Introduction
線維症は、間質性肺疾患、心臓線維症、肝硬変、末期腎不全、全身性硬化症、および自己免疫疾患の1のような種々の慢性進行性疾患の病因に関与しています。間質性肺炎のうち、特発性肺線維症（IPF）は慢性進行性疾患であり、予後不良を示しています。 IPFの病理学的特徴は予後と関連している活性化された線維芽細胞および筋線維芽細胞からなる線維芽細胞巣の開発です。このような肺の線維芽細胞の起源は、もともと常駐肺線維芽細胞及び骨髄から循環する線維細胞を含むいくつかの間葉系細胞に由来することが提案されています。最近、上皮間葉移行（EMT）は、間葉細胞2の形成に関連することが提案されている、および線維性疾患の病因に貢献します。
これは、と考えられているEMTは、腫瘍の浸潤および転移3を含む胎児の発育、創傷治癒、および癌の進行の過程で重要な役割を果たしています。 EMTのプロセスに続いて、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーの損失により、間葉系細胞の能力を取得し、そのようなビメンチンのような間葉マーカー、およびα平滑筋アクチン（SMA）4,5の発現による。以前の研究は、EMTプロセスは腎臓6および肺7における組織線維症の発症に関連しているという証拠を示しました。さらに、慢性炎症は、線維性疾患8を促進します 。さらに、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14（TNFSF14、LIGHT）などの炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン1βは、EMT 9-12を増強することが示されています。
コラーゲンゲル収縮アッセイ線維芽細胞は、I型に埋め込まれたコラーゲンベースの細胞収縮アッセイコラーゲンゲル三次元、収縮性を評価するためのインビトロモデルにおける理想的です。収縮は、線維芽細胞の特徴的な機能の一つであり、正常な創傷修復および線維症13に貢献しています。このアッセイでは、線維芽細胞の付着は、いくつかの条件の下で機械的張力を生成することになっている私はインテグリン依存性のメカニズムを介して型コラーゲン、その結果、組織の収縮につながると考えられています。
ここで、ゲル収縮アッセイの開発は、EMTを受けた細胞における収縮機能の獲得を評価するように適合されることが報告されています。このレポートには、この修正されたアッセイは、EMTを経た間葉細胞で収縮性を評価するのに適していることを示しています。
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Protocol
1.準備と文化肺上皮細胞の
- 10％ウシ胎児血清（FBS）、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養A549ヒト肺上皮細胞（付着細胞株）。
- 取り外し、廃棄し、細胞培養培地を培養皿から5で1回洗浄 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlの。洗浄後、すぐにPBSを吸引。
- 3分間CO 2を 2 mlのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（0.05％）を添加し、37℃でインキュベートし、5％。
- 4分間室温でチューブは150×gで遠心分離、細胞培養培地を含む遠心管で剥離した細胞を収集します。
- 細胞は、細胞培養培地2mlにペレット再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。細胞生存率をチェックするためにトリパンブルー染色と血球計数器を用いて細胞数をカウントします。
- 上のシードA549細胞0.5の密度で10cmのポリスチレンプレート-ゲル収縮アッセイ用培地10mlで1.0×10 6細胞/皿。 0.5の密度で6ウェルのポリスチレンプレート上の細胞をシード- 1.0×10 5細胞/ウェルとEMT確認のための培地2ml。 24時間37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。
2. EMT手順
- ステップ1.6に播種ゲル収縮アッセイ用プレートにTGF-β1（5μg/ mlの）を10μlおよびTNF-αを10μl（10μg/ ml）を追加します。ステップ1.6に播種EMT確認用のプレートにTGF-β1（5μg/ mlの）2μlのとTNF-αの2μlの（10μg/ ml）を追加します。 37℃でインキュベートし、48時間、5％CO 2。
PCRとウエスタンブロッティングによるEMT手順の3.確認
- 位相差顕微鏡を用いて処理した細胞の（石畳-等からのスピンドル形状に）形態の変化を確認してください。
注：ノームをアルA549細胞は、上皮細胞の特徴である敷石状や三角形の外観を持っていますが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、細胞が長く表示され、スピンドルはそれが間葉系細胞14,15に似ている形。 - このようなE-カドヘリンなどの上皮マーカー、およびそのようなN-カドヘリン、ビメンチン、およびPCRまたはウェスタンブロット法を用いて、α平滑筋アクチンなどの間葉系マーカーの発現を評価します。
- RNA抽出キット16を用いて細胞から全RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って逆転写酵素17を用いてcDNAを合成します。
- リアルタイムPCRシステム18と製造業者の説明書に従って単量体シアニン色素PCRキットを用いてmRNAレベルの発現を測定します。 GAPDHに特異的なプライマー（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ACTA2（α-アクチン-2）、CDH1（E-カドヘリン-1、E-カドヘリン）、及びVIM（ビメンチン）を表1に示します。
- 溶解する溶解緩衝液（ 表2）1％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液を用いて細胞。タンパク質アッセイキット19,20を使用して、すべてのサンプルのタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲルへのタンパク質の同じ量を適用します。
- SDSゲル電気泳動し、PVDF膜21へのタンパク質のセミドライトランスファーを行います。 2時間 - 1のためのブロッキング緩衝液中で一次抗体で膜をインキュベートします。インキュベーション後、洗浄緩衝液で2回、膜を洗浄し、二次抗体を有する膜で1時間インキュベートします。
注：これらの研究において使用される抗体および希釈液のためのマテリアル/機器の表を参照してください。ブロッキング緩衝液の構成要素については、 表2を参照してください。 - 二回洗浄緩衝液で膜を洗浄します。冷たいCCDカメラ11,23を用いてウェスタンブロッティング検出キット22を有する膜の写真を撮ります。
- SDSゲル電気泳動し、PVDF膜21へのタンパク質のセミドライトランスファーを行います。 2時間 - 1のためのブロッキング緩衝液中で一次抗体で膜をインキュベートします。インキュベーション後、洗浄緩衝液で2回、膜を洗浄し、二次抗体を有する膜で1時間インキュベートします。
4。 EMTを評価するためのゲル収縮アッセイ
- 細胞培養容器からの馴化培地を吸引し、5でよく洗う - 死んだ細胞を除去するためにPBSの10ミリリットル。洗浄後、すぐにPBSを吸引。
- 3分間CO 2を 0.05％トリプシン/ EDTAの2ミリリットルを加え、37℃でインキュベートし、5％。
- DMEMを150×gで4分間室温でトリプシンインヒビター（1mg / mlの）、遠心管をを補っ含む遠心チューブに剥離した細胞を収集します。
- 蒸留水で1型コラーゲンゲルを混合し、DMEMを濃縮4×1.75 mg / mlでのコラーゲン濃度を達成するためにボリュームを調整するために、1×DMEM濃度。このステップの間に氷の上でのゲル媒体を保つようにしてください。
注：タイプ1コラーゲンゲル（3 mg / mlで）のほか3.5ミリリットルを混ぜ、ゲル培地の6ミリリットルを作成するには、4×1.5mlのDMEMを濃縮し、蒸留水1ミリリットル。 - 500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。カウントトリパンブルー染色を用いて血球計数器を用いて細胞の数は、細胞生存率をチェックします。
- よく3.0×10 5細胞/（6.0×10 5細胞/ ml）の細胞密度を達成するために、ボリュームを調整し、穏やかに、しかしすぐにゲル化することなく、ピペットでそれを混合するためにゲル媒体を追加します。
- きちんとした円筒状の形を作るために迅速かつ慎重に、24ウェル、無処理プレートの各ウェルに混合物の0.5ミリリットルを分注します。任意の気泡がゲル（ 図1A）を汚染することを可能にしないように注意してください。
注：細胞を含むゲル培地は、粘性であり、容易に十分にゲル化し、フォームの三日月形することができます。 - 37℃の細胞インキュベーターで15分間プレートをインキュベートし、5％CO 2および95％湿度で完全にゲル化します。
- 1方向の周囲を描画する方法で滅菌スパチュラを移動することによって破壊することなく、プレートからゲルを外します。スパチュラを用いて、優しくを60mm組織培養皿にゲルを移しますTGF-β1を含むまたは含まないDMEM / 1％FBS（5ng / ml）およびTNF-α（10ng / mLの）の5 mlを含みます。
- ゆっくりゲルは媒体上に浮いていることを確認するために料理を振ります。 37℃、5％CO 2および95％湿度で、細胞インキュベーター中でインキュベートします。
ゲルサイズの5測定
- 画像解析システムを用いて、0、24、48、及び72時間後のコラーゲンゲルの大きさを測定します。
- ゲルドキュメンテーションシステム（ 図2A）をオンにし、遮光キャビネットに皿を置きます。そして、キャビネット内の皿の蓋を取ります。
- 関連するゲル解析ソフトウェアを開きます。キャビネット内のゲルの画像を表示するには、メニューバーにある「画像取得ボタン」をクリックしてください。そして、ゲル（ 図2B）の写真を撮るために、メニューバーの「取得」をクリックします。
- メニューバー（ 図2C）で「検出ボタン」をクリックして、測定領域（黄色の円の私を調整マウスをドラッグすることによりn個図2C）。次に、メニューバーの「自動検出ボタン」をクリックします（ 図2Dでボタンを参照してください）。ソフトウェアは自動的にヒートマップ（ 図2D）を示すゲルを検出します。
- 画像処理によりゲルの輪郭線を抽出し、アウトライン（ 図2E）で囲まれた領域を計算するために「OK」をクリックします。領域が計算された後、計算された領域は、別個のポップアップウィンドウに表示されています。
注：ゲルは、撮像中に重なる場合は、滅菌ピペットチップを用いて穏やかにゲルを移動します。
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Representative Results
EMTの間に、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーを失い、そのようなビメンチンおよびα平滑筋アクチン4,5などの間葉系マーカーの発現を得ることができます。 TGF-β1及びTNF-αとのA549ヒト肺上皮細胞のインキュベーションは、EMTを誘導します。通常のA549細胞の出現は、上皮細胞（ 図3A）の特徴である形状や三角形のような石畳ですが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、外観は間葉に似ている長い紡錘形に変更しました細胞（ 図3B）。
上皮および間葉系マーカーの発現は、細胞がEMTを受けたことを確認するために評価しました。相対的mRNA発現は、ΔΔCT法を用いて計算しました。個々のデータは、ハウスキーピングgであるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に対して正規化しましたエン。 TGF-β1と48時間TNF-αで処理されたA549細胞が有意CDH1の発現を減少し、大幅にVIMとACTA2（ 図4A）の発現を増加していました。 Q-PCRに用いたプライマー配列は表1に示されています。ビメンチン、N-カドヘリン、およびα平滑筋アクチンの発現は、 図4B、TGF-β1及びTNF-α弱毒化したE-カドヘリン発現による刺激に示すように誘導しました。
ゲル収縮アッセイは、EMTを受けた細胞の収縮性を評価しました。 TGF-β1及びTNF-αとのEMTを誘導した後、細胞がコラーゲンゲルにキャストし、TGF-β1及びTNF-α、またはPBSを含む培地中で72時間インキュベートしました。 図5Aに示すように、TGF-β1及びTNF-αで処理した細胞を含有するゲルは、PBSで処理した細胞を含む対照ゲルよりも小さかったです。資格へゲルサイズの変化ntify、ゲルは、ゲル解析0、24、48、及び処置後72時間を使用して分析しました。 72時間後、TGF-β1及びTNF-αで処理した細胞を含有するゲルの大きさは、対照ゲル（ 図5B）に比べて減少しました。我々はまた、単独でTGF-β1で処理した細胞を含有するゲルは、対照ゲルよりも小さかったが、TGF-β1及びTNF-α（データは示さず）で処理されたゲルよりも小さくないことを確認しました。
図1.ゲルを作製するための補足図。これらの画像は、井戸に投げ込まゲルを示します。細胞を含むゲル培地は、粘性であり、容易に十分に三日月形をゲル化し、フォームすることができます。 （A）左の画像は、ゲルが正しくキャストしていることを示している、と右画像は「ニートの円筒形」のスキーマを示しています。 （B </強い>）は左の画像は、ゲルが変形することを示し、そして右側の画像は、気泡がゲルを汚染することを示しています。 （C）ゲルは、そう簡単に損傷を受けたソフトであり、通常は「パックマン」のように変形する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ジェルのサイズを測定するための手順2.図。（A）のゲルドキュメンテーションシステムは、PCおよびゲルイメージングシステムで構成されています。 （B）「画像取得ボタン」、およびゲルの絵。 （C）「検出ボタン」、及び測定領域（黄色の円）を調整するためのウィンドウ。 （D）「自動検出ボタン」、およびソフトウェアは、画像からデにゲルのヒートマップを作りますゲルのアウトラインをTECT。 （E）は、ソフトウェアは、画像処理によりゲルの輪郭を抽出し、輪郭線で囲まれた領域を計算します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
EMT誘導性の細胞の図3.モルフォロジー。A549ヒト肺上皮は、6ウェルプレート中で1.0×10 5細胞/ウェルの密度で播種し、5 ngの/ mlのTGF-β1および10ng / mLの有無にかかわらずインキュベートしました。位相差顕微鏡イメージングに続いて48時間TNF-α、。 （A）及び（B）は、×200で得られた画像です。スケール（A）のバーと、（B）、100μmです。トン= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TGF-β1及びTNF-α図4. EMT刺激 。 EMTマーカー発現（CDH1、VIM、およびACTA2）の（A）定量RT-PCR分析。 （B）西E-カドヘリンの発現を示すブロット、N-カドヘリン、ビメンチン、およびTGF-β1及びTNF-αの有無にかかわらず刺激A549細胞における平滑筋アクチンタンパク質をα。 αチューブリンは、内部対照として使用しました。 A549細胞は、図1、N = 3の独立した実験のように培養しました。 ** P <0.01。エラーバーはSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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5.細胞受けEMT買収収縮図 。 A549細胞を10cmディッシュで1.0×10 6細胞/皿の密度でプレーティングし、5 ngの/ mlのTGF-β1と48時間10ng / mlのTNF-αの有無にかかわらずインキュベートしました。次いで、細胞を24ウェルプレートに/ウェル3.0×10 5細胞の密度で1.75 mg / mlでコラーゲンゲルを含む培地500μlに投げ込まれました。ゲル形成後、それらを60 mmディッシュ中に5ng / mlのTGF-β1および10ng / mLのTNF-αまたは含まない培地に添加して、画像（A）、続いて72時間インキュベートしました。ゲルのサイズは、画像分析システムを用いて0、24、48、及び72時間後に測定しました。 N = 9の独立した実験（B）。 ** P <0.01。エラーバーはSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 遺伝子名 | フォワード5 '→3' | 5 '→3'を逆に | ||
| ACTA2 | GCACCCAGCACCATGAAGA | ACCGATCCAGACAGAGTATTT | ||
| GAPDH | GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA | GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA | ||
| VIM | GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT | TTCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT | ||
| CDH1 | CCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAA | CTGTCACCTTCAGCCATCCTGTTT | ||
表1.プライマー配列。定量RT-PCRに用いたプライマー配列。 GAPDHを内部対照として使用しました。
| 溶解バッファー：RIPAバッファー | |
| 20mMのトリス塩酸pH7.5で | |
| 150mMのNaCl | |
| 1mMのEDTA | |
| 1％ポリオキシエチレン（9）octyiphenylエーテル | |
| 0.1％デオキシコール酸Na | |
| 0.1％SDS | |
| ブロッキングバッファー | |
| 洗浄緩衝液中の1％ブロッキング試薬 | |
| 洗浄緩衝液：TBST緩衝液 | |
| NaClを | 45グラム |
| 1 MトリスpHは7.4 | 50ミリリットル |
| ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート | 2.5ミリリットル |
| 水を蒸留 | 5 Lに追加 |
| 5 L |
表2.使用されるバッファの構成要素。溶解の成分を、ブロッキング緩衝液および洗浄緩衝液。
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Discussion
本研究で開発されたプロトコルは、2つのステップを含みます。最初のステップは、第二段階は、ゲル収縮アッセイがあるが、EMTを誘導するために行われます。それは、細胞がEMTを受けたことを確認することが重要であるので、ステップ2は、形態学的および遺伝子発現の変化に優れた補数を提供します。以前の研究は、A549細胞のEMTは、TGF-β1のみ24によって誘導されたことを示しました。我々は以前に10を報告しているようしかし、TNF-α処理は、EMTおよび間葉細胞マーカーの獲得を強化します。 TGF-β媒介EMTのメカニズムはSMAD依存25であると考えられています。 TNFαは、ゲル収縮の向上につながるTGF-β1によって誘導されるEMTを強化します。 TGF-β1によって誘導されるEMTの増強のためのTNFαのメカニズムはSMAD2リンカー領域の唯一のリン酸化ではないことが報告されているだけでなく、規制26 MAPKシグナル。そこで、本研究で開発したプロトコルはstimul含まTGF-β1及びTNF-αの両方によってエーション。
私はコラーゲンゲル、および媒体上にフローティングタイプにEMTを受けた細胞の埋め込みは、このアッセイ（ステップ4）の中心的な側面です。ゲルは柔らかく、簡単に破損しており、それぞれの側に異なる寸法を有しているため培地にゲルを適用し、それらのサイズを測定する際に、細心の注意が必要です。それがこのステップを行うことが困難である場合には60 mmディッシュ27,28にゲルを移動させることなく、ウェル中のゲルの大きさを測定するための代替方法があります。いくつかの一般的な問題がありますが、最初の問題は、コラーゲンゲルを簡単に室温でゲル化することであるので、ステップ4.7で述べたようにゲルはしばしば変形します。そのため、プレートを静かに彼らがきちんと円筒状の形を取ることを確認するウェルにゲルを鋳造後振とうする必要があります。第二の問題は、任意の気泡がゲル化時にゲルを入力した場合、その後、ゲルの大きさが不均一になるということです。任意の空気を許可しないように注意してくださいbubblゲルを汚染するエス。オリジナルの方法と、この方法の間には主に二つの違いがあります。最初の違いは、元のメソッドのコラーゲンゲルの最終濃度はミリリットル0.75ミリグラム/であるが、この方法とは、ゲルは、独自の方法で彼らがより大きく収縮することを可能にするために1.75 mg / mlであるということです。第二の違いは、元のメソッドは、ゲル浮動媒体用の無血清培地を使用することであるが、この方法は、細胞の収縮性を細胞生存率を維持し、維持するために、ゲル浮遊培地中で、1％FBSを使用しています。
もともと線維芽細胞用に開発されたゲル収縮アッセイは、創傷治癒および線維症13のプロセスに寄与する細胞の収縮性を評価するためのインビトロモデルにおける理想的です。 1型コラーゲンする線維芽細胞の付着は、結果的にコラーゲンゲルの大きさの減少をもたらす機械的な緊張を生成するようになっています。さらに、このアッセイは、最近使用されています気管支喘息およびCOPD 29-31を含む炎症性疾患における気道細胞の収縮を研究するためのin vitroモデル、など。
それは、特定のデバイスを必要とし、高い定量的な再現性を示していないという点でゲル収縮アッセイは、例えば、細胞移動アッセイなど他のアッセイに匹敵します。しかし、EMT 32を評価するためのゲル収縮アッセイを適用した報告は少ないです。この研究では、EMTを受けた細胞を含むゲルは、著しく細胞収縮を示し、ゲル化した後、24〜72時間の大きさの減少しました。この方法には限界があります。最初は、このアッセイにおいて、ゲルの大きさの変化は、ゲル中のすべての細胞の収縮の合計を示すことです。しかし、このアッセイを用いてゲル中で単一細胞収縮性を評価することは困難です。第二は、A549細胞が癌細胞株ではなく、正常なヒト上皮細胞であることです。したがって、O推定することは困難です肺線維症の病因に直接ウル結果。しかし、A549細胞は、広く、気道上皮細胞の機能を研究するために使用され、そしていくつかの研究は、肺線維症33,34のモデルとして、A549細胞を用いて、EMTの証拠が得られました。
要約すると、EMTを受けたIは、間葉系細胞を含むゲルを型コラーゲンは、これらの細胞の収縮を示す、サイズが減少しました。 EMTプロセスを通して細胞における収縮機能の獲得を評価するためのインビトロアッセイで拡張ようしたがって、ゲル収縮アッセイが考慮されるべきです。
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Disclosures
著者らは、開示する利害の競合がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3,000 dilution |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3,000 dilution |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10,000 dilution |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10,000 dilution |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1,000 dilution |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20,000 dilution |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20,000 dilution |
| Blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm Cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4× DMEM |
| Type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 Well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| Reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| Real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| Protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| Polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| Western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
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