Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Morfogenese er den proces, der former embryonet og sammen med vækst og differentiering driver ontogeni fra et befrugtet æg i en moden multicellulær organisme. De morfogenetiske processer under dyr udvikling kan analyseres bedst ved billeddannelse af intakte levende eksemplarer 1-3. Dette er fordi sådan hele embryo billeddannelse bevarer alle de komponenter, som driver og regulerer udvikling, herunder gradienter af signalmolekyler, ekstracellulær matrix, vaskulatur, innervation samt mekaniske egenskaber af det omgivende væv. At bygge bro over skalaer, hvor morfogenese opstår, de hurtige subcellulære begivenheder skal indfanges på et minut tidsskala i forbindelse med udvikling af hele væv løbet timer eller dage. For at opfylde alle disse krav, blev en moderne implementering 4 i den retvinklede plane belysning mikroskop 5 udviklet. Oprindeligt blev det navngivet Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) 4; nu en altomfattende sigt Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) anvendes typisk. LSFM muliggør billedbehandling med høj tidsopløsning, mens fremkalde mindre fototoksicitet end laserscanning eller spinning disc konfokale mikroskoper 6,7. I dag er der allerede mange implementeringer af den grundlæggende lys ark belysning princip, og det har været brugt til at afbilde et stort udvalg af prøver og processer hidtil utilgængelige for forskere 8-11.
Vi vil først gerne fremhæve en række vigtige fordele ved LSFM forhold til konventionelle konfokal mikroskopi tilgange:
At erhverve meningsfulde resultater fra levende billeddannelse mikroskopiske eksperimenter, er det vigtigt, at observationen kun minimalt påvirker prøven. Men mange organismer, herunder zebrafisk er meget modtagelige for laserlys eksponering, hvilket gør det svært at billedet dem i et konfokalt mikroskop med høj tidsopløsning uden fototoksicitet efeffekter som gået i stå eller forsinket udvikling 6,7. LSFM er i øjeblikket den fluorescens billeddannelse teknik med de mindst skadelige virkninger for prøven 7. Da den tynde laserlys ark lyser kun den del af prøven, der afbildes på et bestemt tidspunkt, lyspladen mikroskopet er hjælp fotoner meget effektivt. Derfor den lave lys eksponering giver mulighed for længere time-lapse observationer af sundere prøver, fx 12-17. Desuden, takket være den minimale invasivitet af LSFM, antallet af erhvervede billeder er ikke længere bestemt af hvor meget lys prøven kan tåle, men snarere ved, hvor mange data kan bearbejdes og lagres.
På samme måde at holde modellen i nær fysiologiske forhold, LSFM kommer med alternative prøve montering strategier velegnet til levende fostre. I LSFM teknikker er de embryoner typisk indlejret i en tynd søjle af lav procentdel agarose. Den mounting til agarose cylindre giver mulighed for fuldstændig fri rotation, så prøven kan observeres fra den perfekte vinkel (i LSFM benævnt visning) og fra flere synspunkter på samme tid. Den multiview billedbehandling og efterfølgende MultiView fusion er gavnligt især for store, spredning prøver og tillader fange dem med høj, isotropt opløsning. Et resumé af andre mulige LSFM montering strategier kan findes i den officielle mikroskop betjeningsvejledning, i kapitlet om prøveforberedelse skrevet af laboratoriet af E. Reynaud. Det er en anbefalet læsning, især hvis målet er at billedet forskellige prøver end beskrevet her.
Overtagelsen billede i LSFM er bredt felt, kamera-baseret, i modsætning til laser scanning konfokal mikroskop. Dette resulterer i en højere signal-støj-forholdet (SNR) for anskaffede billeder og kan være yderst hurtig (ti til hundrede billeder i sekundet). Den høje følsomhed LSFM muliggør yderligere billeddannelse af svagt fluorescerende Samples, ligesom transkriptionsfaktorer udtrykt på endogene niveauer 18 eller i den nærmeste fremtid, endogene proteiner kodet ved hjælp CRISPR / Cas9. Den høje SNR er også vigtig for en vellykket nedstrøms billedanalyse. Den høje hastighed er forpligtet til ikke blot at fange hurtige intracellulære processer, men også at billedet hele embryo fra flere synspunkter hurtigt nok. kan kun opnås en problemfri fusion af de mange synspunkter, hvis det observerede fænomen ikke ændres under erhvervelse af disse flere z stakke fra separate visninger.
Fordelene ved LSFM typisk ikke ske på bekostning af billedkvaliteten. Den laterale opløsning på LSFM er lidt dårligere end opløsningen af et konfokalt mikroskop. Dette skyldes, at målene påvisning anvendes i LSFM har lavere numeriske apertur (sædvanligvis 1,0 eller mindre) sammenlignet med 1,2-1,3 vand eller silicium immersionsobjektiver på standard konfokale opsætninger. Derudover grund af den brede felt afsløring i LSFM (absence af et lille hul), der er mere ude af fokus lys i forhold til et konfokalt mikroskop. Mængden af ude-af-fokus lys bestemmes af lys pladetykkelse. Ikke desto mindre er disse ulemper kompenseres ved højere SNR i LSFM. I praksis resulterer dette i lignende kvalitet billeder i forhold til for eksempel spinning disk konfokal erhvervelse 15. Derfor er dette muliggør pålidelig udvinding af funktioner som cellemembraner eller kerner, fx for celle afstamning sporing 15,19.
Den aksiale beslutning af LSFM bestemmes, foruden påvisningen mål af lyset pladetykkelse. Den aksiale opløsning på LSFM kan i nogle tilfælde overgå løsning af konfokale mikroskoper. For det første forbedring i beslutningen kommer, når lyset plade er tyndere end den aksiale opløsning på påvisning mål, der typisk sker for store prøver afbildet med en lav forstørrelse mål. Den anden måde, hvordan LSFM kan ACHieve bedre aksial opløsning, er det multiview fusion, hvor den høje xy opløsning information fra forskellige synspunkter er kombineret i ét billede stakken. Det resulterende fusionerede stak har en isotrop opløsning nærmer værdierne af opløsningen i sideretningen 20,21. Strategien til registrering af flere visninger på hinanden beskrevet i denne artikel er baseret på anvendelse af fluorescerende polystyren perler som betroede markører indlejret i agarose omkring prøven 20,21.
Som et resultat af den LSFM kommercialisering, denne teknik er nu tilgængelig for et bredt publikum af forskere 22. Derfor er motivationen til at skrive denne protokol er at gøre denne teknologi tilgængelig for udviklingsmæssige biologer mangler praktisk erfaring i LSFM og at få disse forskere begyndte at bruge denne teknologi med deres prøver. Vores protokollen bruger den kommercielle lys ark mikroskop, som udgør en begrebsmæssigt enkel mikroskop that er nem at betjene. Vi vil desuden gerne nævne andre nylige protokoller til billeddannelse zebrafisk med hjemmelavede bygget LSFM opsætninger, som kan være egnet til at besvare bestemte spørgsmål 23-25. En anden indgang mulighed for at LSFM er de åbne platforme 26,27, som bruger de åbne adgang principper at bringe lys ark mikroskopi til en bredere samfund. Dokumentationen af både hardware og software aspekter kan findes på http://openspim.org og https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
I denne protokol, bruger vi teleost zebrafisk som et modelsystem til at studere udviklingsprocesser med LSFM. Morfogenese af zebrafisk øjet er et eksempel, understreger mange af fordelene ved LSFM. LSFM er allerede blevet anvendt i fortiden for at undersøge øjet udvikling i Medaka 28 og i zebrafisk 29,30. På det tidlige stadium af øjet udvikling det er kompliceret at orientere embryo korrekt for konventionelle mikroskopi,som den voluminøse blommen ikke tillader embryonet at ligge på den side med øjet vender mod målet. Men med LSFM montering i en agarose søjle, prøven kan reproducerbart placeret. Derudover under overgangen fra optikken vesikel til optikken cup fase, øjet foretages større morfogenetiske omlejringer ledsaget af vækst, der kræver indfange et stort z stakken og en stor synsfelt. Også til disse udfordringer LSFM er overlegen i forhold til konventionel konfokal billeddannelse. Processen med optiske kop dannelse er tredimensional, derfor er det svært at forstå og visualisere udelukkende ved billeddannelse fra en oversigt. Dette gør MultiView billeddannelse med isotropisk opløsning gavnligt. Efter optisk kop dannelse, nethinden bliver stadig følsomme over for laser eksponering. Den lave fototoksicitet forbundet med LSFM er således en stor fordel for langsigtet billeddannelse.
Her præsenterer vi en optimeret protokol til billeddannelse af en til tre dage gamle zebrafisk embryoner ennd larver med fokus på øjet udvikling. Vores metode giver mulighed for optagelse af time-lapse film, der dækker op til 12-14 timer med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Vigtigt er det, viser vi også en rørledning til databehandling, hvilket er et vigtigt skridt i LSFM, da denne teknik uvægerligt genererer store datasæt, ofte i terabyte rækkevidde.
1. Kritiske trin og fejlmelding af datafangst
De typiske imaging indstillinger for et GFP og RFP udtrykkende prøve kan ses i tabel 3. I den beskrevne mikroskop setup lyspladen er statisk, dannet af en cylindrisk linse. De to belysning formål er luft linser og afsløring målet er en vand-dypning linse. Ind 1,0 med 20X / 1.0 eller 40X / 1.0 mål giver 230 nm og 115 nm pixelstørrelse og et synsfelt på 441 x 441 um eller 221 x 221 um henholdsvis. Det anbefales at bruge standard lys pladetykkelse med center til grænsen forholdet 1: 2. For 20X / 1.0 svarer denne tykkelse til 4,5 um og for 40X / 1.0 til 3.2 um i midten. Hvis billeddannelseshastighed ikke er den primære prioritet, anvende separate spor i tilfælde af en flerfarvet prøve at undgå krydstale af fluorescensemission mellem kanalerne. Den højeste hastighed for erhvervelsen er begrænset til 50 msek pr z trin afbevægelseshastighed z-driver. Hvis målet er at opnå den maksimale imaging hast i tilfælde af fx to spor med dobbelt sidet belysning, eksponeringstiden skal indstilles således, at summen af alle de billeder taget pr z skridt er under 50 ms. På den anden side, hvis erhverves kun en enkelt billede pr z trin, er det ikke fordelagtigt at indstille eksponeringstiden kortere end 50 msek.
1920 x 1920 billedstørrelse |
16-bit |
Pivot scan på |
Dobbelt sidet belysning med online fusion |
10X / 0,2 belysning målsætning |
20X / 1.0 W Plan-Apochromat målsætning afsløring |
Spor 1: Excitation 488 nm typisk 2% af 100 mW laser, 550 nm SP emissionsfilter |
Spor 2: Excitation 561 nm typisk 3% på 75 mW laser, 585 nm LP emission filter |
Eksponering tid op til 100 ms |
Z stak tykkelse 50-100 um |
1-1,5 um z skridt størrelse i kontinuerlig z-drev tilstand |
Inkubation ved 28,5 ° C |
Tabel 3: Billedbehandling Indstillinger.
Eftersyn af prøven efter forsøget
Det er vigtigt at sikre, at prøven er stadig sundt ved slutningen af eksperimentet. Som et første udlæsning, kontrollere hjerteslag af prøven under en Stereoskopet. Med et par skarpe pincet prøven kan tages ud af agarose og flyttede til inkubatoren til at udvikle yderligere for at kontrollere, om det var påvirket af billeddannelse. Alternativt kan det fastsættes for antistof-farvning.
Montering og drift
Det er vigtigt at holde osmolariteten af kammeret solution tæt osmolariteten af indlejringen agarose, ellers hævelse / krympning af agarose og efterfølgende ustabilitet af prøven vil forekomme. Brug derfor den samme løsning (E3 medium uden methylenblåt) for at fylde kammeret og forberede en% agarose med lavt smeltepunkt portioner. Derudover ikke forlader agarose i 70 ° C varme blok i mere end 2 timer, da det kan miste sine geleringsegenskaber.
Må ikke indlejre fisken i for varmt agarose, da dette kan føre til varme chok reaktion eller død af embryoet. Hvis du er usikker om effekten af varme agarose på embryoner, kontrollere, at halen ikke bøje og at pulsen ikke bremse. Hvis dette sker, skal du bruge en anden foster til eksperimentet.
Hold samlede længde af agarose kolonne med prøven kort (ca. 2 cm) og monter zebrafisk med hovedet orienteret mod stemplet spids. Ligeledes agarose cylinder ekstruderes fra capillAry bør holdes så kort som muligt. Disse foranstaltninger skal sikre stabiliteten af prøven gennem hele filmen. Samtidig skal agarose kolonnen være lang nok til, at glasset kapillær selv ikke når ind i strålegangen, da dette ville medføre store brydning og refleksion.
Den indledende drift af prøven skyldes ændringerne i selve agarose cylinder volumen. Glidning af stemplet er ikke årsagen til den. Derfor hjælper det ikke at fastsætte stemplet med modellervoks eller neglelak. Embryonet kan ændre sin position under filmen på grund af sin naturlige vækst også. Det er derfor tilrådeligt at centrere området af interesse i midten af synsfeltet og holde nogle plads ved kanterne til at rumme disse bevægelser.
Reduceret mængde indlejring medium i lysvejen
Orientering prøven korrekt bidrager til at opnå den bedst mulige billedkvalitet 15. Generally, bør excitation og emission lys rejser gennem så lidt væv og montering medier som muligt. Den optimale løsning er agarose-fri montering. Dette blev opnået for eksempel i en opsætning af Arabidopsis lateral root billeddannelse 14, hvori hovedroden var monteret i phytagel og de laterale rødder blev efterfølgende lade vokse ud af gelen kolonnen fuldstændigt. Agarose-fri montering blev også udviklet til afbildning af det komplette embryogenese af Tribolium beetle over to dage 12. Billedkvalitet forbedring var ikke en primær motivation i denne sag. Tribolium embryoner simpelthen ikke overleve inde i agarose længe nok. En absolut indlejring medie-fri montering ikke er opnået for langsigtet billeddannelse i zebrafisk. Alligevel kan vi drage fordel af det faktum, at når agarose størkner, er de fleste embryoer anbragt diagonalt i kapillaret med det ene øje ligger dybt i agarose og andet øje bliver tæt på overfladen af indlejring kolonnen. Than øje tættere på overfladen giver overlegen billedkvalitet og bør derfor afbildes fortrinsvis.
Agarose koncentration og langsigtet imaging
Koncentrationen af agarose til montering er et kompromis mellem stabilitet af prøven og den mulighed for at rumme væksten af embryonet og diffusion af oxygen til det. Der er ingen ekstra gevinst i stabiliteten af prøven ved brug af agarose koncentrationer højere end 1%. Som udgangspunkt for optimering forsøgene anbefaler vi 0,6% agarose, som også er egnet for embryoner yngre end 24 HPF, der er for fine til at blive monteret i 1% agarose. For at bedøve ældre embryoner og larver, kan MS-222-koncentration hæves til 200 pg / ml uden bivirkninger 13.
I tilfælde udvikle embryoner afbildet i mere end ± 12 timer, agarose montering ikke anbefales, da det begrænser væksten af fosteret og causes hale deformation. Dette problem blev løst for zebrafisk ved at montere embryoner i FEP polymer rør med brydningsindeks lig vands 13,39. Musefostre, på den anden side, kan immobiliseres i hule agarose cylindre 40 eller i huller af en akryl stang fastgjort til en sprøjte 41. FEP rør montering ikke anbefales som standard metode selv, fordi væggen af røret bryder lyset lidt mere end agarose.
Lys ark alignment
For god billedkvalitet er det vigtigt at udføre den automatiske lys ark opretning før hvert forsøg. Især hvis zoom-indstillinger blev ændret, blev de mål taget ud, eller en anden væske blev anvendt i kammeret.
Belysning
Den drejelige scanning af lyset arket skal altid være aktiveret. For store spredning prøver, er det nødvendigt at anvende den dobbelte dobbeltsidet belysning med online fusion at opnå ensartet belysning tværs af synsfeltet. Dobbelt sidet belysning mindsker også et specifikt problem i øjet billedbehandling, som er brydning af det indkommende lys ark ved linsen af embryoet. Mindre, mindre spredning prøver effektivt kan filmede med enkeltsidet belysning, hvilket forkorter imaging tid til det halve, og kan resultere i lidt bedre billedkvalitet i forhold til dobbelt sidet belysning. Dette skyldes de lette veje for de to belysning arme er altid forskellige og mere effektiv one kan vælges. Derudover to lette plader fra hver side er aldrig perfekt i et plan, der forårsager mild sløring efter fusionen. For meget hurtige intracellulære begivenheder, ligesom de voksende mikrotubuli (Film 2), den dobbelte dobbeltsidet belysning er ikke hensigtsmæssigt, da billederne med belysning fra venstre og højre er erhvervet sekventielt, hvilket kan resultere i motion blur.
fotoblegningog fototoksicitet
Mindre fluorofor fotoblegning nævnes ofte som en stor fordel ved LSFM. Vi vil hævde, at målet bør være nogen fotoblegning overhovedet. Hvis der er mærkbar fotoblegning i live-imaging eksperiment, prøven er sikkert allerede ud af dets fysiologiske område af tolereret laser eksponering. Når billeddannelse de zebrafisk embryoner i spinding skive mikroskop, vores erfaring, kan høj fototoksicitet stall embryo udvikling endnu før de fluorescerende signal blegemidler markant. Derfor bør indstillingerne for imaging i LSFM indstilles således, at der observeres lille eller ingen fotoblegning. Selvom LSFM er blid til prøven, er det klogt at bruge kun så meget lasereffekt og eksponeringstid efter behov for at opnå et signal til støj-forhold tilstrækkeligt til den efterfølgende analyse af data.
Z-stack, tidsintervaller og data størrelse
De filer genereret af LSFM er normalt meget store; undertiden i terabyte rækkevidde. Det er ofte nødvendigt at foretage et kompromis mellem billedkvalitet og data størrelse. Dette er især tilfældet for z afstand af stakke og intervaller i købene time-lapse. At definere z intervaller, bør ideelt set anvendes Optimal knap i fanen Z-stack værktøj, især hvis datasættet vil blive udfoldede senere. Den beregner afstanden for at opnå 50% overlap mellem nabolande optiske skiver. Stadig, noget større z intervaller er sædvanligvis acceptable. De reducerer den nødvendige tid til at erhverve z stakken samt den endelige filstørrelse. Den optimale tid prøveudtagning afhænger processen af interesse. For den samlede øje udvikling 5-10 min intervaller er normalt acceptable. Hvis nogle strukturer skal automatisk spores, skal de efterfølgende tidspunkter være tilstrækkelig stor.
fluorescerende kugler
Fluorescerende perler tjener primært som referencemærker markører til registrering forskellige visningeraf en multiview datasæt på hinanden. vortexes altid perle løsninger grundigt før brug. Opvarm ikke perlerne, da dette kan føre til tab af det fluorescerende farvestof. Den optimale perle koncentration for multiview registrering skal bestemmes eksperimentelt. Den beskrevne plugin virker bedst med omkring 1000 fundne perler hele hver visning. Større (500 nm eller 1000 nm) perler detekteres mere robust end mindre (mindre end 500 nm) perler. Dette skyldes større perler er lysere og er lettere at segment uden falske positive påvisninger af strukturer i prøven. Ulempen ved de større perler er, at de er meget fremtrædende i den endelige smeltet og udfoldede billede. For hver ny fluorescerende markør, en passende perlestørrelse og fluorescensemission skal optimeres. For at give et eksempel på prøve fra figur 5 og Movie 3, 100 nm grøn emission perler gav alt for mange falske positive opdagelser i membranen-GFP kanal, men 1000 nm rød emission perler blev robust detekteret i H2B-RFP kanal med meget få positive detektioner inde i prøven. Hvis perlen registreringen mislykkes i kanalen med den fluorescerende markør, kan en separat kanal kun indeholder perler erhverves, men dette er ikke særlig praktisk. De sub-opløsning mellemstore perler giver en direkte udlæsning af punktspredningsfunktionen (PSF) af mikroskopet, der kan bruges til udfoldning (Figur 2C-D). Hvis registreringen og fusion fungerer bedre med større perler (f.eks 1000 nm), kan et separat billede af PSF erhverves med sub-opløsning, fx 100 nm perler. Brug flerfarvet perler er nyttige under registrering af multikanal erhvervelse og for at kontrollere, at kanalerne overlay perfekt.
Tilsætning af fluorescerende perler er ikke nødvendigt, når billeddannelse fra en enkelt visning uden efterfølgende MultiView registrering og fusion. Men selv i de tilfælde perler kan være nyttig under initial lyset ark justering for at kontrollere for kvaliteten af lyset ark og generelt at afsløre optiske aberrationer. Sådanne optiske aberrationer kan stamme fra forskellige kilder som beskadigede eller snavsede mål, beskidte vinduer i kammeret eller inhomogenitet i agarose. Perler kan også anvendes til drift korrektion med multiview registrering Fiji plugin 20.
Multiview
For multiview genopbygning formål, er det bedre at erhverve et ulige antal visninger 3, 5 og så videre, der ikke modsatrettede hinanden. Dette forbedrer udfoldning da vævede afbildes fra forskellige retninger. Det er også vigtigt at bekræfte ved begyndelsen af tidsforløbet erhvervelse, at der er tilstrækkelig overlapning mellem de synspunkter. Dette gøres bedst empirisk, dvs. umiddelbart bekræfter, at synspunkter i det første tidspunkt held kan registreres. Når målet for erhvervelsen multiview er at øge opløsningenaf et billede på en stor scattering prøve, er det ikke tilrådeligt at billedet hele prøven i hver visning, men at stoppe omkring midten af prøven, hvor signalet forringes. Købet lav kvalitet fra anden halvdel af prøven vil ikke tilføje nyttige oplysninger til genopbygningen multiview.
2. Kritiske trin og fejlmelding af databehandlingen
I øjeblikket findes der flere muligheder for behandling i Multiview data fra en lys plade mikroskop, der er veldokumenterede og relativt let at træffe. Vi bruger multiview genopbygning ansøgning, som er et open source-software implementeret i Fiji 32 (Stephan Preibisch upubliceret, Link 1a og Link1b i Listen over Materials). Dette plugin er en stor redesign af den tidligere SPIM registrering plugin 20, revideretaf Schmied et al. 42, integrere BigDataViewer og XML og HDF5 format 33 med SPIM registrering arbejdsgang (figur 1B, Link 2 , Link 3 ). Dette program kan også tilpasses til high performance computing klynge, som i væsentlig grad fremskynder behandlingen 43. Denne applikation multiview registrering aktivt videreudvikles og holder bedre. I tilfælde af problemer eller funktioner anmodninger om den beskrevne software, skal du indsende spørgsmål på de respektive GitHub sider ( Link 4 for Multiview Genopbygning og Link 5 for BigDataViewer).
Den anden mulighed er at bruge den kommercielle software til rådighed sammen med mikroskopet. Denne løsning fungerer godt og beskæftiger det samme princip om anvendelse af fluorescerende perler til at registrere de forskellige synspunkter. Men mangler, det mulighed for at visualisere hele datasæt hurtigt ligesom med BigDataViewer. Også softwaren ikke kan tilpasses til klyngen og endvidere de behandlinger blokerer mikroskop for andre brugere, medmindre ekstra licens til softwaren er købt.
Den tredje mulighed, som også er en open source-software, blev for nylig offentliggjort af Keller lab 44 og giver en omfattende ramme for behandling og nedstrøms analyse af lyset datablad. Denne software anvender information fra i prøven til at udføre multiview fusion, derfor ikke kræver tilstedeværelse af fluorescerende perler rundt prøven. Men på samme tid, det forudsætter ortogonal orientering af de billeddannende visninger (mål), så det kan ikke bruges til data indhentet fra vilkårlige vinkler 44.
krav Hardware
ntent "> Den hardware, der anvendes til forarbejdning kan findes i tabel 4. Der skal være tilstrækkelig lagerkapacitet og en klar rørledning til databehandling rådighed, før det faktiske eksperiment. Erhvervelse af billederne er hurtigere end efterfølgende analyse og det er let at få oversvømmet med uforarbejdede data. Det er ofte urealistisk at gemme alle de rå billeder, men snarere en beskåret udgave eller forarbejdede billeder som fusionerede visninger, maksimale projektioner intensitet eller kugleformede fremspring 45.Processor | To Intel Xeon Processor E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / sek) |
Hukommelse | 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM |
Harddisk | 4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7.200 rpm) Hard Drive |
HDD Controller | PERC H310 SATA / SAS Concontroller til Dell Precision |
HDD-konfiguration | C1 SATA 3.5 tommer, 1-4 harddiske |
Grafik | Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kort m / 2 DP og 1 DVI-I hver) (2 DP-DVI & 2 DVI-VGA adapter) (MRGA17H) |
Netværk | Intel X520-T2 Dual Port 10 GbE Network Interface Card |
Tabel 4: Hardwarekrav.
Databehandling hastighed
Den nødvendige til databehandling afhænger dimensionerne af og om den anvendte hardware. I tabel 1, giver vi et overblik over den tid, der kræves til de vigtigste skridt i behandlingen af et eksempel 8,6 GB multiview datasæt, der bestod af en tidspunkt med 4 visninger og 2 kanaler.
Behandling sTEP | Tid | protokol trin |
Gem som HDF5 | 6 min 30 sek | 6.3 |
Detect Renter Points | 20 sek | 6.4 |
Registrer bruger interesse punkter | 3 sek | 6.5 |
Content-baserede MultiView fusion | 4 timer | 7.2 |
Multiview udfoldning (CPU) | 8 timer | 7.3 |
Multiview udfoldning (GPU) | 2 timer | 7.3 |
Tabel 1: Data Processing Time.
Input dataformater til MultiView genopbygning
Den Fiji Plugin Multiview Genopbygning kan støtte .czi, .tif og ome.tiff formater. På grund af datastrukturen af .czi format, diskontinuerlige datasæt er ikkeunderstøttet uden forbehandling. Usammenhængende betyder, at optagelsen skulle genstartes (f.eks at justere positionerne på grund glide af prøven). I dette tilfælde skal gemmes igen som .tif de .czi filer. For .tif filer hver visning og belysning retning skal gemmes som en separat fil.
Kalibrering af pixelstørrelse
Mikroskopet-drift software beregner kalibreringen for xy pixelstørrelse baseret på det valgte mål. Imidlertid er pixelstørrelsen i z defineres selvstændigt i trinstørrelsen. Hvis en forkert mål er angivet i softwaren xy til z-forholdet er forkert, og registreringen vil mislykkes.
Første registrering
Efter at have defineret datasættet antallet af registreringer vil være 1, og antallet af relevante punkter vil være 0 i ViewSetup Explorer. Den første registrering repræsenterer kalibrering af datasættet. Både antallet of registreringer og interesse punkter vil stige under behandlingen.
Ned prøvetagning til påvisning af interesse punkter
Brug ned prøvetagning anbefales, da læsning af filerne og segmenteringen vil være meget hurtigere. Det er dog vigtigt at bemærke, at detektionsparametre vil ændre sig afhængigt af ned prøvetagning, således at overføre indstillinger afsløring mellem forskellige ned prøve indstillinger er ikke mulig.
Påvisning af interesse punkter
Det er tilrådeligt at segmentere så mange sande perler som muligt i hver visning, selv på prisen for at opnå nogle falske positive opdagelser, fordi de ikke hindrer registreringen betydeligt. Falske opdagelser, hvis få i antal, er udelukket under registreringen (se Registrering af interesse punkter). Men udgøre et problem for algoritmen massive falske positive opdagelser. Det reducerer ikke kun ydeevne til påvisning ogregistreringen, da det tager meget længere tid at segmentere billede samt sammenligne disse perler mellem de synspunkter, men det reducerer også nøjagtigheden af registreringen. Dette kan løses ved hjælp af strengere detektionsparametre. Derudover løbet segmentering af perlerne (dvs. flere detektioner på en perle Figur 1E) er til skade for registrering og bør undgås.
Registrering af interesse punkter
For at registrere visninger på hinanden, er placeringen af hver perle i hver visning beskrives af sin position i forhold til sine tre nærmeste nabolande perler. Disse konstellationer danner en lokal geometrisk deskriptor og tillader at sammenligne hver perle mellem visningerne. Perler med matchende deskriptor mellem to visninger derefter betragtes som kandidat korrespondancer. Bemærk at dette virker kun for tilfældigt fordelte perler, for hvilke lokale deskriptorer typisk unik for hver perle.Man kan bruge andre strukturer såsom kerner i prøven til registrering. Men for at opdage kerner, som er fordelt ikke tilfældigt i prøven, andre metoder gælder, 20,21.
Kandidat- korrespondancer testes derefter mod RANSAC 36 for at udelukke falske positive. Hver korrespondance antyder en transformation model for overlejre udsigt til hinanden. Sande korrespondancer ville sandsynligvis enige om én transformation model, mens outliers ville hvert punkt til et andet. De sande korrespondancer anvendes derefter til at beregne en affin transformation model mellem de to sammenlignede visninger. En global optimering med en iterativ optimering algoritme udføres derefter, hvorunder alle visningerne er registreret på den første visning med henblik på minimal forskydning mellem visningerne 20,21.
registrering Time-lapse
Grundet flytteling af agarose og upræcise motor bevægelse af objektbordet, positionen af hver stabel varierer moderat over tid. Ud fra følgende betragtninger registreringen af det enkelte tidspunkt fjerner forskellen mellem de synspunkter, dette tidspunkt, den time-lapse skal også være registreret som en helhed. Til dette formål er hvert enkelt tidspunkt registreret på henvisningen tidspunkt.
Henvisning tidspunkt
Hvis en tidsserie med mange tidspunkter er behandlet, er en repræsentativ tidspunkt valgt som reference sædvanligvis fra midten af tidsserier eftersom perle intensiteter kan nedbrydes med tiden på grund af blegning. På denne reference, kan bestemmes parametrene for renter punkt afsløring, registrering, afgrænsningsrammen og fusion. Disse parametre er derefter anvendt på hele tidsforløbet at beregne en specifik transformation model for hver enkelt tidspunkt. Under time-lapse registrering er også REGIST alle andre tidspunkterob- rumligt på denne reference tidspunkt. Således afgrænsningsrammen parametre for hele optagelsen er afhængigt af denne specifikke tidspunkt.
Multichannel registrering
Når billeddannelse flere kanaler, ideelt samme fluorescerende perler skal være synlig i alle afbildede kanaler. Detekteringen og registrering kan derefter udføres på hver kanal individuelt, som tager højde for indflydelsen af de forskellige lysbølgelængder på transformation. Ofte er dette ikke muligt, fordi perlerne er ikke synlige i alle kanaler eller perlerne dominerer billedet for meget i den ene kanal og er for svagt i den anden kanal (er). Den typiske løsning er at bruge perler synlige kun i én kanal til påvisning og registrering og den erhvervede transformation model (dvs. efter afsløring, registrering og time-lapse registrering) anvendes derefter på de andre kanaler, som Fiji> Plugins> Multiview Reconstruction> Batch Processing> Værktøj> Identiske Transformations. I drop down menuen for Påfør transformation af vælge en kanal til andre kanaler. I det følgende vindue vælge XML og klik OK. Vælg derefter den kanal, der indeholder perlerne som Kilde kanal og som Target kanal vælge den kanal (er) uden perler. For Duplicate som transformationer bruger Udskift alle transformationer og tryk på OK. De transformationer derefter kopieres til alle andre kanaler og gemmes i XML. For at se de nye forandringer i ViewSetup Explorer, skal du genstarte MultiView Genopbygning Application.
afgrænsningsramme
Sammensmeltningen af flere visninger er beregningsmæssigt meget intensiv. Imidlertid er store billeder typisk erhvervet til at rumme ikke kun prøvematerialet, men også perlerne omkring det. Når parameter registreringens ekstraheres fra perlerne, de ikke længere anvendelige som en del af billedet. Derfor, for at øge effektiviteten af fusionen, kun de dele af billedet stakke indeholdende prøven smeltes sammen. En region af interesse (afgrænser boks) bør defineres til at indeholde prøven og så lidt af det omgivende agarose som muligt. For eksempel i figur 2 et vægtet gennemsnit fusion på hele volumen med 2229 × 2136 × 2106 px ville kræve 38,196 MB RAM, mens volumen med en afgrænsningsramme er reduceret til 1634 × 1746 × 1632 px og krav til hukommelse reduceres til 17.729 MB.
Content-baserede MultiView fusion
Udfordringen i at fusionere multiview data er, at de synspunkter som regel ender brat og ikke indeholder det samme billede kvalitet for de samme voxels. Enkel gennemsnitsberegning af de synspunkter vil derfor føre til blanding artefakter og unødvendig billede nedbrydning. Content-baserede multiview fu nen tager begge disse problemer i betragtning. For det første blander de forskellige synspunkter, hvor et billede ender og den anden begynder, og det andet, det vurderer den lokale billedkvalitet og anvender højere vægte højere billedkvalitet i fusion 21. Sammenlignet med en enkelt visning der en forbedring af opløsningen i z med en svag forringelse af signalet i xy (Figur 2E-H, figur 5A-D).
Multiview udfoldning
Multiview udfoldning er en anden tilgang til at opnå fusion af de synspunkter. Med denne metode er taget også vævede de forskellige synspunkter i betragtning med henblik på at genvinde det billede, der er blevet foldet af optikken i mikroskop. Denne metode drastisk forbedrer billedkvaliteten ved at fjerne billedsløring og stigende opløsning og kontrast af signalet 31 (Figur 2C-D, figur 2I-J, figur 5E-G, Movie 3).
ve_content "> Dekonvolution er beregningsmæssigt meget intensiv (se tabel 1), og dermed bruge en GPU til forarbejdning øger hastigheden af denne proces. Det kan også være nødvendigt at udføre udfoldning på ned samplede data. Til ned prøve, bruge Fiji> Multiview Genopbygning > Batch Processing> Værktøj> Anvend Transformations. Dette vil anvende en ny transformation model på de synspunkter, der vil blive gemt i .xml-fil.HDF5 filformat til BigDataViewer og BigDataServer
Den BigDataViewer 33 giver let visualisering af terabyte-størrelse data. Sådan styrer BigDataViewer er opsummeret i tabel 2. En screencast af den grundlæggende betjening af programmet er også tilgængelig som et supplement i sin oprindelige publikation 33. Den BigDataViewer er centreret om en .xml-fil, der indeholder metadata, og en hdf5 fil, der indeholder billeddata. De billeddata er present i hdf5 i flere opløsning niveauer i 3D-blokke. De mange opløsning niveauer giver mulighed for at visualisere data hurtigere med lavere opløsning, før den fulde opløsning er indlæst. Individuelle blokke kun indlæses i hukommelsen efter behov. , Hdf5 billede format giver således direkte og hurtig visualisering af data via BigDataViewer 33. Det også fremskynder behandlingen, da læsningen af filerne udføres mere effektivt. Derfor anbefaler vi resaving datasættet ind i dette format, selv om det ikke er strengt nødvendigt for behandlingen. For yderligere forklaring af dataformatet henvises til Link 3 . Derudover kan de datasæt deles med samarbejdspartnere eller offentligheden ved hjælp af BigDataServer 33 ( Link 6 ).
nøgle | <td> effekt|
F1 | viser Hjælp med en kort beskrivelse af BigDataViewer og dens grundlæggende betjening |
<> Eller musehjulet | bevægelse i z |
op og pil ned | zoome ind og ud |
højreklik og træk | bevæger prøve i fremviseren |
venstre klik og træk | roterer prøve omkring markøren |
skyderen i bunden af beskueren eller Tab og venstre eller højre pil | bevæger sig på tidsaksen |
derudover trykke shift | hurtigere bevægelse eller rotation langs enhver akse |
x og derefter venstre og højre pil | roterer omkring x-aksen |
y og derefter til venstre og højre pil | roterer omkring y-aksen |
z og derefter til venstre og højre pil | roterer omkring z-aksen |
skift og x | orienterer langs x-aksen |
skift og y | orienterer langs y-aksen |
skift og z | orienterer langs z-aksen |
jeg | skifter mellem de forskellige interpolation tilstande (dvs. nærmeste nabo og trilineære) |
s eller Indstillinger> Lysstyrke og kontrast | ændrer farven af kanaler, lysstyrke og kontrast |
F6 eller Indstillinger> Synlighed og gruppering | ændrer de viste grupper, gør det muligt for gruppering til overlejring forskellige grupper og kalder grupperne via taltasterne |
F10 eller Værktøjer> Record Movie | erhverver en tidsserie af den aktuelt viste skive |
Tabel 2: Big data Viewer.
3. Begrænsninger af den beskrevne implementering af LSFM
lav gennemløb
I et typisk LSFM eksperiment kun én prøve pr eksperiment afbildes. Stadig, i vores erfaring, en masse nyttige oplysninger kan uddrages af den enkelt prøve. Høj overførselshastighed billeddannelse af flere fostre er for nylig blevet opnået i hjemmet bygget LSFM opsætninger 46-48, selvom typisk på bekostning af frihed prøve positionering og rotation.
Utilstrækkelig penetration dybt ind i væv
Selvom zebrafisk embryoner er gennemsigtige, er det opnåede billedkvalitet forværres hurtigt, når afbildning dybere i vævet på grund af spredning og absorption. Delvist dette er en effekt af spredning og absorption af den udsendte fluorescens af prøven og kan ikke korrigeres i den aktuelle opsætning. En anden kilde til den ujævne billedkvaliteten er den uregelmæssige belysning. Than lys ark er indfaldende fra venstre eller højre side og eventuelle genstande i sin vej bryder det, hvilket resulterer i stribe artefakter og sløring. Den dobbelte sidet belysning og multiview fusion kan mindske artefakter i det endelige billede. Endelig billedkvaliteten tendens til at være lidt dårligere mod randen af synsfeltet som følge af den naturlige geometri lyspladen, som bliver tykkere mod kanterne.
Begrænset kemisk manipulation
Brugen af narkotika eller inhibitorer er udbredt i zebrafisk forskning. I denne mikroskop brug af stoffer er begrænset på grund af den store volumen af prøvekammeret og overvejelser af andre brugere af instrumentet, der deler den samme kammer. Brug af en ekstra kammer dedikeret til narkotika eksperimenter kan løse dette problem. Fyldning af kammeret delvist med glasperler reducerer det væskevolumen, der kræves.
ingen billedmanipulation
Currently er der ingen mulighed for lokaliseret optisk manipulation ligesom fotokonvertering eller laserablation i dette mikroskop. Ikke desto mindre kan hjemme bygget opsætninger anvendes til sådanne specifikke applikationer.
4. Betydning og fremtidige applikationer
LSFM er den bedste metode til rådighed til dato for hurtig billeddannelse af store mængder af levende embryoer. De fleste af eksperimenterne tænkelige på et konfokalt mikroskop kan også udføres på en lys ark mikroskop med nævnte fordele. I tilfælde af billeddannelse af øjet udvikling, hastigheden af LSFM er ikke den afgørende parameter. I stedet den lave fototoksicitet og fleksibilitet i prøven positionering er de afgørende fordele.
De LSFM data har en høj SNR, som hjælper med at opnå gode udfoldning resultater og er også gavnligt for automatiseret billedanalyse og objekt tracking. Afslutningsvis LSFM er et fantastisk værktøj til at generere kvantificerbare data på fosterudviklingen og Overall celle og væv egenskaber til efterfølgende modellering og fysiske beskrivelser af processerne pågældende.
The authors have nothing to disclose.
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
Links | |||
Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |