kan det fastställas för antikroppsfärgning.
Montering och drift
Det är viktigt att hålla osmolaritet av kammaren sÖSNING nära osmolaritet inbäddning agaros, annars svullnad / krympning av agaros och efterföljande instabilitet av provet kommer att uppträda. Därför använder samma lösning (E3 medium utan metylenblått) för att fylla kammaren och att förbereda ett% låg smältpunkt agaros portioner. Dessutom, inte lämnar agaros i 70 ° C värmeblock under mer än två timmar, eftersom det kan förlora sina gelningsegenskaper.
Behöver inte bädda fisken i för varm agaros, eftersom detta kan leda till värmechocksvar eller död av embryot. Om du är osäker om effekten av varma agaros på embryon, kontrollera att svansen inte böjer och att hjärtfrekvensen inte blir långsammare. Om detta inträffar, använda en annan embryo för experimentet.
Hålla den totala längden av den agaroskolonn med provet kort (omkring 2 cm) och montera zebrafisk med huvudet orienterat mot kolvspetsen. Likaså agarosen cylindern sprutas från CAPILLAry bör hållas så kort som möjligt. Dessa åtgärder kommer att garantera stabilitet av provet genom hela filmen. Samtidigt måste agaroskolonnen vara tillräckligt lång så att glas kapillär själv inte når in i ljusbanan, eftersom detta skulle orsaka stor refraktion och reflektion.
Den initiala drift av provet förorsakas av volymförändringar för agarosen själva cylindern. Glidning av kolven är inte orsaken till den. Därför hjälper det inte att fastställa kolven med modellera eller nagellack. Embryot kan ändra sin ståndpunkt under filmen på grund av dess naturliga tillväxt också. Följaktligen är det lämpligt att centrera regionen av intresse i mitten av synfältet och hålla ett visst utrymme vid kanterna för att rymma dessa rörelser.
Reducerad mängd inbäddningsmedium i ljusbanan
Orientera provet korrekt bidrar till att uppnå bästa möjliga bildkvalitet 15. Genrally, bör excitation och emissionsljus färdas genom så lite vävnad och montering media som möjligt. Den optimala lösningen är agaros-fri montering. Detta uppnåddes exempelvis i en inställning för Arabidopsis lateral rot avbildning 14, där huvud roten monterades i Phytagel och sidorötter därefter låta växa ut ur gelén kolumnen helt. Agaros-fri montering utvecklades också för avbildning av hela embryogenes av Tribolium skalbagge under två dagar 12. förbättra bildkvaliteten var inte en primär motivation i det fallet. Tribolium embryon helt enkelt inte överlever i agarosen tillräckligt länge. En absolut inbäddning media-fri montering har inte uppnåtts för långsiktig avbildning i zebrafisk. Ändå kan vi dra fördel av det faktum att när agarosen stelnar, är de flesta embryon placerade diagonalt i kapillären med ett öga ligger djupt i agaros och det andra ögat vara nära ytan av inbäddning kolonnen. Than öga närmare ytan ger överlägsen bildkvalitet och därför bör avbildas företrädesvis.
Agaros koncentration och långsiktig imaging
Koncentrationen av agaros för montering är en kompromiss mellan stabilitet av provet och möjligheten för att rymma tillväxt av embryot och diffusion av syre till den. Det finns ingen ytterligare förstärkning i stabilitet av provet vid användning av agaros koncentrationer högre än 1%. Som utgångspunkt för att optimera experimenten vi rekommenderar 0,6% agaros, som också lämpar sig för embryon yngre än 24 HPF som är alltför känsliga för att monteras i 1% agaros. Att söva äldre embryon och larver, kan MS-222 koncentration höjas till 200 | ig / ml utan biverkningar 13.
Vid utvecklings embryon avbildas längre än ± 12 timmar, agaros montering rekommenderas inte, eftersom det begränsar tillväxten av embryot och Causes svans deformation. Denna fråga löstes för zebrafisk genom att montera embryon i FEP polymer rör med brytningsindex som liknar vatten 13,39. Musembryon, å andra sidan, kan immobiliseras i ihåliga agaros cylindrarna 40 eller i hål av en akrylstav fäst till en spruta 41. FEP röret montering rekommenderas inte som standardmetod men eftersom väggen av röret bryter ljuset drygt agaros.
Ljus ark uppriktning
För god bildkvalitet är det viktigt att utföra den automatiska ljus ark anpassning före varje experiment. Särskilt om zoominställningarna ändrades var målen tas ut, eller en annan vätska användes i kammaren.
Belysning
Vrid skanning av ljuset arket bör alltid vara aktiverad. För stora spridnings prover, är det nödvändigt att tillämpa dubbelsidig belysning online fusion att uppnå jämn belysning tvärs över synfältet. Dubbelsidig belysning minskar också ett specifikt problem i ögat avbildning, som är brytning av det infallande ljuset arket genom linsen av embryot. Mindre, spridnings prover kan effektivt avbildas med enkelsidig belysning, vilket förkortar avbildningstiden med hälften och kan resultera i något bättre bildkvalitet jämfört med dubbelsidig belysning. Detta beror på att ljusbanorna för de två belysnings armarna är alltid olika och desto effektivare en kan väljas. Dessutom är de två ljus ark som kommer från varje sida är aldrig perfekt i ett plan, som orsakar mild suddighet efter fusionen. För mycket snabba intracellulära händelser, som de växande mikrotubuli (Film 2) är dubbelsidig belysning inte är lämpligt, eftersom bilderna med belysning från vänster och höger förvärvas sekventiellt, vilket kan resultera i rörelseoskärpa.
fotoblekningoch fototoxicitet
Mindre fluoroforen fotoblekning nämns ofta som en stor fördel med LSFM. Vi vill hävda att målet bör vara någon fotoblekning alls. Om det märks fotoblekning i live imaging experiment, är provet förmodligen redan ut ur dess fysiologiska området tolererade laserexponering. När avbildning av zebrafisk embryon i den snurrande skivan mikroskop, i vår erfarenhet, kan hög fototoxicitet stall embryoutveckling redan innan de fluorescerande signal blekmedel markant. Därför bör bildinställningarna i LSFM justeras så att lite eller ingen fotoblekning observeras. Även om LSFM är skonsam till provet, är det klokt att använda bara så mycket lasereffekt och exponeringstid som behövs för att åstadkomma en signal till brusförhållandet är tillräcklig för den efterföljande dataanalys.
Z-stack, tidsintervall och datastorlek
De filer som genereras av LSFM är vanligtvis mycket stora; ibland i terabyte intervallet. Det är ofta nödvändigt att göra en kompromiss mellan bildkvalitet och datastorlek. Detta gäller särskilt för z avståndet mellan staplar och intervaller i time-lapse förvärv. Att definiera z intervall bör Optimal på fliken Z-stack verktyg helst användas, särskilt om datamängden kommer att dekonvolvering senare. Det beräknar avståndet för att uppnå 50% överlappning mellan angränsande optiska skivor. Ändå något större z intervall är vanligtvis acceptabelt. De minskar den tid som behövs för att förvärva z stacken liksom den slutliga filstorleken. Den optimala samplingstiden beror på processen av intresse. För övergripande ögonens utveckling 5-10 minuters intervall är vanligtvis acceptabelt. Om vissa konstruktioner skall automatiskt spåras, måste de efterföljande tidpunkter vara tillräckligt lika.
fluorescerande pärlor
Fluorescerande pärlor tjänar främst som referensmarkörer för registrering olika vyerav en multiview dataset på varandra. virvel alltid pärla lösningar noggrant före användning. Värm inte kulorna, eftersom detta kan leda till förlust av fluorescerande färgämne. Den optimala vulsten koncentrationen för den multiview registrering måste bestämmas experimentellt. Den beskrivna plugin fungerar bäst med cirka 1000 upptäckta pärlor hela varje vy. Större (500 nm eller 1000 nm) pärlor upptäcks mer robust än mindre (mindre än 500 nm) pärlor. Detta beror på att större kulor är ljusare och är lättare att segment utan falska positiva upptäckter av strukturer i provet. Nackdelen med de större pärlorna är att de är mycket framträdande i den slutliga smält och dekonvolvering bild. För varje ny fluorescerande markör, den lämpliga pärlstorlek och fluorescensemission måste optimeras. För att ge ett exempel på prov från figur 5 och Movie 3, 100 nm grön utsläpps pärlor gav alltför många falska positiva upptäckter i membran GFP kanal, men 1000 nM Red utsläpps pärlorna kraftigt detekteras i H2B-RFP kanal med mycket få positiva upptäckter inuti provet. Om pärlan detektering misslyckas i kanalen med fluorescerande markör, kan en separat kanal som endast innehåller pärlor förvärvas, men detta är inte särskilt praktiskt. De sub-upplösning stora pärlor ger en direkt avläsning av punktspridningsfunktionen (PSF) av mikroskopet, vilket kan användas för avfaltning (Figur 2C-D). Om registreringen och fusion fungerar bättre med större pärlor (t.ex. 1000 nm), kan en separat bild av PSF förvärvas med sub-upplösning, t.ex. 100 nm pärlor. Använda multicolor pärlor är användbart under registrering av flerkanalig förvärv och för att verifiera att kanalerna overlay perfekt.
Tillsats av fluorescerande pärlor är inte nödvändigt vid avbildning från en enda vy utan efterföljande multiview registrering och fusion. Men även i dessa fall pärlor kan vara till hjälp under inil justering ljus ark för att kontrollera kvaliteten på ljuset arket och i allmänhet att avslöja optiska aberrationer. Sådana optiska aberrationer kan härröra från olika källor som skadade eller smutsiga mål, smutsiga fönster i kammaren eller inhomogenitet i agarosen. Pärlor kan även användas för drift korrigering av multiview registrering Fiji plugin 20.
Multiview
För multiview rekonstruktion ändamål, är det bättre att få ett udda antal visningar 3, 5 och så vidare, som inte är motsatta varandra. Detta förbättrar avfaltning sedan PSFS avbildas från olika håll. Det är också viktigt att bekräfta vid början av den tid förflutit förvärvet att det finns tillräcklig överlappning mellan vyerna. Detta görs bäst empiriskt, dvs omedelbart bekräfta att vyerna i den första tidpunkten kan registrerats. När målet för multiview förvärvet är att öka upplösningenav en bild av en stor spridnings exemplar, är det inte tillrådligt att bilden hela provet i varje vy, men att sluta runt mitten av provet, där signalen försämras. Den låga kvaliteten förvärv från den andra halvan av provet skulle inte tillföra användbar information till multiview återuppbyggnad.
2. Kritiska steg och felsökning för databehandling
För närvarande, finns det flera möjligheter för behandling av multiview data från en ljus ark mikroskop som är väl dokumenterade och relativt lätt att anta. Vi använder multiview återuppbyggnads ansökan, som är en öppen källkod implementeras i Fiji 32 (Stephan Preibisch opublicerad, Länk 1a och Link1b i förteckningen över material). Denna plugin är en stor redesign av den tidigare SPIM registrerings plugin 20, sesav Schmied et al. 42, integrera BigDataViewer och dess XML och hdf5 format 33 med SPIM registreringsflödet (Figur 1B, Länk 2 , Link 3 ). Denna ansökan kan även anpassas för högprestandaberäkningar kluster, vilket avsevärt snabbar upp behandlingen 43. Denna multiview registreringsansökan aktivt vidareutvecklas och håller på att förbättras. Vid problem eller funktioner förfrågningar om den beskrivna programvaran, skicka in frågor på respektive github sidor ( Länk 4 för Multiview återuppbyggnad och Link 5 för BigDataViewer).
Det andra alternativet är att använda kommersiell programvara tillgänglig tillsammans med mikroskop. Denna lösning fungerar bra och sysselsätter samma princip om att använda fluorescerande pärlor att registrera de olika vyerna. Den saknar dock möjlighet att visualisera hela dataset snabbt som med BigDataViewer. Även programvaran kan inte anpassas till klustret och dessutom behandlingsblock mikroskop för andra användare, om inte ytterligare licens för programvaran köps.
Det tredje alternativet, som också är en öppen källkod, har nyligen publicerats av Keller lab 44 och ger en övergripande ram för bearbetning och nedströms analys av ljusdatablad. Denna programvara är med hjälp av information från i provet för att utföra multiview fusion, därför att den inte kräver närvaron av fluorescerande pärlor runt provet. Men samtidigt är det förutsätter ortogonala orienteringen av bild vyer (mål), så det kan inte användas för data som samlats in från godtyckliga vinklar 44.
hårdvaru~~POS=TRUNC krav~~POS=HEADCOMP
ntent "> Den hårdvara som används för bearbetning kan hittas i tabell 4. Det måste finnas tillräcklig lagringskapacitet och en tydlig rörledning för databehandling tillgängliga, före det faktiska experimentet. Förvärv av bilderna är snabbare än efterföljande analys och det är lätt att få översvämmade med obearbetade uppgifter. Det är ofta orealistiskt att lagra alla råbilder, utan snarare den beskurna eller bearbetade bilder som sammanslagna vyer, maximal intensitet projektioner eller sfäriska utsprång 45.processor | Två Intel Xeon processor E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / s) |
Minne | 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM |
Hårddisk | 4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7,200 rpm) hårddisk |
HDD Controller | PERC H310 SATA / SAS Concontroller för Dell Precision |
HDD-konfiguration | C1 SATA 3,5 tum, 1-4 hårddiskar |
Grafik | Dubbla 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kort w / 2 DP och en DVI-I vardera) (2 DP-DVI och två DVI-VGA-adapter) (MRGA17H) |
Nätverk | Intel X520-T2 Dual Port 10 GbE-nätverkskort |
Tabell 4: Hårdvarukrav.
Databehandlingshastighet
Den tid som behövs för databehandling beror på dimensionerna hos de uppgifter och om det används hårdvara. I tabell 1, ger vi en översikt över den tid som krävs för de viktigaste stegen i att behandla ett exempel 8,6 GB multiview dataset som bestod av en tidpunkt med 4 vyer och 2 kanaler.
bearbetning sTEP | Tid | protokoll~~POS=TRUNC steg~~POS=HEADCOMP |
Spara om som hdf5 | 6 min 30 sek | 6,3 |
Identifiera räntepunkter | 20 sek | 6,4 |
Registrera sig med intressepunkter | 3 sek | 6,5 |
Innehållsbaserad multiview fusion | 4 tim | 7,2 |
Multiview avfaltning (CPU) | 8 tim | 7,3 |
Multiview avfaltning (GPU) | 2 tim | 7,3 |
Tabell 1: Data Processing Time.
Indataformat för multiview rekonstruktion
Fiji Plugin Multi återuppbyggnad kan stödja .czi, Tif och ome.tiff format. På grund av datastruktur .czi format, diskontinuerliga datamängder är intestöds utan förbearbetning. Diskontinuerliga innebär att inspelningen skulle startas (t.ex. för att justera positionerna på grund av driften av provet). I det här fallet behöver .czi filer som ska sparas om som .tif. För .tif-filer varje vy och belysningsriktningen måste sparas som en separat fil.
Kalibrering av pixelstorlek
Mikroskopet-operativsystem beräknar kalibrering för xy pixelstorlek baserad på den valda målet. Emellertid är bildpunktstorleken i z definieras oberoende med stegstorleken. Om fel mål som anges i programmet xy z förhållande är felaktig och registrering kommer att misslyckas.
ursprungliga registreringen
Efter att definiera dataset antalet registreringar blir ett och antalet räntepunkter kommer att vara 0 i ViewSetup Explorer. Den första registreringen representerar kalibrering av datamängden. Både antalet of registreringar och intressepunkter kommer att öka under bearbetningen.
Ner provtagning för detektering av intressepunkter
Använda ned provtagning rekommenderas, eftersom laddningen av filerna och segmente kommer att vara mycket snabbare. Det är dock viktigt att notera att de detektionsparametrar kommer att ändras beroende på ned provtagning, alltså överföra inställningar upptäckt mellan olika ned prov inställningar är inte möjlig.
Detektering av intressepunkter
Det är lämpligt att segmentera så många riktiga pärlor som möjligt i varje vy, även till priset av att få några falska positiva upptäckter, eftersom de inte hindrar registrering avsevärt. Falska detektioner, om få till antalet, är uteslutna under registrering (se Registrering av räntepunkter). Emellertid massiva falska positiva detekteringar utgöra ett problem för algoritmen. Det minskar inte bara prestanda för att upptäcka ochregistrering, eftersom det tar mycket längre tid att segmentera bilden samt jämföra dessa pärlor mellan vyerna, men det minskar också riktigheten i registreringen. Detta kan åtgärdas genom att använda strängare detektionsparametrar. Dessutom, under segmentering av pärlorna (dvs. multipla detekteringar på en pärla Figur 1E) är skadlig för registrering och bör undvikas.
Registrering av räntepunkter
Att registrera utsikt till varandra, är placeringen av varje pärla i varje vy beskrivs av sin position i förhållande till de tre närmaste grann pärlor. Dessa konstellationer bildar en lokal geometrisk deskriptor och tillåter att jämföra varje pärla mellan vyerna. Pärlor med matchande deskriptor mellan två vyer sedan betraktas som kandidat motsvarigheter. Observera att detta bara fungerar för slumpmässigt fördelade kulor, för vilka lokala beskrivningar är typiskt unik för varje pärla.Man kan använda andra strukturer som kärnor i provet för registrering. Men för att upptäcka kärnor, som är fördelade icke slumpmässigt i provet, andra metoder tillämpas 20,21.
Kandidat överensstämmelser testas sedan mot RANSAC 36 för att utesluta falska positiva. Varje korrespondens föreslår en omvandling modell för överlagring synpunkter på varandra. Sanna överensstämmelser skulle sannolikt komma överens om en omvandling modell, medan extremvärden skulle varje punkt till en annan. De sanna överensstämmelser används sedan för att beräkna en affin transformation modell mellan de två jämförda vyer. En global optimering med en iterativ optimeringsalgoritm genomförs sedan, under vilken alla synpunkter registreras på den första vyn i syfte att minimal förskjutning mellan vyerna 20,21.
Time-lapse registrering
På grund av att flyttalingen av agarosen och oprecisa motorrörelse av mikroskop scenen, positionen av varje stapel varierar måttligt över tiden. Medan registreringen av enskilda tidpunkt avlägsnar skillnaden mellan synpunkter från denna tidpunkt, måste tidsförlopp också att bli registrerad som en helhet. För detta ändamål är varje enskild tidpunkt registreras på referenstidpunkten.
Referenstidpunkten
Om en tidsserie med många tidpunkter behandlas, är en representativ tidpunkt vald som referens vanligtvis från mitten av tidsserierna eftersom pärla intensitet kan försämras med tiden på grund av blekning. På denna referens, kan parametrarna för räntepunkt upptäckt, registrering, markeringsramen och fusion fastställas. Dessa parametrar appliceras sedan på hela tiden förflutit för att beräkna en specifik transformationsmodell för varje enskild tidpunkt. Under tidsförlopp registrering alla andra tidpunkter är också registställda rums på denna referenstidpunkten. Således begränsnings box parametrar för hela inspelningen är beroende av denna specifika tidpunkt.
flerkanalig registrering
När avbildning flera kanaler, helst samma fluorescerande pärlor ska synas i alla avbildade kanaler. Detekteringen och registreringen kan sedan utföras på varje kanal för sig, som tar hänsyn till inverkan av de olika ljusvåglängderna på transformationen. Ofta är detta inte möjligt, eftersom pärlorna inte är synliga i alla kanaler eller pärlorna dominerar bilden för mycket i en kanal och är alltför svagt i den andra kanalen (-erna). Den typiska lösningen är att använda pärlor synliga endast i en kanal för detektering och registrering och förvärvad transformationsmodellen (dvs efter upptäckt, registrering och time-lapse registrering) appliceras sedan på de andra kanalerna från Fiji> Plugins> Multiview Reconstruktion> Gruppbearbetning> Verktyg> Duplicate Transformationer. I rullgardinsmenyn för Apply omvandling av väljer en kanal till andra kanaler. I följande fönster väljer XML och klicka på OK. Välj sedan den kanal som innehåller pärlorna som Källa kanal och som Target kanal välj kanal (s) utan pärlor. För Duplicate som transformationer använder Ersätt alla transformationer och tryck på OK. De transformationer sedan kopieras till alla andra kanaler och sparas i XML. Om du vill se de nya förändringarna i ViewSetup Explorer, starta om Multi återuppbyggnad Application.
begränsningsram
Sammansmältningen av flera vyer är beräknings mycket intensiv. Men stora bilder typiskt förvärvas för att rymma inte bara provet, men också pärlor runt den. När registreringen parameterns extraheras från pärlorna, är de inte längre användbara som en del av bilden. Därför, för att öka effektiviteten i fusion, bör endast de delar av bildstaplar som innehåller provet smält samman. En region av intresse (avgränsande box) bör definieras för att innehålla provet och så lite av det omgivande agaros som möjligt. För exemplet i figur 2 ett vägt genomsnitt fusion på hela volymen med 2229 × 2136 × 2106 px skulle kräva 38,196 MB RAM, medan med en markeringsramen volymen minskas till 1634 × 1746 × 1632 px och minneskraven minskar till 17,729 MB.
Innehållsbaserad multiview fusion
Utmaningen i fusing multiview data är att åsikterna slutar vanligtvis abrupt och inte innehåller samma bildkvalitet för samma voxlar. Enkel medelvärdes av åsikter skulle därför leda till blandnings artefakter och onödig bildförsämring. Innehållsbaserad multiview fu sionen tar båda dessa problem i beaktande. Först blandar det olika vyer där en bild slutar och den andra börjar och andra bedömer den lokala bildkvalitet och tillämpar högre vikter till högre bildkvalitet i fusions 21. Jämfört med en enda anser att det är en förbättring av upplösningen i z med en liten försämring av signalen i xy (Figur 2E-H, figur 5A-D).
Multiview deconvolution
Multi avfaltning är en annan metod för att uppnå fusion av vyerna. Med denna metod också PSFS av de olika synpunkter beaktas i syfte att utvinna den bild som har faltas av optiken i mikroskop. Denna metod drastiskt förbättrar bildkvaliteten genom att avlägsna oskärpa och öka upplösning och kontrast av signalen 31 (Figur 2C-D, figur 2I-J, Figur 5E-G, Movie 3).
ve_content "> Deconvolution är beräknings mycket intensiv (se tabell 1), vilket med hjälp av en GPU för bearbetning ökar hastigheten på denna process. Det kan också vara nödvändigt att utföra avfaltning på ner samplade data. För ned prov, använd Fiji> Multi återuppbyggnad > Gruppbearbetning> Verktyg> tillämpa Transformationer. Detta kommer att gälla en ny transformation modell på de åsikter som kommer att sparas i XML-fil.Hdf5 filformat för BigDataViewer och BigDataServer
Den BigDataViewer 33 möjliggör enkel visualisering av terabyte-storlek data. Hur man styr BigDataViewer sammanfattas i tabell 2. En screencast av den grundläggande hanteringen av programmet finns även som ett komplement i sin ursprungliga publikation 33. Den BigDataViewer är centrerad på en XML-fil, som innehåller metadata och en hdf5 fil som innehåller bilddata. Bilddata är present i hdf5 i multipla upplösningsnivåer i 3D-block. De multipla upplösningsnivåer möjliggör visualisering av data snabbare med lägre upplösning, innan full upplösning är laddad. Enskilda block är endast laddas in i minnet när det behövs. Således tillåter hdf5 bildformat direkt och snabb visualisering av data via BigDataViewer 33. Det snabbar också upp bearbetning eftersom laddningen av filerna utförs mer effektivt. Därför rekommenderar vi spara om datamängden i detta format, även om det inte är absolut nödvändigt för behandlingen. För ytterligare förklaring av dataformatet, se länk 3 . Dessutom kan datamängderna delas med medarbetare eller allmänheten med hjälp av BigDataServer 33 ( länk 6 ).
nyckel- | <td> effekt|
F1 | visar Hjälp med en kort beskrivning av BigDataViewer och dess grundläggande funktion |
<> Eller mushjulet | rörelse i z |
upp och ner pil | zooma in och ut |
högerklicka och dra | förflyttar provet i betraktaren |
vänster klicka och dra | roterar prov runt markören |
reglaget längst ner på betraktaren eller Tab och vänster eller höger pil | flyttar på tidsaxeln |
dessutom trycka skift | snabbare rörelse eller rotation längs någon axel |
x och sedan vänster och höger pil | roterar kring x-axeln |
y och sedan vänster och höger pil | roterar kring y-axeln |
z och sedan vänster och höger pil | roterar runt z-axeln |
skift och x | orienterar vy längs x-axeln |
skift och y | orienterar vy längs y-axeln |
skift och z | orienterar vy längs z-axeln |
jag | växlar mellan de olika interpole lägen (dvs. närmaste granne och Trilinjär) |
s eller Inställningar> Ljusstyrka och kontrast | modifierar färgen på kanaler, ljusstyrka och kontrast |
F6 eller Inställningar> Synlighet och gruppering | ändrar de visade grupperna möjliggör gruppering till liggande olika grupper och ringa grupperna via siffertangenterna |
F10 eller Verktyg> Spela in film | förvärvar en tidsserie av den visade skiva |
Tabell 2: Big Data Viewer.
3. Begränsningar av den beskrivna genomförandet av LSFM
låg genomströmning
I en typisk LSFM experiment endast ett prov per experiment avbildas. Ändå vår erfarenhet, en hel del användbar information kan extraheras från den enda prov. Hög genomströmning avbildning av flera embryon har nyligen gjorts i hemmet byggt LSFM uppställningar 46-48, men typiskt på bekostnad av frihet prov positionering och rotation.
Otillräcklig penetration djupt in i vävnader
Även om zebrafiskembryon är genomskinliga, är den erhållna bildkvaliteten försämras snabbt vid avbildning djupare i vävnaden på grund av spridning och absorption. Delvis är detta en effekt av spridning och absorption av den emitterade fluorescensen av provet och kan inte rättas till i den aktuella installationen. En annan källa till den ojämna bildkvaliteten är oregelbunden belysning. Than lätt ark infaller från vänster eller höger sida och alla föremål i dess väg bryta det, vilket resulterar i rand artefakter och oskärpa. Den dubbla sidiga belysning och multiview fusion kan minska artefakterna i den slutliga bilden. Slutligen tenderar bildkvaliteten att vara något sämre mot kanten av synfältet på grund av den naturliga geometrin hos det ljus arket, som blir tjockare mot kanterna.
Begränsad kemisk manipulation
Användningen av läkemedel eller inhibitorer är utbredd i zebrafisk forskning. I detta mikroskop användning av droger är begränsad, på grund av den stora volymen av provkammaren och hänsyn till andra användare av instrumentet, som delar samma kammare. Använda en extra kammare tillägnad drogexperiment kan lösa det här problemet. delvis fylla kammaren med glaspärlor minskar den vätskevolym som krävs.
ingen photomanipulation
Currently det finns ingen möjlighet till lokaliserad optisk behandlig som photoconversion, eller laserablation i detta mikroskop. Ändå kan hembyggda inställningar användas för sådana specifika tillämpningar.
4. betydelse och framtida tillämpningar
LSFM är den bästa metoden hittills tillgänglig för snabb avbildning av stora volymer av levande embryon. De flesta av experimenten tänkbara på ett konfokalt mikroskop kan också utföras på en ljus ark mikroskop med ovannämnda fördelarna. I fallet med avbildning av ögonens utveckling, är hastigheten på LSFM inte den avgörande parametern. Istället låg fototoxicitet och flexibilitet i prov placering är avgörande fördelar.
De LSFM uppgifter har en hög SNR, vilket bidrar till att uppnå goda deconvolution resultat och är också bra för automatiserad bildanalys och spårning objekt. Sammanfattningsvis är LSFM ett bra verktyg för att generera mätbara uppgifter om embryonal utveckling och Overall cell och vävnadsegenskaper för efterföljande modellering och fysiska beskrivningar av processerna i fråga.
The authors have nothing to disclose.
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
Links | |||
Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |