Introduction
Fibrosis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades progresivas crónicas, como la enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis cardiaca, cirrosis hepática, insuficiencia renal terminal, la esclerosis sistémica, y las enfermedades autoinmunes 1. Entre las enfermedades pulmonares intersticiales, fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad progresiva crónica y muestra mal pronóstico. característica patológica de la IPF es el desarrollo de focos de fibroblasto que consiste en fibroblastos y miofibroblastos activados que están asociados con el pronóstico. Se proponen los orígenes de tales fibroblastos pulmonares que se derivan de varias células mesenquimales, incluyendo fibroblastos pulmonares residentes originalmente y que circulan fibrocitos de la médula ósea. Recientemente, se ha propuesto transición epitelio-mesenquimal (EMT) que se asocia con la formación de células mesenquimales 2, y para contribuir a la patogénesis de trastornos fibróticos.
Se cree que la EMT juega un papel importante en el proceso de desarrollo fetal, la cicatrización de heridas, y la progresión del cáncer, incluyendo la invasión tumoral y la metástasis 3. Tras el proceso de EMT, las células epiteliales obtener la capacidad de las células mesenquimales por la pérdida de marcadores epiteliales, tales como la E-cadherina, y por la expresión de marcadores mesenquimales, tales como la vimentina, y α-actina de músculo liso (SMA) 4,5. Estudios anteriores mostraron la evidencia de que proceso de EMT se ha asociado con el desarrollo de fibrosis de tejidos en el riñón y el pulmón 6 7. Además, la inflamación crónica promueve la enfermedad fibrótica 8; Además, las citoquinas inflamatorias tales como miembro de la superfamilia de factor de necrosis tumoral 14 (TNFSF14; LIGHT), factor de necrosis tumoral (TNF) -α, y la interleucina-1β, se ha demostrado para mejorar EMT 9-12.
ensayo de contracción de gel de colágeno, un ensayo de contracción de las células a base de colágeno en el que los fibroblastos se incrustan en el tipo Igel de colágeno tridimensional, es un ideal modelo in vitro para la evaluación de la contractilidad. La contractilidad es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas normal y fibrosis 13. En este ensayo, se cree que la unión de los fibroblastos para colágeno tipo I a través de mecanismos dependientes de integrina se supone para producir tensión mecánica bajo ciertas condiciones, y en consecuencia dar lugar a la contracción del tejido.
Aquí, se informa que el desarrollo del ensayo de contracción de gel que adaptarse para evaluar la adquisición de la función contráctil en las células que se sometieron a EMT. Este informe demuestra que este ensayo modificado es adecuado para la evaluación de la contractilidad de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.
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Protocol
1. Preparación y cultivo de células epiteliales de pulmón
- células epiteliales de pulmón humano A549 Cultura (línea de células adherentes) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Retirar y desechar el medio de cultivo celular de placa de cultivo, y se lava una vez con 5 - 10 ml de tampón fosfato salino (PBS). Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
- Añadir 2 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,05%) y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 3 min.
- Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contiene medio de cultivo de células, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g.
- Resuspender el pellet de células en 2 ml de medio de cultivo celular y retirar una muestra para el recuento de células. Contar el número de las células utilizando un hemocitómetro con tripán azul mancha para comprobar la viabilidad celular.
- células A549 semilla en10 placas de poliestireno cm a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 6 células / placa con 10 ml de medio para el ensayo de contracción de gel. Sembrar las células en placas de 6 pocillos de poliestireno a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 5 células / pocillo con 2 ml de medio para la confirmación de la EMT. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 horas.
2. Procedimiento de EMT
- Añadir 10 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 10 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para el ensayo de contracción de gel sembrado en el paso 1.6. Añadir 2 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 2 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para la confirmación EMT cabeza de serie en el paso 1.6. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 48 horas.
3. Confirmación de Procedimiento EMT por PCR y Western Blotting
- Confirmar cambio en la morfología (de similar a la piedra del adoquín al husillo forma) de las células tratadas utilizando microscopía de contraste de fase.
Nota: Normacélulas de Al A549 tienen adoquín apariencia similar a la piedra y de forma triangular que es una característica de las células epiteliales, pero después de la estimulación con TGF-β1 y TNF-α, las células aparecen de largo y en forma de huso que es similar a las células mesenquimales 14,15. - Evaluar la expresión de un marcador epitelial, tales como E-cadherina, y los marcadores mesenquimales tales como N-cadherina, vimentina y actina de músculo liso α-utilizando PCR o Western Blot.
- Extraer el ARN total de las células usando el kit de extracción de ARN 16 y sintetizar cDNA utilizando la transcriptasa inversa 17 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Medir la expresión de los niveles de mRNA utilizando el sistema de PCR en tiempo real 18 y tinte de cianina monomérica kit PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores específicos para GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (cadherina-1; E-cadherina) y VIM (vimentina) se muestran en la Tabla 1
- Lisar las células utilizando un tampón de lisis (Tabla 2) que contenía 1% de cóctel inhibidor de proteasa. Medir todas las concentraciones de proteína de la muestra utilizando un kit de ensayo de proteínas de 19,20, y aplicar las mismas cantidades de proteína en un gel de poliacrilamida.
- Realizar SDS-electroforesis en gel y transferencia semiseca de las proteínas a una membrana de PVDF 21. Incubar la membrana con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante 1 - 2 hr. Después de la incubación, lavar dos veces la membrana con tampón de lavado y se incuba la membrana hr 1 con segundos anticuerpos.
Nota: Véase la Tabla de Materiales / Equipo de anticuerpos y diluciones utilizadas en estos estudios. Véase la Tabla 2 para los componentes del tampón de bloqueo. - Lavar la membrana con tampón de lavado dos veces. Tome fotos de la membrana con el kit de detección de Western Blot 22 utilizando una cámara CCD de 11,23 frío.
- Realizar SDS-electroforesis en gel y transferencia semiseca de las proteínas a una membrana de PVDF 21. Incubar la membrana con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante 1 - 2 hr. Después de la incubación, lavar dos veces la membrana con tampón de lavado y se incuba la membrana hr 1 con segundos anticuerpos.
4. Gel Ensayo de contracción para la EMT Evaluación
- Aspirar el medio acondicionado desde el recipiente de cultivo de células, y lavar bien con 5 - 10 ml de PBS para eliminar las células muertas. Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
- Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 3 min.
- Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contienen DMEM complementado con inhibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g.
- Mezclar tipo gel 1 de colágeno con agua destilada, y 4 × DMEM concentrado para ajustar los volúmenes para lograr una concentración de colágeno de 1,75 mg / ml, y 1 × concentración DMEM. Asegúrese de mantener el medio de gel en hielo durante este paso.
Nota: Para hacer 6 ml de medio de gel, mezclar bien 3,5 ml de tipo 1 de gel de colágeno (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrado, y 1 ml de agua destilada. - Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS y extraer una muestra para recuento de células. Contarel número de las células utilizando un hemocitómetro con tinción de azul de tripano para verificar la viabilidad celular.
- Añadir el medio de gel de ajustar los volúmenes de lograr una densidad celular de 3,0 × 10 5 células / pocillo (6,0 × 10 5 células / ml) y suavemente pero rápidamente se mezcla mediante pipeteo sin gelificación.
- Dispensar 0,5 ml de la mezcla en cada pocillo de una placa no tratada de 24 pocillos de forma rápida y cuidadosamente para asegurarse de forma cilíndrica ordenada. Tenga cuidado de no permitir que las burbujas de aire que contaminan los geles (Figura 1A).
Nota: El medio de gel que contiene las células es viscoso y puede gelificar fácilmente y la forma de media luna forma en el pozo. - Incubar la placa durante 15 min en un incubador de células a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad a gel completamente.
- Separar los geles de la placa sin romper moviendo una espátula esterilizada de una manera para dibujar una circunferencia en una dirección. Usando una espátula, transferir suavemente los geles a placas de cultivo de tejidos de 60 mmque contiene 5 ml de DMEM / 1% de FBS con o sin TGF-β1 (5 ng / ml) y TNF-α (10 ng / ml).
- Agite con cuidado los platos para asegurar geles están flotando en el medio. Incubar en un incubador de células a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
5. Medición de Gel Tamaño
- Medir el tamaño de gel de colágeno después de 0, 24, 48, y 72 hr utilizando un sistema de análisis de imagen.
- Encienda el sistema de documentación de geles (Figura 2A), y poner los platos en el armario de protección contra la luz. A continuación, retire la tapa de platos en el armario.
- Abra el software de análisis relacionada gel. Haga clic en el botón "adquisición de imágenes" en la barra de menú para mostrar la imagen de los geles en el gabinete. A continuación, haga clic en "adquirir" en la barra de menú para tomar imágenes de los geles (Figura 2B).
- Haga clic en el botón "detección" en la barra de menús (Figura 2C) y ajustar la región de medición (i círculo amarillon Figura 2C) arrastrando el ratón. A continuación, haga clic en el botón "detectar automáticamente" en la barra de menú (véase el botón en la Figura 2D). El software detecta automáticamente los geles que muestran un mapa de calor (Figura 2D).
- Haga clic en "OK" para extraer el contorno de los geles de tratamiento de la imagen y calcular áreas rodeadas por el contorno (Figura 2E). Después se calcula el área, el área calculada se visualiza en la ventana emergente separada.
Nota: Si los geles se solapan entre sí durante la exploración, geles mueva suavemente con una punta de pipeta estéril.
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Representative Results
Durante la EMT, las células epiteliales pierden marcadores epiteliales, como E-cadherina, y obtener la expresión de marcadores mesenquimales, como la vimentina y α-actina de músculo liso 4,5. La incubación de células epiteliales de pulmón humano A549 con TGF-β1 y TNF-α induce EMT. La aparición de células A549 normales son de adoquín como la forma y la forma del triángulo que es una característica de las células epiteliales (Figura 3A), pero después de estimuladas con TGF-β1 y TNF-α, la apariencia cambia a forma de huso durante mucho tiempo que es similar a mesenquimales células (Figura 3B).
La expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales se evaluó para confirmar que las células se sometieron a EMT. la expresión del ARNm relativa se calculó con el método ΔΔCt. Los datos individuales se normalizó en contra deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH), que es un servicio de limpieza geno. Las células A549 tratadas con TGF-β1 y TNF-α por 48 hr habían reducido significativamente la expresión de CDH1 y aumentó significativamente la expresión de VIM y ACTA2 (Figura 4A). Las secuencias de los cebadores utilizados para q-PCR se muestran en la Tabla 1. Como se muestra en la Figura 4B, la estimulación con TGF-β1 y TNF-α expresión atenuada E-cadherina, mientras que la expresión de vimentina, N-cadherina, y actina de músculo liso α-fue inducida.
El ensayo de contracción de gel se realizó para evaluar la contractilidad de las células que se sometieron a EMT. Después de la inducción de la EMT con TGF-β1 y TNF-α, las células fueron lanzados en el gel de colágeno y se incubaron durante 72 horas en un medio que contiene el TGF-β1 y TNF-α, o PBS. Como se muestra en la Figura 5A, los geles que contienen células tratadas con TGF-β1 y TNF-α eran más pequeños que los geles de control que contienen las células tratadas con PBS. para quantify los cambios en el tamaño de gel, los geles se analizaron utilizando un analizador de gel 0, 24, 48, y 72 horas después de tratamiento. Después de 72 horas, los tamaños de geles que contienen células tratadas con TGF-β1 y TNF-α se redujeron significativamente en comparación con los geles de control (Figura 5B). También confirmó que los geles que contienen células tratadas con TGF-β1 solo eran más pequeños que los geles de control, pero no eran más pequeños que los geles tratados con TGF-β1 y TNF-α (datos no mostrados).
Figura 1. Figura complementario para hacer los geles. Estas imágenes muestran los geles emitidos en los pozos. El medio de gel que contiene las células es viscoso y puede gelificar y la forma de media luna en el formulario así de fácil. (A) La imagen de la izquierda muestra que los geles son fundidos correctamente y la imagen de la derecha muestra el esquema de "forma cilíndrica ordenada". (B </ Strong>) La imagen de la izquierda muestra que los geles se deforman, y la imagen de la derecha muestra que las burbujas de aire contaminan los geles. (C) Los geles son suaves, por lo dañan fácilmente y por lo general se deforman como "Pac-Man". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los pasos para medir el tamaño del gel. (A) El sistema de documentación de gel consiste en un PC y un sistema de imágenes de gel. El "botón de adquisición de imágenes" (B), y una fotografía de los geles. El "botón de detección" (C), y la ventana para el ajuste de la región de medición (círculo amarillo). El "botón de detección automática" (D), y el software hace un mapa de calor de los geles de una imagen a De proteger el contorno de los geles. (E) El software extrae el contorno de los geles de procesamiento de imágenes, y calcula zonas rodeadas por el contorno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. morfologías de células inducidas-EMT. A549 epitelios de pulmón humano se sembraron a una densidad de 1,0 x 10 5 células / pocillo en una placa de 6 pocillos y se incubaron con o sin 5 ng / ml de TGF-β1 y 10 ng / ml TNF-α por 48 hr, seguido de imágenes microscópicas de contraste de fase. (A) y (B) son imágenes obtenidas bajo × 200. Las barras de escala en (A) y (B), 100 micras. t = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Estimulación EMT con TGF-β1 y TNF-α. (A) QRT-PCR análisis de la expresión de marcadores de EMT (CDH1, VIM, y ACTA2). (B) Transferencia Western que muestra la expresión de E-cadherina, N-cadherina, vimentina, y la alfa actina del músculo liso proteínas en células A549 estimuladas con o sin TGF-β1 y TNF-α. α-tubulina se utilizó como control interno. Las células A549 se cultivaron como en la Figura 1. N = 3 experimentos independientes. ** P <0,01; barras de error representan el SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5. Las células que sufren EMT Adquirida la contractilidad. Las células A549 se sembraron a una densidad de 1,0 x 10 6 células / placa en placas de 10 cm y se incubaron con o sin 5 ng / ml de TGF-β1 y 10 TNF-α ml / ng por 48 hr. Las células fueron entonces echaron en 500 l de medio que contiene 1,75 mg de gel de colágeno / ml a una densidad de 3,0 x 10 5 células / pocillo en una placa de 24 pocillos. Después de la formación del gel, se añadieron a medio con o sin 5 ng / ml de TGF-β1 y 10 TNF-α ml / ng en placas de 60 mm y se incubaron durante 72 h seguido por formación de imágenes (A). tamaños del gel se midieron después de 0, 24, 48, y 72 hr utilizando un sistema de análisis de imagen. N = 9 experimentos independientes (B). ** P <0,01; barras de error representan el SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| gen Nombre | Delantero 5 '→ 3' | Revertir 5 '→ 3' | ||
| ACTA2 | GCACCCAGCACCATGAAGA | ACCGATCCAGACAGAGTATTT | ||
| GAPDH | GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA | GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA | ||
| EMPUJE | GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT | TTCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT | ||
| CDH1 | CCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAA | CTGTCACCTTCAGCCATCCTGTTT | ||
Tabla 1. Secuencias de los cebadores. Primer secuencias utilizadas para QRT-PCR. GAPDH se utilizó como control interno.
| Tampón de lisis: tampón RIPA | |
| mM Tris-HCl pH 7,5 20 | |
| NaCl 150 mM | |
| EDTA 1 mM | |
| 1% de polioxietileno (9) éter octyiphenyl | |
| 0,1% de Na-desoxicolato | |
| 0,1% de SDS | |
| tampón de bloqueo | |
| 1% de reactivo de bloqueo en tampón de lavado | |
| Tampón de lavado: tampón TBST | |
| NaCl | 45 g |
| 1 M Tris pH 7,4 | 50 ml |
| Polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán | 2,5 ml |
| destila el agua | añadir a 5 L |
| 5 L |
Tabla 2. Los componentes de tampones usados. Los componentes de la lisis, tampón de bloqueo y tampón de lavado.
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Discussion
El protocolo desarrollado en este estudio comprende dos etapas. La primera etapa se realiza para inducir EMT, mientras que el segundo paso es el ensayo de contracción de gel. Dado que es importante confirmar que las células se sometieron a EMT, el paso 2 proporciona un excelente complemento a los cambios en la expresión de genes y morfológicos. Estudios anteriores demostraron que la EMT de las células A549 fue inducida por sólo el 24 por TGF-β1; Sin embargo, como hemos informado anteriormente 10, el tratamiento con TNF-α aumenta la EMT y la adquisición de marcadores de células mesenquimales. Se piensa que los mecanismos de EMT mediada por TGF-β es Smad dependiente 25. TNFa aumenta la EMT TGF-β1 inducida que conduce a la mejora de la contracción del gel. Se ha informado de que los mecanismos de TNF para la mejora de EMT inducida por TGF-β1 no sólo son la fosforilación de Smad2 región de engarce, sino también MAPK regulación 26 de señalización. Por lo tanto, el protocolo desarrollado en este estudio incluyó stimulación tanto por TGF-β1 y TNF-α.
La incrustación de las células que se sometieron a EMT en el colágeno de tipo I gel, y flotan en el medio, son aspectos centrales de este ensayo (paso 4). Debido a que los geles son suaves y se dañan fácilmente, y tienen diferentes dimensiones de cada lado, se requiere mucho cuidado al aplicar los geles para el medio y medir sus tamaños. Si es difícil de llevar a cabo este paso, hay un método alternativo para medir los tamaños de gel en el pozo sin mover los geles en 60 mm plato 27,28. Existen varios problemas comunes, el primer problema es que los geles de colágeno gelificar fácilmente a temperatura ambiente, por lo que los geles a menudo se deforman como se ha mencionado en el paso 4.7. Por lo tanto, la placa debe agitarse suavemente después de emitir los geles en los pozos para asegurarse de que toman una forma cilíndrica ordenada. El segundo problema es que si las burbujas de aire entran en los geles durante la gelificación, entonces el tamaño de los geles será desigual. Tenga cuidado de no permitir que cualquier aire bubbles contaminen los geles. Hay dos diferencias principales entre método original y este método. Las primeras diferencias es que la concentración final de geles de colágeno de método original es 0,75 mg / ml, pero que de este método es 1,75 mg / ml con el fin de permitir que los geles se contraigan más de lo que lo hacen con el método original. Las segundas diferencias es que el método original utiliza medio libre de suero para el medio de gel flotante pero este método utiliza 1% de FBS en el medio flotante gel con el fin de mantener la viabilidad celular y mantener la contractilidad celular.
El ensayo de contracción gel desarrollado originalmente para los fibroblastos es un ideal modelo in vitro para la evaluación de la contractilidad de las células que contribuyen al proceso de cicatrización de heridas y fibrosis 13. La unión de los fibroblastos para colágeno tipo 1 se supone que producir tensiones mecánicas que por consiguiente conduce a una reducción en el tamaño de los geles de colágeno. Además, este ensayo se ha utilizado recientementecomo un modelo in vitro para el estudio de la contracción de las células de las vías respiratorias en las enfermedades inflamatorias, incluyendo el asma bronquial y EPOC 29-31.
El ensayo de contracción de gel es comparable a otros ensayos, tales como ensayos de migración celular, en que no requiere dispositivos específicos y exhibe una alta reproducibilidad cuantitativa. Sin embargo, hay pocos informes que soliciten el ensayo de contracción de gel para la evaluación de la EMT 32. En este estudio, los geles que contienen células que se sometieron a EMT disminuyeron significativamente en tamaño de 24 a 72 hr después de la gelificación, lo que indica la contracción celular. Sin embargo, existen limitaciones a este método. La primera es que en este ensayo, el cambio de tamaño de los geles muestran la suma de la contractilidad de todas las células en los geles. Sin embargo, es difícil de evaluar la contractilidad de células individuales en los geles utilizando este ensayo. La segunda es que las células A549 es una línea celular de cáncer, no las células epiteliales humanas normales. Por lo tanto, es difícil extrapolar our resultados directamente a la patogénesis de la fibrosis pulmonar. Sin embargo, las células A549 se usan ampliamente para estudiar las funciones de las células epiteliales de las vías respiratorias, y varios estudios proporcionaron evidencia de EMT mediante el uso de las células A549 como un modelo de fibrosis pulmonar 33,34.
En resumen, el colágeno tipo I geles que contienen células mesenquimales que sufrió EMT se redujeron en tamaño, lo que indica la contracción de esas células. Por lo tanto, el ensayo de contracción de gel debe ser considerada como un prolongado ensayo in vitro para evaluar la adquisición de la función contráctil en las células a través de proceso de EMT.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3,000 dilution |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3,000 dilution |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10,000 dilution |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10,000 dilution |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1,000 dilution |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20,000 dilution |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20,000 dilution |
| Blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm Cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4× DMEM |
| Type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 Well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| Reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| Real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| Protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| Polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| Western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
References
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