Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Morphogenesis प्रक्रिया है कि भ्रूण को आकार और एक साथ वृद्धि और भेदभाव के साथ एक परिपक्व बहुकोशिकीय जीव में एक निषेचित अंडे से ontogeny ड्राइव है। पशु विकास के दौरान morphogenetic प्रक्रियाओं बरकरार रहने वाले नमूनों 1-3 की इमेजिंग द्वारा सबसे अच्छा विश्लेषण किया जा सकता है। इसका कारण यह है इस तरह पूरे भ्रूण इमेजिंग सभी घटक है कि ड्राइव और संकेतन अणुओं की ढ़ाल, बाह्य मैट्रिक्स, वाहिका, तंत्रिका वितरण के साथ ही आसपास के ऊतकों के यांत्रिक गुणों सहित विकास को विनियमित को बरकरार रखता है। तराजू, जिस पर morphogenesis होता है पाटने के लिए, तेजी से subcellular घटनाओं घंटे या दिनों में पूरे ऊतक के विकास के संदर्भ में एक मिनट के समय के पैमाने पर कब्जा कर लिया जाना है। इन सभी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, orthogonal विमान रोशनी माइक्रोस्कोप 5 का एक आधुनिक कार्यान्वयन 4 विकसित किया गया था। मूल रूप से, यह चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआई नामित किया गया थाएम) 4; अब एक सब को गले लगाते अवधि प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) आम तौर पर प्रयोग किया जाता है। जबकि लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी 6.7 की तुलना में कम phototoxicity उत्प्रेरण LSFM उच्च समय संकल्प पर इमेजिंग सक्षम बनाता है। आजकल, वहाँ पहले से ही बुनियादी प्रकाश शीट रोशनी सिद्धांत के कई कार्यान्वयन कर रहे हैं और यह छवि के नमूनों और प्रक्रियाओं को पहले से शोधकर्ताओं ने 8-11 के लिए दुर्गम की एक विशाल विविधता के लिए इस्तेमाल किया गया है।
हम पहले पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण पर LSFM के कई महत्वपूर्ण लाभ उजागर करना चाहते हैं:
लाइव इमेजिंग सूक्ष्म प्रयोगों से सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि अवलोकन केवल न्यूनतम नमूना प्रभावित करता है। हालांकि, zebrafish सहित कई जीवों बहुत लेजर प्रकाश जोखिम के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, phototoxicity एफई के बिना उच्च समय संकल्प के साथ एक confocal खुर्दबीन में यह उन्हें छवि के लिए चुनौतीपूर्ण बनाठप या देरी विकास 6.7 तरह fects। LSFM वर्तमान नमूना 7 पर कम से कम विघटनकारी प्रभाव के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक है। चूंकि पतली लेजर प्रकाश चादर नमूना है कि एक विशेष समय बिंदु पर imaged है का ही हिस्सा illuminates, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप बहुत कुशलता फोटॉनों का उपयोग कर रहा है। नतीजतन, कम प्रकाश जोखिम स्वस्थ नमूनों की लंबी समय चूक टिप्पणियों, जैसे 12-17 के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, LSFM की न्यूनतम invasiveness के लिए धन्यवाद, अधिग्रहीत छवियों की संख्या अब कोई कितना प्रकाश नमूना बर्दाश्त कर सकते हैं, बल्कि द्वारा कितना डेटा संसाधित और संग्रहित किया जा सकता निर्धारित होता है।
निकट शारीरिक स्थितियों में रखने का नमूना ही लाइनों के साथ, LSFM विकल्प नमूना बढ़ते रणनीतियों अच्छी तरह से जीने के लिए अनुकूल भ्रूण के साथ आता है। LSFM तकनीक में, भ्रूण आम तौर पर कम प्रतिशत agarose की एक पतली स्तंभ के भीतर एम्बेडेड रहे हैं। mountinagarose सिलेंडरों में जी रोटेशन की पूर्ण स्वतंत्रता के लिए अनुमति देता है, तो नमूना सही कोण से देखा जा सकता है और साथ ही साथ कई दृश्य से (में LSFM दृश्य के रूप में करने के लिए कहा गया है)। MultiView इमेजिंग और बाद MultiView संलयन बड़े, बिखरने नमूनों के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है और उन्हें उच्च, isotropic संकल्प के साथ कब्जा करने की अनुमति देता है। अन्य संभावित LSFM बढ़ते रणनीतियों का एक सारांश अधिकारी माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग मैनुअल में पाया जा सकता है, नमूना तैयार ई रेनौड की प्रयोगशाला द्वारा लिखित पर अध्याय में। यह एक सिफारिश पढ़ा है, लक्ष्य की तुलना में यहाँ वर्णित छवि अलग नमूने लिए है, खासकर अगर।
LSFM में छवि अधिग्रहण के रूप में लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के लिए विरोध के व्यापक क्षेत्र है, कैमरा आधारित है। यह एक उच्च संकेत से प्राप्त कर लिया छवियों के लिए शोर अनुपात (SNR) में यह परिणाम है और बहुत तेजी से हो सकता है (फ्रेम प्रति सेकंड की सैकड़ों करने के लिए दसियों) कर सकते हैं। LSFM की उच्च संवेदनशीलता आगे कमजोर फ्लोरोसेंट samp की इमेजिंग सक्षम बनाता हैलेस, अंतर्जात स्तर 18 या निकट भविष्य में कम से व्यक्त प्रतिलेखन कारक की तरह, अंतर्जात प्रोटीन CRISPR का उपयोग कर / Cas9 चिह्नित। उच्च SNR भी सफल नीचे की ओर छवि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। उच्च गति न केवल तेजी से intracellular प्रक्रियाओं पर कब्जा करने की आवश्यकता है, लेकिन यह भी छवि के लिए काफी तेजी से कई विचार से पूरे भ्रूण। कई बार देखा की एक सहज संलयन ही प्राप्त किया जा सकता है, तो मनाया घटना अलग विचारों से आ रही इन कई जेड के ढेर के अधिग्रहण के दौरान बदल नहीं है।
LSFM के फायदे के लिए आम तौर पर छवि गुणवत्ता की कीमत पर नहीं आते हैं। LSFM के पार्श्व संकल्प एक confocal खुर्दबीन के संकल्प की तुलना में थोड़ा भी बदतर है। इसका कारण यह है पता लगाने LSFM में इस्तेमाल उद्देश्यों को कम संख्यात्मक एपर्चर (आमतौर पर 1.0 या उससे कम) मानक confocal setups पर पानी या सिलिकॉन विसर्जन उद्देश्यों के 1.2-1.3 की तुलना की है। इसके अतिरिक्त, LSFM में विस्तृत क्षेत्र का पता लगाने (के कारण Absenएक पिनहोल के सीई), वहाँ एक confocal खुर्दबीन की तुलना में और अधिक जानकारी का ध्यान केंद्रित प्रकाश है। बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश की मात्रा प्रकाश शीट मोटाई से निर्धारित होता है। फिर भी, इन नुकसान LSFM में उच्च SNR द्वारा मुआवजा दिया जाता है। अभ्यास में, इस उदाहरण के लिए डिस्क confocal अधिग्रहण 15 कताई की तुलना में समान गुणवत्ता छवियों में यह परिणाम है। नतीजतन, इस कोशिका झिल्ली या नाभिक, जैसे जैसी सुविधाओं के विश्वसनीय निकासी के लिए सक्षम बनाता है, सेल वंश अनुरेखण 15,19 के लिए।
LSFM का अक्षीय संकल्प का पता लगाने के उद्देश्य के अलावा निर्धारित किया जाता है, प्रकाश शीट मोटाई से। कुछ मामलों में LSFM कर सकते हैं का अक्षीय संकल्प confocal सूक्ष्मदर्शी के संकल्प को पार। सबसे पहले, संकल्प में सुधार आता है, जब प्रकाश शीट का पता लगाने के उद्देश्य है, जो आम तौर पर बड़े एक कम बढ़ाई उद्देश्य के साथ imaged नमूनों के लिए होता है की अक्षीय संकल्प की तुलना में पतली है। दूसरा तरीका, कैसे LSFM ach कर सकते हैंबेहतर अक्षीय संकल्प ieve, MultiView संलयन, जिसमें अलग अलग विचार से उच्च XY संकल्प जानकारी एक छवि ढेर में संयुक्त है। जिसके परिणामस्वरूप विलय कर दिया ढेर एक isotropic संकल्प पार्श्व दिशा 20,21 में संकल्प के मूल्यों के करीब पहुंच गया है। इस आलेख में वर्णित एक दूसरे पर कई विचार पंजीकरण के लिए रणनीति नमूना 20,21 के आसपास agarose में एम्बेडेड प्रत्ययी मार्कर के रूप में फ्लोरोसेंट polystyrene मोती के प्रयोग पर आधारित है।
LSFM व्यावसायीकरण का एक परिणाम के रूप में, इस तकनीक अब वैज्ञानिकों ने 22 वर्ष की एक व्यापक समुदाय के लिए उपलब्ध है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल लिखने के लिए प्रेरणा इस प्रौद्योगिकी LSFM में व्यावहारिक अनुभव की कमी विकासात्मक जीव के लिए सुलभ बनाने के लिए और इन वैज्ञानिकों ने अपने नमूनों के साथ इस तकनीक का उपयोग शुरू कर दिया है। हमारी प्रोटोकॉल वाणिज्यिक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप, जो एक धारणात्मक साधारण माइक्रोस्कोप टी गठन का उपयोग करता हैटोपी संचालित करने के लिए आसान है। हम इसके अतिरिक्त घर में निर्मित LSFM setups, जो विशेष रूप से सवाल जवाब करने के लिए 23-25 उपयुक्त हो सकता है के साथ zebrafish इमेजिंग के लिए अन्य हाल प्रोटोकॉल का उल्लेख करना चाहूंगा। LSFM के लिए एक और प्रविष्टि विकल्प खुले प्लेटफार्म 26,27, जो एक व्यापक समुदाय के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी लाने के लिए खुला पहुँच सिद्धांतों का उपयोग कर रहे हैं। हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर दोनों पहलुओं के दस्तावेज http://openspim.org और https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ पर पाया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम LSFM के साथ विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में teleost zebrafish का उपयोग करें। zebrafish आँख की Morphogenesis एक उदाहरण है कि LSFM के लाभ के कई रेखांकित करता है। LSFM पहले से ही medaka 28 में और zebrafish 29,30 में आंख विकास की जांच करने के लिए अतीत में इस्तेमाल किया गया है। आंख के विकास के प्रारंभिक चरण में यह पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के लिए सही ढंग से भ्रूण ग्रहण करने के लिए जटिल है,भारी जर्दी के रूप में भ्रूण अपनी आंख उद्देश्य का सामना करना पड़ के साथ कंधे पर झूठ बोलने के लिए अनुमति नहीं है। हालांकि, LSFM एक agarose स्तंभ में बढ़ते के साथ, नमूना reproducibly तैनात किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ऑप्टिक कप चरण के लिए ऑप्टिक पुटिका से संक्रमण के दौरान, आंख प्रमुख मॉर्फ़ोजेनेटिक विकास है, जो एक बड़ी Z ढेर और देखने का एक बड़ा क्षेत्र पर कब्जा करने की आवश्यकता के साथ rearrangements आए। इसके अलावा इन चुनौतियों के लिए LSFM पारंपरिक confocal इमेजिंग के लिए बेहतर है। ऑप्टिक कप गठन की प्रक्रिया तीन आयामी है, इसलिए यह समझना और एक दृश्य से इमेजिंग द्वारा पूरी तरह कल्पना करना मुश्किल है। इस isotropic संकल्प के साथ MultiView इमेजिंग फायदेमंद बनाता है। ऑप्टिक कप गठन के बाद, रेटिना तेजी से लेजर जोखिम के प्रति संवेदनशील हो जाता है। इस प्रकार, कम LSFM के साथ जुड़े phototoxicity लंबी अवधि इमेजिंग के लिए एक बड़ा फायदा है।
यहाँ हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल एक से तीन दिन की इमेजिंग के लिए पुराने zebrafish एक भ्रूण पेशआंख के विकास पर ध्यान देने के साथ एन डी लार्वा। हमारे विधि समय चूक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ 12-14 मानव संसाधन तक को कवर फिल्मों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, हम भी, डाटा प्रोसेसिंग, जो LSFM में एक आवश्यक कदम है के लिए एक पाइप लाइन दिखाने के रूप में इस तकनीक को सदा ही, बड़े डेटासेट उत्पन्न अक्सर टेराबाइट रेंज में।
1. महत्वपूर्ण कदम और डाटा अधिग्रहण के लिए समस्या
एक GFP और आरएफपी नमूना व्यक्त करने के लिए ठेठ इमेजिंग सेटिंग्स तालिका 3 में पाया जा सकता है वर्णित माइक्रोस्कोप सेटअप प्रकाश शीट स्थिर है, एक बेलनाकार लेंस द्वारा निर्मित है। दो रोशनी उद्देश्यों को हवा लेंस हैं और पता लगाने के उद्देश्य के लिए एक पानी की सूई लेंस है। 20X / 1.0 या 40X / 1.0 उद्देश्यों के साथ 1.0 ज़ूम 230 एनएम और 115 एनएम पिक्सेल आकार और क्रमश: 441 x 441 माइक्रोन या 221 x 221 माइक्रोन के दृश्य के एक क्षेत्र देता है। 2: यह केंद्र के साथ डिफ़ॉल्ट प्रकाश शीट मोटाई का उपयोग करने के लिए सीमा को 1 अनुपात की सिफारिश की है। 20X / 1.0 के लिए इस मोटाई 4.5 माइक्रोन के लिए और 40X / 1.0 केंद्र में 3.2 माइक्रोन के लिए मेल खाती है। इमेजिंग गति प्राथमिक प्राथमिकता नहीं है, तो एक बहुरंगा नमूना के मामले में अलग पटरियों का उपयोग चैनलों के बीच प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के crosstalk से बचने के लिए। अधिग्रहण के उच्चतम गति से Z कदम प्रति 50 मिसे तक सीमित हैजेड-चालक के आंदोलन की गति। लक्ष्य के मामले में, उदाहरण के लिए अधिकतम इमेजिंग गति को प्राप्त करने के लिए है, तो दोहरी तरफा रोशनी के साथ दो पटरियों, जोखिम समय निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि सभी Z कदम के प्रति लिया छवियों का योग 50 मिसे के नीचे है। दूसरी ओर, यदि केवल एक ही छवि जेड कदम के प्रति अधिग्रहण कर लिया है, यह नहीं जोखिम समय 50 मिसे की तुलना में कम स्थापित करने के लिए फायदेमंद है।
1920 x 1920 छवि का आकार |
16-बिट |
धुरी पर स्कैन |
ऑनलाइन फ्यूजन के साथ दोहरी तरफा रोशनी |
10X / 0.2 रोशनी उद्देश्य |
20X / 1.0 डब्ल्यू योजना Apochromat का पता लगाने के उद्देश्य |
ट्रैक 1: उत्तेजना 488 एनएम आम तौर पर 100 मेगावाट लेजर के 2%, 550 एनएम सपा उत्सर्जन फिल्टर |
ट्रैक 2: उत्तेजना 561 एनएम आमतौर पर 3% की 75 मेगावाट लेजर, 585 एनएम एल.पी. उत्सर्जन फिल्टर |
100 मिसे के संपर्क में समय अप |
जेड ढेर मोटाई 50-100 माइक्रोन |
1-1.5 माइक्रोन निरंतर Z ड्राइव मोड में Z कदम आकार |
28.5 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन |
तालिका 3: सेटिंग इमेजिंग।
प्रयोग के बाद नमूना निरीक्षण
यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना अभी भी प्रयोग के अंत में स्वस्थ है महत्वपूर्ण है। पहली बार एक readout के रूप में, एक स्टिरियोस्कोप के तहत नमूना के दिल की धड़कन की जाँच करें। तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ नमूना agarose से बाहर ले जाया जा सकता है और इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने के आदेश अगर यह इमेजिंग से प्रभावित था की जांच करने के लिए और अधिक विकसित करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, यह एंटीबॉडी धुंधला के लिए तय किया जा सकता है।
बढ़ते और बहाव
यह चैम्बर एस के परासारिता रखने के लिए आवश्यक हैएम्बेडिंग agarose की परासारिता के करीब olution, अन्यथा सूजन / agarose और नमूना घटित होगा के बाद अस्थिरता के सिकुड़ने। इसलिए, एक ही समाधान (methylene नीले बिना E3 के माध्यम) का उपयोग चैम्बर को भरने के लिए और 1% कम पिघलने बिंदु agarose aliquots तैयार करने के लिए। इसके अतिरिक्त, अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में agarose छोड़ नहीं है, क्योंकि यह अपने बीच बढ़िया तालमेल गुण खो सकते हैं।
बहुत गर्म agarose में मछली एम्बेड नहीं करें क्योंकि यह गर्मी झटका प्रतिक्रिया या भ्रूण की मौत हो सकती है। भ्रूण पर गर्म agarose के प्रभाव के बारे में अनिश्चित हैं, तो जाँच करें कि पूंछ मोड़ नहीं है और हृदय की दर को धीमा नहीं करता है। यदि ऐसा होता है, प्रयोग के लिए एक अलग भ्रूण का उपयोग करें।
नमूना कम (लगभग 2 सेमी) के साथ agarose स्तंभ की कुल लंबाई रखें और अपने सिर सवार टिप की ओर उन्मुख साथ zebrafish माउंट। इसी तरह, agarose सिलेंडर capill से निकालाआरे जितना संभव हो कम रखा जाना चाहिए। इन उपायों से फिल्म में नमूना की स्थिरता को सुनिश्चित करेगा। इसी समय, agarose स्तंभ काफी लंबे समय होना चाहिए ताकि कांच केशिका ही है, प्रकाश पथ में पहुँच नहीं है के रूप में इस प्रमुख अपवर्तन और परावर्तन का कारण होगा।
नमूने के प्रारंभिक बहाव agarose सिलेंडर ही की मात्रा में परिवर्तन के कारण होता है। सवार की रपट को इसके लिए कारण नहीं है। इसलिए, यह प्लास्टिसिन या नेल पॉलिश के साथ सवार को ठीक करने में मदद नहीं करता है। भ्रूण भी अपने प्राकृतिक विकास की वजह से फिल्म के दौरान अपनी स्थिति को बदल सकता है। तदनुसार, यह देखने के क्षेत्र के बीच में ब्याज के क्षेत्र केंद्र और इन आंदोलनों को समायोजित करने के किनारों पर कुछ कमरे में रखने की सलाह दी जाती है।
प्रकाश पथ में embedding माध्यम की कम राशि
नमूना सही ढंग से Orienting सबसे अच्छा संभव छवि गुणवत्ता 15 को प्राप्त करने में मदद करता है। जीनरैली, उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के रूप में छोटे ऊतक और संभव के रूप में बढ़ते मीडिया के माध्यम से यात्रा करना चाहिए। इष्टतम समाधान agarose मुक्त बढ़ते है। यह Arabidopsis पार्श्व रूट इमेजिंग 14, जिसमें मुख्य जड़ phytagel में रखा गया था और बाद में पूरी तरह से पार्श्व जड़ों जेल स्तंभ से बाहर हो जाना करने के लिए करते थे के लिए एक सेटअप में, उदाहरण के लिए हासिल की थी। Agarose मुक्त बढ़ते भी दो दिन के 12 से अधिक Tribolium बीटल की पूरी embryogenesis की इमेजिंग के लिए विकसित किया गया था। छवि गुणवत्ता में सुधार है कि मामले में एक प्राथमिक प्रेरणा नहीं था। Tribolium भ्रूण बस agarose अंदर काफी देर तक जीवित नहीं है। एक बिल्कुल एम्बेडिंग मीडिया से मुक्त बढ़ते zebrafish में लंबे समय तक इमेजिंग के लिए हासिल नहीं किया गया है। फिर भी, हम इस तथ्य का लाभ ले सकते हैं कि जब agarose solidifies, सबसे भ्रूण तिरछे केशिका में एक आंख agarose में गहरी स्थित है और दूसरी आंख एम्बेडिंग स्तंभ की सतह के करीब होने के साथ तैनात हैं। टीवह आंख की सतह के करीब बेहतर छवि गुणवत्ता प्रदान करता है और इसलिए रियायत के तौर पर imaged किया जाना चाहिए।
Agarose एकाग्रता और लंबी अवधि इमेजिंग
बढ़ते के लिए agarose की एकाग्रता नमूना की स्थिरता और संभावना यह करने के लिए और ऑक्सीजन के भ्रूण के विकास के प्रसार को समायोजित करने के बीच एक समझौता है। वहाँ नमूना की स्थिरता में कोई अतिरिक्त लाभ जब 1% से अधिक agarose सांद्रता का उपयोग कर रहा है। प्रयोगों के अनुकूलन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में हम 0.6% agarose, जो भी भ्रूण छोटी से 24 HPF वह भी नाजुक 1% agarose में रखा जा रहे हैं के लिए उपयुक्त है सलाह देते हैं। पुराने भ्रूण और लार्वा चतनाशून्य करने के लिए, एमएस-222 एकाग्रता दुष्प्रभाव 13 बिना 200 माइक्रोग्राम / एमएल के लिए उठाया जा सकता है।
मामले में विकासशील भ्रूण अब से ± 12 घंटे के लिए imaged हैं, agarose बढ़ते सिफारिश नहीं है, क्योंकि यह भ्रूण और caus के विकास को प्रतिबंधिततों पूंछ विरूपण। यह समस्या समान अपवर्तनांक साथ FEP बहुलक ट्यूबों में भ्रूण बढ़ते 13,39 पानी के लिए द्वारा zebrafish के लिए हल किया गया था। माउस भ्रूण, दूसरे हाथ पर, खोखले agarose सिलेंडर 40 में या एक एक्रिलिक एक सिरिंज से जुड़ी 41 रॉड के छेद में स्थिर किया जा सकता है। FEP ट्यूब बढ़ते हालांकि डिफ़ॉल्ट पद्धति के रूप में की सिफारिश नहीं है, क्योंकि ट्यूब की दीवार प्रकाश थोड़ा agarose की तुलना में अधिक refracts।
हल्की चादर संरेखण
अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए यह हर प्रयोग से पहले स्वत: प्रकाश चादर संरेखण प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। खासकर अगर ज़ूम सेटिंग्स बदल रहे थे, उद्देश्यों बाहर ले जाया गया, या एक अलग तरल कक्ष में इस्तेमाल किया गया था।
रोशनी
प्रकाश शीट की धुरी स्कैनिंग हमेशा सक्रिय किया जाना चाहिए। बड़े बिखरने नमूनों के लिए, यह ऑनलाइन एफ के साथ दोहरी तरफा रोशनी लागू करने के लिए आवश्यक हैusion देखने के क्षेत्र भर में भी रोशनी प्राप्त करने के लिए। दोहरी तरफा रोशनी भी आंख इमेजिंग, जो भ्रूण के लेंस से आने वाली प्रकाश के अपवर्तन चादर है की एक विशिष्ट समस्या कम हो। छोटे, कम बिखरने नमूनों कुशलता से एक तरफा रोशनी, जो आधे से इमेजिंग समय shortens और दोहरी तरफा रोशनी की तुलना में थोड़ा बेहतर छवि गुणवत्ता में परिणाम कर सकते हैं का उपयोग imaged किया जा सकता है। यह वह जगह है दो रोशनी हथियारों के लिए प्रकाश पथ हमेशा अलग हैं और अधिक कुशल एक चुना जा सकता है। इसके अतिरिक्त, दो प्रकाश शीट हर तरफ से आ रहे एक विमान है, जो फ्यूजन के बाद धुंधला हल्के कारण बनता में पूरी तरह से कभी नहीं कर रहे हैं। बहुत तेजी से intracellular घटनाओं, बढ़ रही सूक्ष्मनलिकाएं (मूवी 2) की तरह के लिए, दोहरी तरफा रोशनी छोड़ दिया और सही से रोशनी के साथ छवियों के बाद से क्रमिक रूप से है, जो नशे की गति में परिणाम सकता है अर्जित कर रहे हैं उचित नहीं है।
photobleachingऔर phototoxicity
कम fluorophore photobleaching अक्सर LSFM का एक प्रमुख लाभ के रूप में उल्लेख किया है। हम तर्क होता है कि इसका उद्देश्य सभी में कोई photobleaching होना चाहिए। अगर वहाँ रहते इमेजिंग प्रयोग में ध्यान देने योग्य photobleaching है, नमूना शायद सहन लेजर जोखिम की अपनी शारीरिक सीमा से बाहर पहले से ही है। कताई डिस्क माइक्रोस्कोप में zebrafish भ्रूण जब इमेजिंग, हमारे अनुभव में, उच्च phototoxicity भ्रूण विकास भी फ्लोरोसेंट संकेत bleaches स्पष्ट रूप से पहले दुकान कर सकते हैं। इसलिए, LSFM में इमेजिंग सेटिंग्स इतना है कि कम या कोई photobleaching मनाया जाता है समायोजित किया जाना चाहिए। हालांकि LSFM नमूने के लिए कोमल है, यह उतना ही लेजर शक्ति और जोखिम समय के रूप में शोर अनुपात बाद में डेटा विश्लेषण के लिए पर्याप्त के लिए एक संकेत प्राप्त करने की आवश्यकता का उपयोग करने के लिए समझदारी है।
जेड ढेर, समय अंतराल और डेटा का आकार
LSFM द्वारा उत्पन्न फ़ाइलें आमतौर पर बहुत बड़े हैं; कभी कभी टेराबाइट रेंज में। यह अक्सर छवि गुणवत्ता और डेटा आकार के बीच एक समझौता करने के लिए आवश्यक है। यह विशेष रूप से ढेर और समय चूक अधिग्रहण में अंतराल के Z रिक्ति के लिए मामला है। जेड अंतराल को परिभाषित करने के लिए, Z ढेर उपकरण टैब में इष्टतम बटन आदर्श रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, खासकर अगर डाटासेट बाद में deconvolved दिया जाएगा। यह रिक्ति पड़ोसी ऑप्टिकल स्लाइस के बीच 50% ओवरलैप प्राप्त करने के लिए खरीदते हैं। फिर भी, कुछ बड़ा Z अंतराल आमतौर पर स्वीकार्य हैं। वे समय Z ढेर के रूप में अच्छी तरह से अंतिम फ़ाइल आकार प्राप्त करने के लिए की जरूरत को कम। इष्टतम समय नमूना ब्याज की प्रक्रिया पर निर्भर करता है। समग्र आंख के लिए विकास 5-10 मिनट के अंतराल आमतौर पर स्वीकार्य हैं। कुछ संरचनाओं स्वचालित रूप से पता लगाया जा करने के लिए कर रहे हैं, बाद में समय अंक पर्याप्त समान होना चाहिए।
फ्लोरोसेंट मोती
फ्लोरोसेंट मोती मुख्य रूप से अलग अलग विचार पंजीकरण के लिए के रूप में असंदिग्ध मार्कर की सेवाएक-दूसरे पर एक MultiView डाटासेट की। हमेशा अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले मनका समाधान भंवर। के रूप में इस फ्लोरोसेंट डाई की हानि हो सकती है मोती गर्मी नहीं है। MultiView पंजीकरण के लिए इष्टतम मनका एकाग्रता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है। वर्णित प्लगइन प्रत्येक दृश्य के दौरान 1000 के आसपास का पता लगाया मोतियों के साथ सबसे अच्छा काम करता है। बड़ी (500 एनएम या 1,000 एनएम) मोती छोटे (कम से कम 500 एनएम) मोतियों की तुलना में अधिक मजबूती के साथ पता चला रहे हैं। इसका कारण यह है बड़ा मोती चमक रहे हैं और नमूने में संरचनाओं की झूठी सकारात्मक पता लगाने के बिना खंड के लिए आसान कर रहे हैं। बड़े मोतियों की नुकसान यह है कि वे अंतिम जुड़े हुए हैं और deconvolved छवि में बहुत महत्वपूर्ण हो जाता है। प्रत्येक नए फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए, उचित मनका आकार और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अनुकूलित किया जाना है। चित्रा 5 और मूवी 3 से नमूना का एक उदाहरण देने के लिए, 100 एनएम हरी उत्सर्जन मोती झिल्ली-GFP चैनल में भी कई झूठी सकारात्मक पता लगाने दिया था, लेकिन 1,000 nएम लाल उत्सर्जन मोती मजबूती के साथ नमूना अंदर बहुत कुछ सकारात्मक पता लगाने के साथ H2B आरएफपी चैनल में पाया गया। मनका पता लगाने फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ चैनल में विफल रहता है, एक अलग ही मोती युक्त चैनल का अधिग्रहण किया जा सकता है, लेकिन यह बहुत ही व्यावहारिक नहीं है। उप संकल्प आकार मोती माइक्रोस्कोप की बात फैल समारोह (पीएसएफ) है, जो deconvolution (चित्रा -2 सी-डी) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक सीधा readout दे। पंजीकरण और फ्यूजन बड़ा मोती (जैसे 1,000 एनएम) के साथ बेहतर काम करता है, तो पीएसएफ की एक अलग छवि उप-संकल्प, जैसे, 100 एनएम मोतियों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। बहुरंगा मनकों का उपयोग मल्टीचैनल अधिग्रहण के पंजीकरण के दौरान और पुष्टि है कि चैनलों ओवरले पूरी तरह से के लिए उपयोगी है।
जब बाद में MultiView पंजीकरण और संलयन के बिना एक ही दृश्य से इमेजिंग फ्लोरोसेंट मोती के अलावा आवश्यक नहीं है। हालांकि, यहां तक कि उन मामलों में मोती पहल के दौरान सहायक हो सकता हैएल प्रकाश शीट समायोजन प्रकाश शीट की गुणवत्ता की जांच करने के लिए और सामान्य में ऑप्टिकल aberrations प्रकट करते हैं। जैसे ऑप्टिकल aberrations क्षतिग्रस्त या गंदा उद्देश्यों, कक्ष या agarose में inhomogeneity के गंदे खिड़कियों की तरह विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न हो सकता है। मोती भी MultiView पंजीकरण फिजी प्लगइन 20 से बहाव सुधार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
मल्टीव्यू
MultiView पुनर्निर्माण प्रयोजन के लिए, यह देखा गया 3, 5 और इतने पर है, जो एक दूसरे को नहीं विरोध कर रहे हैं की एक विषम संख्या प्राप्त करने के लिए बेहतर है। के बाद से PSFs अलग अलग दिशाओं से imaged हैं इस deconvolution में सुधार। यह भी समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण की शुरुआत है कि वहाँ विचारों के बीच में पर्याप्त ओवरलैप पर पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सबसे अच्छा है, अनुभव से किया जाता है यानी, तुरंत पुष्टि है कि पहली बार के बिंदु में विचारों को सफलतापूर्वक पंजीकृत किया जा सकता है। MultiView अधिग्रहण के लक्ष्य के संकल्प को बढ़ाने के लिए है जबएक बड़ी बिखरने नमूना की एक छवि है, यह छवि प्रत्येक दृश्य में पूरे नमूना करने के लिए उचित नहीं है, लेकिन नमूना है, जहां संकेत कमजोर होती जाती है के केन्द्र के आसपास रोकने के लिए। नमूना की दूसरी छमाही से कम गुणवत्ता अधिग्रहण MultiView पुनर्निर्माण के लिए उपयोगी जानकारी जोड़ नहीं होता।
2. महत्वपूर्ण कदम और डाटा प्रोसेसिंग के लिए समस्या
वर्तमान में, वहाँ एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप है कि अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं और अपेक्षाकृत आसान अपनाने के लिए से MultiView डेटा के प्रसंस्करण के लिए कई संभावनाएं मौजूद हैं। हम MultiView पुनर्निर्माण अनुप्रयोग है, जो एक खुला स्रोत फिजी 32 (स्टीफ़न Preibisch अप्रकाशित, सॉफ्टवेयर में लागू है का उपयोग लिंक 1 ए और Link1b सामग्री की सूची में)। इस प्लगइन पिछले SPIM पंजीकरण प्लगइन 20 के एक प्रमुख को नया स्वरूप है, की समीक्षा कीSchmied एट अल। 42, BigDataViewer और उसके एक्सएमएल और SPIM पंजीकरण कार्यप्रवाह के साथ HDF5 प्रारूप 33 (चित्रा 1 बी, एकीकृत करके लिंक 2 , लिंक 3 )। यह आवेदन भी उच्च निष्पादन कंप्यूटिंग क्लस्टर है, जो काफी प्रसंस्करण 43 को गति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस MultiView पंजीकरण आवेदन को सक्रिय रूप से आगे विकसित की है और सुधार रहता है। वर्णित सॉफ्टवेयर के लिए समस्याओं या सुविधाओं के अनुरोध के मामले में, संबंधित GitHub पृष्ठों (पर मुद्दों दर्ज करें लिंक 4 मल्टीव्यू पुनर्निर्माण के लिए और लिंक 5 BigDataViewer के लिए)।
दूसरा विकल्प माइक्रोस्कोप के साथ एक साथ उपलब्ध वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए है। यह समाधान अच्छी तरह से काम करता है और कार्यरत हैं अलग अलग विचार रजिस्टर करने के लिए फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग करने का एक ही सिद्धांत। हालांकि, यह तेजी से BigDataViewer के साथ की तरह पूरे डाटासेट कल्पना करने के लिए विकल्प का अभाव है। इसके अलावा सॉफ्टवेयर क्लस्टर के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता और इसके अलावा प्रसंस्करण ब्लॉकों अन्य उपयोगकर्ताओं को, जब तक कि सॉफ्टवेयर के लिए अतिरिक्त लाइसेंस खरीदा है के लिए माइक्रोस्कोप।
तीसरा विकल्प है, जो भी एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर है, हाल ही में केलर प्रयोगशाला 44 द्वारा प्रकाशित और प्रसंस्करण और प्रकाश शीट डेटा के बहाव के विश्लेषण के लिए एक व्यापक रूपरेखा प्रदान किया गया था। इस सॉफ्टवेयर नमूना भीतर से जानकारी का उपयोग किया जाता है MultiView संलयन प्रदर्शन करने के लिए है, इसलिए यह नमूना आसपास फ्लोरोसेंट मोतियों की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है। लेकिन एक ही समय में यह इमेजिंग दृश्य (उद्देश्यों) के orthogonal उन्मुखीकरण हो जाती है, तो यह मनमाना कोण 44 से प्राप्त डेटा के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।
हार्डवेयर आवश्यकताएँ
ntent "> हार्डवेयर प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल तालिका 4 में पाया जा सकता है। वहाँ पर्याप्त भंडारण क्षमता और उपलब्ध डाटा प्रोसेसिंग के लिए एक स्पष्ट पाइप लाइन, वास्तविक प्रयोग से आगे हो गया है। छवियों के अधिग्रहण के बाद के विश्लेषण से भी तेज है और यह आसान है असंसाधित डेटा के साथ पानी भर गया हो। यह अक्सर जुड़े हुए देखा गया, अधिकतम तीव्रता के अनुमानों या गोलाकार अनुमानों 45 की तरह सभी कच्चे छवियों, बल्कि एक फसली संस्करण या संसाधित छवियों को स्टोर करने के लिए अवास्तविक है।प्रोसेसर | दो इंटेल Xeon प्रोसेसर E5-2630 (छह कोर, 2.30 गीगा टर्बो, 15 एमबी, 7.2 जीटी / सेकंड) |
याद | 128 जीबी (16 × 8 जीबी) 1600 मेगाहर्ट्ज DDR3 ईसीसी RDIMM |
हार्ड ड्राइव | 4 × 4 टीबी 3.5inch सीरियल ATA (7.200 आरपीएम) हार्ड ड्राइव |
HDD नियंत्रक | PERC H310 SATA / एसएएस कोनडेल प्रेसिजन लिए ट्रोलर |
HDD विन्यास | सी 1 SATA 3.5 इंच, 1-4 हार्ड ड्राइव |
ग्राफिक्स | दोहरी 2 जीबी NVIDIA Quadro 4000 (2 कार्ड w / 2 डी पी और 1 DVI- मैं प्रत्येक) (2 डी पी-डीवीआई और 2 डीवीआई वीजीए अनुकूलक) (MRGA17H) |
नेटवर्क | इंटेल X520-T2 दोहरी पोर्ट 10 GbE नेटवर्क इंटरफेस कार्ड |
सारणी 4: हार्डवेयर जरूरत।
डाटा प्रोसेसिंग गति
समय डाटा प्रोसेसिंग के लिए आवश्यक डेटा के आयामों पर और इस्तेमाल हार्डवेयर पर निर्भर करता है। तालिका 1 में, हम समय एक उदाहरण 8.6 जीबी MultiView डाटासेट कि 4 विचारों और 2 चैनल के साथ 1 समय बिंदु के शामिल प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण कदम के लिए आवश्यक का एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं।
प्रसंस्करण रोंTEP | पहर | प्रोटोकॉल कदम |
HDF5 के रूप में resave | 6 मिनट 30 सेकंड | 6.3 |
ब्याज अंक का पता लगाने | 20 सेकंड | 6.4 |
ब्याज अंक का उपयोग कर रजिस्टर | 3 सेकंड | 6.5 |
सामग्री आधारित MultiView संलयन | 4 घंटा | 7.2 |
मल्टीव्यू deconvolution (सीपीयू) | 8 घंटा | 7.3 |
मल्टीव्यू deconvolution (GPU) | 2 घंटा | 7.3 |
तालिका 1: डेटा प्रसंस्करण समय।
MultiView पुनर्निर्माण के लिए इनपुट डेटा स्वरूप
फिजी प्लगइन मल्टीव्यू पुनर्निर्माण .czi, .tif और ome.tiff स्वरूपों का समर्थन कर सकते हैं। .czi प्रारूप का आंकड़ा संरचना के कारण, असंतत डेटासेट नहीं हैंपूर्व प्रसंस्करण के बिना समर्थन किया। असंतत मतलब यह है कि रिकॉर्डिंग आरंभ किया जाना था (जैसे नमूने के बहाव के कारण पदों बदल डालना)। इस मामले में .czi फ़ाइलों .tif के रूप में resaved किए जाने की जरूरत है। .tif के लिए प्रत्येक दृश्य फ़ाइलों और रोशनी दिशा में एक अलग फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए।
पिक्सेल आकार की कैलिब्रेशन
माइक्रोस्कोप-ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर XY पिक्सेल चयनित उद्देश्य के आधार पर आकार के लिए अंशांकन खरीदते हैं। हालांकि, Z में पिक्सेल आकार कदम आकार द्वारा स्वतंत्र रूप से परिभाषित किया गया है। एक गलत उद्देश्य सॉफ्टवेयर में निर्दिष्ट किया जाता है, तो Z अनुपात करने के लिए XY गलत है और पंजीकरण असफल हो जायेगी।
प्रारंभिक पंजीकरण
डाटासेट परिभाषित करने के बाद पंजीकरण की संख्या 1 हो जाएगा और ब्याज अंकों की संख्या ViewSetup एक्सप्लोरर में 0 होगा। प्रारंभिक पंजीकरण डाटासेट की जांच का प्रतिनिधित्व करता है। दोनों संख्या ओएफ पंजीकरण और ब्याज अंक प्रसंस्करण के दौरान वृद्धि होगी।
नीचे ब्याज अंक का पता लगाने के लिए नमूने
नीचे नमूने का उपयोग की सिफारिश की है, फ़ाइलों की लोडिंग के बाद से और विभाजन बहुत तेजी से किया जाएगा। यह ध्यान रखें कि पता लगाने के मापदंडों के नीचे नमूने के आधार पर बदल जाएगा, इस प्रकार विभिन्न नीचे नमूना सेटिंग्स के बीच का पता लगाने सेटिंग्स स्थानांतरित करने के लिए संभव नहीं है, लेकिन महत्वपूर्ण है।
ब्याज अंक की जांच
यह प्रत्येक दृश्य में संभव के रूप में कई सच्चे मोती के रूप में खंड के लिए सलाह दी जाती है, यहां तक कि कुछ झूठी सकारात्मक पता लगाने प्राप्त करने की कीमत पर, क्योंकि वे पंजीकरण में काफी बाधा नहीं है। नकली पता लगाने, यदि संख्या में कुछ, पंजीकरण के दौरान (ब्याज अंक का पंजीकरण देखें) बाहर रखा गया है। हालांकि, बड़े पैमाने पर झूठी सकारात्मक पता लगाने एल्गोरिथ्म के लिए एक समस्या खड़ी। यह न केवल पता लगाने के लिए प्रदर्शन कम कर देता है औरपंजीकरण, यह बहुत लंबे समय तक इस सेगमेंट के लिए छवि लेता है और साथ ही विचारों के बीच इन मोतियों की तुलना, लेकिन यह भी पंजीकरण की सटीकता कम कर देता है के बाद से। यह और अधिक कड़े पता लगाने के मापदंडों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मोती (एक मनका चित्रा 1E पर यानी कई पता लगाने) के विभाजन से अधिक पंजीकरण के लिए हानिकारक है और बचा जाना चाहिए।
ब्याज अंक का पंजीकरण
एक दूसरे पर विचारों का पंजीकरण करने के लिए, प्रत्येक दृश्य में प्रत्येक मनका के स्थान अपने तीन निकटतम पड़ोसी मोती के संबंध में अपनी स्थिति से वर्णन किया गया है। इन नक्षत्रों एक स्थानीय ज्यामितीय वर्णनकर्ता गठन कर रहे हैं और विचारों के बीच प्रत्येक मनका की तुलना अनुमति देते हैं। दो विचारों के बीच वर्णनकर्ता मिलान के साथ मोती तो उम्मीदवार पत्राचार के रूप में माना जाता है। ध्यान दें कि यह केवल बेतरतीब ढंग से वितरित की माला, जिसके लिए स्थानीय वर्णनकर्ता आमतौर पर प्रत्येक मनका के लिए अद्वितीय हैं के लिए काम करता है।ऐसा ही एक पंजीकरण के लिए नमूने में नाभिक के रूप में अन्य संरचनाओं का उपयोग कर सकते हैं। हालांकि, क्रम में नाभिक है, जो नमूने में गैर बेतरतीब ढंग से वितरित कर रहे हैं पता लगाने के लिए अन्य तरीकों 20,21 लागू होते हैं।
उम्मीदवार पत्राचार तो आदेश झूठी सकारात्मक को बाहर करने में RANSAC 36 के खिलाफ जांच कर रहे हैं। प्रत्येक पत्राचार एक दूसरे पर देखा गया overlaying के लिए एक परिवर्तन मॉडल सुझाव दे रहा है। यह सच है कि पत्राचार संभावना है, एक परिवर्तन मॉडल पर सहमत हैं जबकि outliers एक अलग से एक के लिए प्रत्येक बिंदु होगा। सच पत्राचार तो दो विचारों के बीच तुलना में एक affine परिवर्तन मॉडल गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक चलने का अनुकूलन एल्गोरिथ्म के साथ एक वैश्विक अनुकूलन तब किया जाता है, जिसके दौरान सभी विचारों विचारों 20,21 के बीच कम से कम विस्थापन के उद्देश्य से पहली बार देखने पर पंजीकृत हैं।
समय चूक पंजीकरण
स्थानांतरित करने के लिए कारणखुर्दबीन मंच के agarose और imprecise मोटर आंदोलन का बयान, प्रत्येक ढेर की स्थिति समय के साथ मामूली अंतर होता है। जबकि अलग-अलग समय बिंदु के पंजीकरण इस समय बिंदु के विचारों के बीच अंतर को हटा, समय चूक भी एक पूरे के रूप में पंजीकृत करने की जरूरत है। यह अंत करने के लिए, प्रत्येक व्यक्ति के समय बिंदु संदर्भ समय बिंदु पर पंजीकृत है।
संदर्भ समय बिंदु
कई बार अंक के साथ एक समय श्रृंखला संसाधित किया जाता है, एक प्रतिनिधि समय बिंदु संदर्भ के रूप में आमतौर पर समय की श्रृंखला के बीच में से बाद से मनका तीव्रता विरंजन के कारण समय पर नीचा कर सकते हैं चुना जाता है। इस संदर्भ में, ब्याज बिंदु का पता लगाने, पंजीकरण, bounding बॉक्स और संलयन के लिए मानकों को निर्धारित किया जा सकता है। इन मानकों तो प्रत्येक व्यक्ति के समय बिंदु के लिए एक विशिष्ट परिवर्तन मॉडल गणना करने के लिए पूरे समय व्यतीत करने के लिए लागू कर रहे हैं। समय चूक पंजीकरण के दौरान अन्य सभी समय के अंक भी regist हैंइस संदर्भ में समय बिंदु पर स्थानिक जुटी। इस प्रकार पूरी रिकॉर्डिंग के लिए bounding बॉक्स मापदंडों के इस विशेष समय बिंदु के आधार पर कर रहे हैं।
मल्टीचैनल पंजीकरण
कई चैनलों जब इमेजिंग, आदर्श ही फ्लोरोसेंट मोती सभी imaged चैनलों में दिखाई जानी चाहिए। का पता लगाने और पंजीकरण तो हर चैनल को व्यक्तिगत रूप से, जो खाते में परिवर्तन पर अलग तरह के प्रकाश तरंग दैर्ध्य के प्रभाव लेता है पर प्रदर्शन किया जा सकता है। अक्सर यह संभव नहीं है, क्योंकि मोती सभी चैनलों में दिखाई नहीं हैं या मोती छवि एक चैनल में बहुत ज्यादा हावी रहे हैं और अन्य चैनल (ओं) में भी मंद कर रहे हैं। ठेठ समाधान केवल पता लगाने और पंजीकरण और अधिग्रहण परिवर्तन मॉडल के लिए एक चैनल में दिखाई मोतियों का इस्तेमाल होता है (यानी पता लगाने, पंजीकरण और समय चूक पंजीकरण के बाद) तब फिजी> प्लगइन्स> मल्टीव्यू Reconstr द्वारा अन्य चैनलों के लिए लागू किया जाता हैuction> बैच प्रोसेसिंग> उपकरण> डुप्लीकेट परिवर्तनों। ड्रॉप डाउन मेनू में अन्य चैनलों के लिए एक का चयन करें चैनल के परिवर्तन लागू करने के लिए। निम्न विंडो में एक्सएमएल का चयन करें और ठीक क्लिक करें। तब चैनल है कि स्रोत चैनल के रूप में मोती होता है और लक्ष्य चैनल के रूप में चैनल (एस) मोती के बिना चयन का चयन करें। डुप्लीकेट के लिए जो परिवर्तनों सभी परिवर्तनों और प्रेस ठीक बदलें का उपयोग करें। परिवर्तनों तो अन्य सभी चैनलों के लिए नकल की है और एक्सएमएल में बच रहे हैं। ViewSetup एक्सप्लोरर में नए परिवर्तनों को देखने के लिए, पुनः आरंभ MultiView पुनर्निर्माण आवेदन।
बंद डब्बा
कई विचार के विलय computationally बहुत गहन है। हालांकि, बड़े चित्र आमतौर पर न केवल नमूना है, लेकिन यह भी चारों ओर मोतियों को समायोजित करने के लिए अर्जित कर रहे हैं। एक बार पंजीकरण पैरामीटरएस मोतियों से निकाले जाते हैं, वे छवि के भाग के रूप में नहीं रह उपयोगी होते हैं। इसलिए, संलयन की दक्षता बढ़ाने के लिए, केवल नमूना युक्त छवि के ढेर के कुछ हिस्सों को आपस में जुड़े हुए किया जाना चाहिए। ब्याज (bounding बॉक्स) के एक क्षेत्र नमूना को रोकने के लिए और परिभाषित किया जाना चाहिए संभव के रूप में के आसपास के रूप में छोटे agarose। चित्रा 2 में उदाहरण के लिए 2229 × 2136 × 2106 पिक्सल के साथ पूरी मात्रा पर एक भारित औसत संलयन, राम के 38,196 एमबी की आवश्यकता होगी, जबकि एक bounding बॉक्स के साथ मात्रा 1634 × 1746 × 1632 पिक्सल के लिए कम है और स्मृति आवश्यकताओं को कम कर रहे हैं 17729 MB करने के लिए।
सामग्री आधारित MultiView संलयन
MultiView डेटा fusing में चुनौती यह है कि आम तौर पर देखा गया अचानक अंत और एक ही voxels के लिए एक ही छवि गुणवत्ता को शामिल नहीं करते। विचारों की साधारण औसत इसलिए सम्मिश्रण कलाकृतियों और अनावश्यक छवि गिरावट के लिए नेतृत्व करेंगे। सामग्री आधारित MultiView फू सायन खाते में इन दोनों समस्याओं का समय लगता है। सबसे पहले, यह अलग अलग विचार मिश्रणों, जहां एक छवि समाप्त हो जाती है और एक दूसरे को शुरू होता है और दूसरा, यह स्थानीय छवि गुणवत्ता का आकलन और फ्यूजन 21 में उच्च छवि गुणवत्ता के लिए उच्च भार लागू होता है। एक ही दृश्य की तुलना में XY में संकेत के एक मामूली गिरावट (चित्रा 2 ई-एच, चित्रा 5 ए-डी) के साथ Z में संकल्प के एक सुधार है।
मल्टीव्यू deconvolution
मल्टीव्यू deconvolution एक और दृष्टिकोण विचारों के विलय को प्राप्त है। इस विधि के साथ भी अलग अलग विचार के PSFs आदेश छवि है कि माइक्रोस्कोप के द्वारा प्रकाशिकी convolved कर दिया गया है ठीक करने के लिए ध्यान में रखा जाता है। इस विधि को काफी छवि कलंक को दूर करने और संकल्प और संकेत 31 (चित्रा -2 सी-डी, चित्रा 2I-जम्मू, चित्रा 5E-जी, मूवी 3) के विपरीत बढ़ाने के द्वारा छवि गुणवत्ता में सुधार।
ve_content "> Deconvolution computationally बहुत गहन है इस प्रकार का उपयोग कर प्रसंस्करण के लिए एक GPU इस प्रक्रिया की गति बढ़ जाती है (1 टेबल देखें)। यह भी नीचे नमूना डेटा पर deconvolution प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। नीचे नमूना करने के लिए, का उपयोग फिजी> मल्टीव्यू पुनर्निर्माण > बैच प्रोसेसिंग> उपकरण> लागू परिवर्तनों। यह देखा गया है कि एक्सएमएल फ़ाइल में सहेजा जाएगा पर एक नया परिवर्तन मॉडल लागू होगा।BigDataViewer और BigDataServer के लिए HDF5 फ़ाइल स्वरूप
BigDataViewer 33 टेराबाइट डेटा के आकार की आसान दृश्य अनुमति देता है। कैसे BigDataViewer नियंत्रित करने के लिए 2 टेबल में संक्षेप। कार्यक्रम के बुनियादी आपरेशन के एक स्क्रीनकास्ट अपने मूल प्रकाशन 33 में एक पूरक के रूप में भी उपलब्ध है। BigDataViewer एक एक्सएमएल फ़ाइल है, जो मेटाडाटा होता है, और एक HDF5 फ़ाइल, जो छवि डेटा होता है पर केंद्रित है। छवि डेटा राष्ट्रपति हैं3 डी ब्लॉक में कई संकल्प के स्तर में HDF5 में ईएनटी। कई संकल्प स्तर, डेटा कम संकल्प के साथ तेजी से visualizing के लिए अनुमति देने से पहले पूर्ण संकल्प से भरी हुई है। व्यक्तिगत ब्लॉक केवल जब जरूरत स्मृति में लोड कर रहे हैं। इस प्रकार, HDF5 छवि प्रारूप BigDataViewer 33 के माध्यम से डेटा का प्रत्यक्ष और तेजी से दृश्य की अनुमति देता। यह भी के बाद से फ़ाइलों की लोडिंग और अधिक कुशलता से बाहर किया जाता है प्रसंस्करण गति। इसलिए, हम इस प्रारूप में डाटासेट resaving सिफारिश हालांकि यह सख्ती से प्रसंस्करण के लिए आवश्यक नहीं है। डेटा स्वरूप के आगे स्पष्टीकरण के लिए, कृपया देखें लिंक 3 । इसके अतिरिक्त, डेटासेट सहयोगियों या सार्वजनिक BigDataServer 33 (प्रयोग के साथ साझा किया जा सकता लिंक 6 )।
कुंजी | <td> प्रभाव|
एफ 1 | और BigDataViewer का एक संक्षिप्त विवरण अपनी बुनियादी आपरेशन के साथ सहायता से पता चलता है |
<> या माउस पहिया | Z में आंदोलन |
ऊपर और नीचे तीर | में और बाहर ज़ूम |
ठीक क्लिक करें और खींचें | दर्शकों में नमूना ले जाता है |
बाएँ क्लिक करें और खींचें | कर्सर के आसपास घूमता है नमूना |
दर्शक या टैब और छोड़ दिया है या सही तीर के नीचे स्लाइडर | समय धुरी पर चलता रहता है |
इसके अतिरिक्त पारी दबाने | तेजी से आंदोलन या रोटेशन किसी भी अक्ष के साथ |
एक्स और फिर छोड़ दिया और सही तीर | एक्स अक्ष के चारों ओर घूमता |
Y और फिर छोड़ दिया और सही तीर | वाई अक्ष के चारों ओर घूमता |
जेड और फिर छोड़ दिया और सही तीर | जेड धुरी के चारों ओर घूमता है |
पारी और एक्स | एक्स अक्ष के साथ दृश्य orients |
पारी और y | Y अक्ष के साथ दृश्य orients |
पारी और z | जेड अक्ष के साथ दृश्य orients |
मैं | विभिन्न प्रक्षेप मोड के बीच स्विच (यानी निकटतम पड़ोसी और तीन रेखाओ) |
एस या सेटिंग> चमक और विपरीत | चैनल, चमक और विपरीत के रंग को संशोधित |
F6 या सेटिंग> दृश्यता और समूहीकरण | प्रदर्शित किया समूहों में परिवर्तन, संख्या चाबियाँ के माध्यम से विभिन्न समूहों overlaying और समूहों फोन करने के लिए सक्षम बनाता है समूहीकरण |
F10 या उपकरण> रिकार्ड मूवी | वर्तमान में प्रदर्शित टुकड़ा का एक समय श्रृंखला का अधिग्रहण |
तालिका 2: बिग डाटा दर्शक।
3. LSFM का वर्णन किया कार्यान्वयन की सीमाएं
कम throughput
एक ठेठ LSFM प्रयोग में केवल प्रयोग के प्रति एक नमूना imaged है। फिर भी, हमारे अनुभव में, उपयोगी जानकारी का एक बहुत है कि एक नमूना से निकाला जा सकता है। कई भ्रूण के उच्च throughput इमेजिंग हाल ही नमूना स्थिति और रोटेशन की स्वतंत्रता की कीमत पर घर बनाया LSFM setups 46-48 में हासिल किया गया है, हालांकि आम तौर पर।
ऊतकों में अपर्याप्त पैठ गहरी
हालांकि zebrafish भ्रूण पारभासी हैं, प्राप्त छवि गुणवत्ता जल्दी से बिगड़ती जा रही है जब बिखरने और अवशोषण के कारण ऊतकों में गहरी इमेजिंग। आंशिक रूप से इस बिखरने और नमूना द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के अवशोषण का एक प्रभाव है और मौजूदा सेटअप में सही नहीं किया जा सकता है। असमान छवि गुणवत्ता का एक अन्य स्रोत अनियमित रोशनी है। टीवह प्रकाश चादर और बाईं या दाईं ओर से इस घटना के लिए अपने रास्ते यह अपवर्तित, जो धारी कलाकृतियों और कलंक में यह परिणाम में किसी भी वस्तु है। दोहरी तरफा रोशनी और MultiView संलयन अंतिम छवि में कलाकृतियों कम कर सकते हैं। अन्त में, छवि गुणवत्ता प्रकाश शीट, जो किनारों की ओर मोटा होता जा रहा है की प्राकृतिक ज्यामिति के कारण देखने के क्षेत्र के मार्जिन की दिशा में थोड़ा बुरा हो जाता है।
लिमिटेड रासायनिक हेरफेर
दवाओं या अवरोधकों का उपयोग zebrafish अनुसंधान के क्षेत्र में बड़े पैमाने पर है। दवाओं की इस माइक्रोस्कोप उपयोग में विवश है, नमूना कक्ष और साधन के अन्य उपयोगकर्ताओं को, जो एक ही कक्ष साझा की बातों की बड़ी मात्रा के कारण है। एक अतिरिक्त कक्ष दवा प्रयोगों के लिए समर्पित का उपयोग करते हुए इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। कांच के मोती के साथ आंशिक रूप से चैम्बर भरने तरल की मात्रा आवश्यक है कि कम करता है।
कोई photomanipulation
कुरेनtly वहाँ photoconversion, या इस माइक्रोस्कोप में लेजर पृथक तरह स्थानीय ऑप्टिकल गड़बड़ी की कोई संभावना नहीं है। फिर भी, घर बनाया setups ऐसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
4. महत्व और भविष्य के अनुप्रयोगों
LSFM सबसे अच्छा तरीका रहते भ्रूण की बड़ी मात्रा का तेज इमेजिंग के लिए तिथि करने के लिए उपलब्ध है। प्रयोगों एक confocal खुर्दबीन पर बोधगम्य के अधिकांश भी ऊपर उल्लिखित फायदे के साथ एक प्रकाश चादर खुर्दबीन पर किया जा सकता है। आंख विकास की इमेजिंग के मामले में, LSFM की गति महत्वपूर्ण पैरामीटर नहीं है। इसके बजाय, कम phototoxicity और नमूना स्थिति में लचीलापन निर्णायक लाभ कर रहे हैं।
LSFM डेटा एक उच्च SNR है, जो अच्छा deconvolution परिणाम प्राप्त करने में मदद करता है और यह भी स्वचालित छवि विश्लेषण और वस्तु ट्रैकिंग के लिए फायदेमंद है। अंत में, LSFM भ्रूण विकास और Overa पर मात्रात्मक डेटा पैदा करने के लिए एक महान उपकरण हैटू सेल और बाद मॉडलिंग और प्रश्न में प्रक्रियाओं के भौतिक विवरण के लिए ऊतक विशेषताओं।
The authors have nothing to disclose.
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
Links | |||
Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |