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Neuroscience

चारा के लिए पथ-लंबाई प्रोटोकॉल Published: April 23, 2016 doi: 10.3791/53980
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Toronto, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Child and Brain Development Program, Canadian Institute for Advanced Research

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा पथ लंबाई phenotype एक स्थापित व्यवहार बदलाव के लिए आनुवांशिक और पर्यावरणीय योगदान का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता उपाय है। लार्वा पथ लंबाई परख foraging व्यवहार है कि बाद में foraging जीन से जुड़े थे में व्यक्तिगत मतभेदों को मापने के लिए विकसित किया गया था। लार्वा पथ लंबाई एक आसानी से रन बनाए विशेषता है कि बड़ा नमूना आकार के संग्रह की सुविधा, कम से कम कीमत पर, आनुवंशिक स्क्रीन के लिए है। यहाँ हम पहले Sokolowski द्वारा इस्तेमाल किया लार्वा पथ लंबाई परख के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल विवरण कैसे reproducibly, परीक्षण पशुओं को संभालने के व्यवहार परख प्रदर्शन और डेटा का विश्लेषण करने के लिए। कैसे परख, पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में व्यवहार प्लास्टिसिटी को मापने के लिए खिला पर्यावरण से छेड़छाड़ के पहले परख प्रदर्शन से इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण है, यह भी प्रदान की जाती है। अंत में, उचित परीक्षण डिजाइन के साथ ही पर्यावरणीय कारकों को संशोधित कर सकते हैं किलार्वा पथ लंबाई इस तरह के भोजन की गुणवत्ता, विकास उम्र और दिन के प्रभाव के रूप में चर्चा कर रहे हैं।

Introduction

1910 में थॉमस हंट मॉर्गन की प्रयोगशाला में सफेद जीन की खोज के बाद से, फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (डी मेलानोगास्टर), विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के आणविक और शारीरिक आधार के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। डी की लोकप्रियता मेलानोगास्टर काफी हद तक काफी मात्रा और आनुवंशिक उपकरणों की विविधता से उपजा है। ड्रोसोफिला के छोटे आकार, हैंडलिंग और लघु पीढ़ी समय के सापेक्ष कम यह आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रस्तुत करना। समान रूप से महत्वपूर्ण phenotypes स्तनधारियों सहित अधिक जटिल जीवों द्वारा व्यक्त की कई प्रदर्शित करने के लिए ड्रोसोफिला की क्षमता है। इस तरह के व्यवहार के रूप में जटिल phenotypes कि जीव और अपने पर्यावरण के बीच इंटरफेस में खड़े भी शामिल है। फल मक्खी पर इस तरह के व्यवहार के अध्ययन कैसे जीन और पर्यावरण व्यवहार मध्यस्थता के बारे में हमारी समझ के लिए काफी योगदान दिया है के रूप में1।

डी के पहले अध्ययन में से एक मेलानोगास्टर लार्वा व्यवहार लार्वा 2 का पथ-लंबाई मापने जबकि खिलाने से लार्वा foraging रणनीतियों में व्यक्तिगत मतभेदों की जांच की। पथ लंबाई पांच मिनट की अवधि के भीतर, कुल दूरी खमीर पर एक भी लार्वा से कूच के रूप में परिभाषित किया गया था। टोरंटो में दोनों प्रयोगशाला तनाव और एक प्राकृतिक आबादी से मक्खियों उनकी foraging व्यवहार में विविध और पथ लंबाई में व्यक्तिगत मतभेदों को एक आनुवंशिक घटक वहां गया था। दो लार्वा foraging morphs मात्रात्मक पथ लंबाई वितरण से वर्णित किया गया है और वे रोवर और घर में रहनेवाला कहा जाता था। रोवर्स अब पथ-लंबाई का प्रदर्शन करते हुए sitters से एक खाद्य सब्सट्रेट पर एक बड़े क्षेत्र से गुजर रही है। इस मार्ग की लंबाई-परख का प्रयोग, डी बेले एट अल। 3 chromosome- 2 (24A3-24C5) पर foraging (के लिए) जीन एक असतत स्थान के लिए इन अलग-अलग व्यवहार मतभेद अंतर्निहित मैप किया। डी मीटरजीन के लिए elanogaster बाद में 4 क्लोन और एक cGMP निर्भर प्रोटीन काइनेज 5, शरीर विज्ञान और ड्रोसोफिला में व्यवहार और अन्य जीवों 6 के एक न्यूनाधिक होने का पता चला था।

यहाँ हम मूल रूप से Sokolowski 2 में विकसित लार्वा पथ लंबाई परख के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार। हालांकि परख के कुछ पहलुओं को पिछले कुछ वर्षों में बदल गया है, डिजाइन के पीछे की अवधारणा नहीं है। हम यह भी ड्रोसोफिला लार्वा की foraging व्यवहार में व्यक्तिगत मतभेदों को आनुवांशिक और पर्यावरणीय योगदान का आकलन करने के लिए परख की क्षमता वर्णन करने के लिए डेटा प्रदान करते हैं। लार्वा पथ लंबाई परख सरल, कुशल, और अभी तक मजबूत है। एक भी व्यक्ति को चार घंटे में आसानी से 500 लार्वा को जांच कर सकता है और परिणाम reproducibility के एक उच्च स्तर के साथ प्राप्त किया जा सकता है। मूलतः के लिए स्थानीय बनाना विकसित की है, यह आनुवंशिक स्क्रीन, मात्रात्मक विशेषता ठिकाना मानचित्रण में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पढ़ाई मेंजीन-से-पर्यावरण के (GxE) बातचीत। इसके अलावा, अपनी सादगी और reproducibility यह स्नातक शिक्षण के लिए एक महान स्रोत हैं।

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Protocol

1. लार्वा के संग्रह के लिए अंगूर प्लेट्स और होल्डिंग बोतलें तैयार

  1. पकड़े बोतलें बनाने के लिए, 6 आउंस मक्खी संस्कृति की बोतलें, काफी बड़े हवा की आपूर्ति के लिए एक मक्खी शीशी प्लग फिट करने के लिए (छवि। 1 डी) के एक तरफ में छेद में कटौती।
  2. अंगूर की प्लेटें बनाने के लिए, अगर, अंगूर का रस उबालकर अंगूर का रस मध्यम (1.8% अगर, 45% अंगूर का रस, 2.5% एसिटिक एसिड, 2.5% इथेनॉल) के 250 मिलीलीटर की तैयारी और पानी की सबसे अधिक है, 70 डिग्री सेल्सियस को शांत ( हलचल ठंडा करते हुए), तो एसिटिक एसिड और इथेनॉल जोड़ सकते हैं और पानी के साथ मात्रा के लिए ऊपर लाने के लिए।
  3. एक सिरिंज (सुई के बिना) का उपयोग 35 x 10 मिमी पेट्री डिश पलकों को भरने के लिए जब तक अंगूर का रस माध्यम की सतह ढक्कन (छवि। 1 ए) के होंठ के ऊपर एक गुंबद बना देता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नम और कंटेनर में स्टोर अंगूर प्लेटों उपयोग करें जब तक (2 सप्ताह की एक अधिकतम करने के लिए)।

2. खाद्य प्लेट्स की तैयारी

  1. मानक मक्खी भोजन नुस्खा तैयार करें।
    नोट: टी करने के लिए10% सूक्रोज, 1.3% अगर, 0.8% पोटेशियम सोडियम टार्ट्रेट, 0.1% monopotassium फॉस्फेट, 0.05% सोडियम क्लोराइड, 0.05% कैल्शियम क्लोराइड, 0.05% मैग्नीशियम क्लोराइड: पथ लंबाई पर स्था पालन भोजन की गुणवत्ता प्रभाव हम कम पोषक तत्व मक्खी भोजन के लिए इस्तेमाल किया 0.05% फेरिक सल्फेट, 5% खमीर और पानी में 0.5% propionic एसिड; और उच्च पोषक तत्व मक्खी भोजन: 1.5% सूक्रोज, 1.4% अगर, 3% ग्लूकोज, 1.5% cornmeal, 1% गेहूं के बीज, 1% सोया आटा, 3% गुड़, 3.5% खमीर, 0.5% propionic एसिड, 0.2% Tegosept और 1 पानी में% इथेनॉल। दोनों खाद्य पदार्थों के लिए propionic एसिड, Tegosept और इथेनॉल जोड़ने से पहले 50 ओ सी का हल और शांत आटोक्लेव।
  2. 100 x 15mm पेट्री डिश में मक्खी भोजन के 40 मिलीलीटर डालो।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नम और कंटेनर में स्टोर भोजन प्लेटों उपयोग करें जब तक (2 सप्ताह की एक अधिकतम करने के लिए)।

3. टेस्ट प्लेटें तैयार

  1. व्यास में 58 x 25 सेमी, 10, 1 मिमी गहरी परिपत्र कुओं के साथ 6 मिमी मोटी काली Plexiglas प्लेटें, 10 सेमी तैयार है और में एक 2 x 5 डी की व्यवस्था कीesign (छवि। 1 सी) पर लार्वा परीक्षण करने के लिए।
    नोट: 30 लार्वा अप करने के लिए एक समय में परीक्षण किया जा सकता है, तो 3 या ऊपर Plexiglas प्लेटों के अधिक उपलब्ध हैं। वैकल्पिक रूप से, लार्वा पेट्री डिश, व्यास में 10 सेमी में परीक्षण किया जा सकता है। यह विकल्प बहुत अधिक श्रमसाध्य है और परीक्षण किया जा करने के लार्वा की कम संख्या के लिए अनुमति देता है।
  2. Plexiglas परीक्षण प्लेटों पर खमीर पेस्ट के प्रसार के लिए एक काले रंग की 39 x 8 सेमी, 6 मिमी मोटी Plexiglas स्प्रेडर प्राप्त करते हैं।
  3. अग्रिम में नीचे से पलकों को अलग करके लार्वा पथ-लंबाई की रिकॉर्डिंग के लिए 100 x 15 मिमी पेट्री डिश पलकों तैयार करें।

4. माता पिता का आबादी की स्थापना

  1. के पालन की स्थिति पूरी परख के दौरान स्थिर रखें (जैसे, 25 डिग्री सेल्सियस, 60% नमी और एक 12:12 प्रकाश: मानक मक्खी भोजन पर अंधेरे चक्र)।
  2. एक ही पालन की स्थिति में अभिभावकों की आबादी उठाएँ।
  3. 150 महिलाओं और 50 - - 100 लीजिए 75 पुरुषों और इष्टतम उपजाऊपन के लिए 5 ± 1 दिनों के लिए उन्हें उम्र।
  4. एफ की अनुमति देंemales और पुरुषों मानक मक्खी भोजन के साथ एक 6 आउंस मक्खी संस्कृति बोतल में रात भर दोस्त के लिए।
  5. स्थानांतरण एक होल्डिंग बोतल में मक्खियों और एक अंगूर प्लेट (अंगूर प्लेट पर ताजा खमीर पेस्ट की एक छोटी राशि बिछाने अंडे को बढ़ावा देंगे।; छवि 1 बी) को सुरक्षित मास्किंग टेप (। अंजीर 1E) के साथ शीर्ष पर।
  6. छोड़ दो उल्टा (छवि। 1F), तल पर खड़े अंगूर की थाली के साथ बोतलों वयस्कों अंगूर थाली पर अंडे देना करने की अनुमति।
  7. 24 घंटे के बाद पहली बार अंगूर प्लेट त्यागें और पकड़े बोतल में एक नया अंगूर थाली जगह है। यह अंगूर प्लेट लार्वा अगले दिन एकत्र कर रहे हैं जिसमें से होगा।
    नोट: अंगूर की प्लेटें, स्थापित किया जा रहा है ताकि वे जल्दी अगले दिन साफ किया जा सकता प्लेटों की स्थापना के बाद लार्वा 22 घंटे की मंजूरी दे दी है (। उदाहरण के लिए, 12 बजे प्लेट की स्थापना की और 10 में स्पष्ट अगले दिन हूँ)। यह पहली बार अंगूर प्लेट त्यागने के लिए किसी भी अंडे है कि महिलाओं में रोक और Tha गया हो सकता है से बचने की सलाह दी जाती हैटी विकास में उन्नत किया जा सकता है।

5. अंगूर प्लेटों से एल 1 (प्रथम Instar) लार्वा लीजिए

  1. एक 60 x 15 मिमी पेट्री डिश में बोतलों 22 घंटे के बाद वे स्थापित किए गए थे और जगह से अंगूर प्लेटें निकालें।
  2. पकड़े बोतल पर ताजा खमीर पेस्ट के साथ एक नया अंगूर की थाली रखें।
  3. स्पष्ट और एक विदारक जांच का उपयोग वरीयता प्राप्त अंगूर की थाली से सभी लार्वा त्यागें।
  4. सेते मानक स्थितियों में 4 घंटे के लिए अंगूर प्लेटों को मंजूरी दे दी।
  5. 4 घंटे के बाद, अंगूर प्लेटों से तनाव प्रति 100 एल 1 लार्वा लेने और भोजन प्लेटों पर जगह है।
    1. भोजन धीरे पर लार्वा (खाद्य perforating और लार्वा दफन बिना) प्लेस और भोजन की थाली भर में लार्वा वितरण से भीड़ से बचें।
  6. खाद्य प्लेटें सेते हैं जब तक परीक्षण पशुओं भटक की शुरुआत से पहले लगभग 10 घंटा कर रहे हैं।
    नोट: - 96 घंटा के अंडे सेने के बाद 25 डिग्री सेल्सियस पर, 10 घंटा पहले आम तौर पर भटक 72 से मेल खाती है। exacऊष्मायन समय की टी राशि प्रत्येक तनाव के लिए लार्वा का एक आरंभिक सेट इकट्ठा करने और भटक के शुरू तक घंटों की संख्या की रिकॉर्डिंग के द्वारा प्रयोग शुरू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए (भटक लार्वा पक्षों और भोजन के ढक्कन पर भोजन से बाहर कदम होगा प्लेटों को)।
    नोट: यदि आवश्यक हो, एक ही माता-पिता के लिए 3 लार्वा इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - 5.5 करने के लिए कदम 4.7 दोहरा द्वारा परीक्षण के 4 दिनों के लिए। जिस क्रम में उपभेदों पथ लंबाई पर एक परीक्षण के आदेश के प्रभाव से बचने के लिए स्थापित किया है और दिन भर में परीक्षण कर रहे हैं बदलें। टेस्ट एक ही "नियंत्रण" तनाव / दिन प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए परीक्षण के प्रत्येक दिन उपभेदों।
  7. कई उपभेदों का परीक्षण कर रहे हैं, तो उचित समय बिंदु पर प्रत्येक तनाव के परीक्षण के लिए है पर बाद में अनुमति देने के लिए डगमगाते लार्वा के समय की स्थापना की और संग्रह।

6. लारवल पथ लंबाई टेस्ट

  1. 2 अनुपात (मात्रा के लिए वजन): एक 1 पर पानी में सूखी सक्रिय बेकर की खमीर भंग। समाप्त खमीर पेस्ट देहात की तुलना में पतली होना चाहिएncake बल्लेबाज, एक ही रास्ता है कि जब पेस्ट के बाहर एक चम्मच उठाने में, यह भरी और पेस्ट है कि जल्दी पिघल की सतह पर रिबन पीछे छोड़ देता है।
    नोट: खमीर पेस्ट की निरंतरता महत्वपूर्ण है और प्रयोग के दौरान स्थिर होना चाहिए। सटीक खमीर: पानी के अनुपात ब्रांड और खमीर के बैच के आधार पर समायोजित किया जा करने के लिए हो सकता है।
  2. धीरे लेने पहला तनाव के लार्वा भोजन की थाली एक पेंट ब्रश का उपयोग करने से परीक्षण किया जाना है।
  3. एक पेट्री डिश में लार्वा लीजिए और धीरे पानी से धो लें सभी खाद्य हटा दें।
    1. जल्दी धोने 1 के साथ लार्वा - एक प्रयोगशाला के साथ पानी के 2 मिलीलीटर और धीरे थपका लार्वा सूखी किसी भी पानी के हस्तांतरण जब परीक्षण प्लेट पर लार्वा को रखने से बचने के लिए साफ कर लें। तनाव से बचने के लिए, लार्वा नम लेकिन पानी में डुबोया नहीं रहते हैं।
  4. की ओर से तीन टेस्ट प्लेटों पक्ष की व्यवस्था है और प्रत्येक परीक्षा की थाली के लिए एक 5 मिनट के टाइमर सेट।
  5. परीक्षण प्लेटों के शीर्ष करने के लिए खमीर पेस्ट लागू करें और स्प्रेडर का उपयोग कर, एक पतली जब्री फैलप्रत्येक परीक्षा प्लेट ताकि सभी कुओं खमीर की एक भी परत पर खमीर पेस्ट की इंजी।
  6. धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक के केंद्र में एक लार्वा जगह है, एक थाली पर पहली लार्वा रखने के बाद 5 मिनट के टाइमर शुरू। नोट: तीन प्लेटें एक समय में किया जा सकता है, 30 / तनाव / परीक्षण के दिन का एक नमूना आकार उपज, 500 लार्वा की कुल करने के लिए।
  7. प्रत्येक के शीर्ष पर एक पेट्री डिश ढक्कन अच्छी तरह से रखें।
  8. जब सिपाही बाहर चलाता है, थाली से लार्वा को हटाने के बिना, एक स्थायी मार्कर का उपयोग पथ-लंबाई खमीर में पीछे छोड़ दिया अनुरेखण शुरू करते हैं। लार्वा के रूप में एक ही क्रम में ट्रेस पथ-लंबाई परीक्षण प्लेटों पर रखा गया था।
    1. उसी गति से ट्रेसिंग के रूप में लार्वा प्लेटों पर रखा गया प्रदर्शन करना। बाद में डेटा विश्लेषण में स्थिरता के लिए, सभी पथ-लंबाई के लिए एक ही मार्कर का उपयोग करें। स्थायी मार्कर की सिफारिश की है।
  9. दोहराएँ कदम 6.2 के लिए प्रत्येक तनाव परीक्षण किया जा करने के लिए 6.8.1। तुरंत देहात पर भुखमरी प्रभाव से बचने के लिए परीक्षण से पहले भोजन से प्रत्येक तनाव चुनेंवें लंबाई।

7. भोजन के अभाव

  1. लार्वा भोजन से वंचित परीक्षण करने से पहले हो सकता है, 6.2 6.3 करने के लिए कदम के रूप में वर्णित लार्वा इकट्ठा कर रहे हैं, लेकिन भोजन के अभाव समय के वांछित राशि पहले (उदा।, अगर लार्वा भोजन 4 घंटे के लिए वंचित हो रहे हैं, इससे पहले कि लार्वा 4 घंटा इकट्ठा परीक्षण समय)।
  2. दो समूहों में धोया लार्वा फूट डालो और 5 मिलीलीटर मानक भोजन के साथ एक पेट्री डिश में 5 मिलीलीटर 1% अगर और नियंत्रण समूह के साथ एक 60 x 15 मिमी पेट्री डिश में भोजन वंचित समूह जगह है।
  3. पेट्री डिश के उल्टे ढक्कन (अन्यथा लार्वा बाहर क्रॉल करने के लिए जब भोजन के लिए खोज पा रहे हैं) के शीर्ष पर एक वजन रखें।
  4. पहले से स्थापित भोजन के अभाव अवधि के लिए सेते हैं और कदम 6.9 करने के लिए 6.2 में वर्णित के रूप में परीक्षण के साथ आगे बढ़ें।
  5. कई उपभेदों का परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, भोजन के अभाव प्रारंभ होने के समय उचित समय बिंदु पर प्रत्येक तनाव के परीक्षण के लिए अनुमति देने के लिए डगमगाते।

8. डेटा विश्लेषण

नोट: इस खंड में, पथ-लंबाई के प्रसंस्करण के लिए ImageJ 7 या 8 फिजी का उपयोग कर डेटा के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन हालांकि अन्य सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. (पलकों इथेनॉल के साथ धोया जा सकता है और आगे पथ लंबाई रिकॉर्डिंग के लिए पुन: उपयोग) श्वेत पत्र को पेट्री डिश पलकों से सभी का पता लगाया पथ-लंबाई के हस्तांतरण के लिए एक प्रकाश तालिका का उपयोग करें।
  2. कागज की चादरों में से एक पर एक 50 मिमी सीधे संदर्भ लाइन ट्रेस।
  3. 300 डीपीआई के एक प्रस्ताव पर पथ-लंबाई स्कैन और बिटमैप या झगड़ा छवि फ़ाइलों के रूप में बचाने के लिए।
  4. छवि फ़ाइल खोलें, "प्रक्रिया" टैब> "बाइनरी"> "बाइनरी बनाओ" का चयन करें। फिर "प्रक्रिया" टैब के अंतर्गत, "बाइनरी"> "पांडुलेख" का चयन करें। यह पता लगाने की मोटाई की परवाह किए बिना, एक एक पिक्सेल चौड़ाई लाइन पैदा करता है।
  5. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक पथ लंबाई कोई क्रॉसओवर के साथ एक सतत एकल पंक्ति के रूप में प्रकट होता है।
  6. "सीधे ली उपयोग कर किसी भी चौराहों को अलग करेंne उपकरण की छड़ी "(अनुरेखण) उपकरण" और लाइन सफेद (पथ की निरंतरता के रंग के साथ की जाँच की जा सकती है ", पूरे पथ पीले प्रकाश डाला जाना चाहिए (छवि। 2)।
  7. "विश्लेषण" टैब> सेट माप का चयन करें और चुनें "परिधि" और "प्रदर्शन लेबल"।
  8. "विश्लेषण" टैब> "सेट पैमाने" का चयन करें और चुनें "पैमाने निकालें"।
  9. छवि पर, केवल संदर्भ लाइन का चयन करें, "विश्लेषण" टैब का चयन> "विश्लेषण कणों" और "दिखाएँ: रूपरेखा", "प्रदर्शन के परिणाम" और "स्पष्ट परिणाम तालिका"। नोट: उत्पादन 50 मिमी पैमाने लाइन के लिए इसी पिक्सेल की संख्या दिखाएगा।
  10. "विश्लेषण" टैब> "सेट पैमाने" का चयन करें और "पिक्सेल में दूरी" में पिक्सेल की संख्या और इसी दूरी (50 मिमी) "ज्ञात दूरी" में भरें।
  11. अंत में, एक जीनोटाइप एक के सभी पथ लंबाई चित्र का चयनटा समय, "विश्लेषण" टैब> "विश्लेषण कणों" का चयन करें और चुनें "दिखाएँ: रूपरेखा", "प्रदर्शन के परिणाम" और "स्पष्ट परिणाम तालिका"।
    1. क्षेत्र का चयन और यह सफेद भरने के द्वारा किसी भी लिखा लेबल या स्पष्ट बाहरी चिह्नों (वे पथ-लंबाई के रूप में मान्यता प्राप्त हो जाएगा) चयनित क्षेत्र के भीतर निकालें।
  12. दिखने में यह सुनिश्चित करने के परिधि सही ढंग से पता लगाया गया "रूपरेखा" आउटपुट फ़ाइल का निरीक्षण किया। उत्पादन चयन में प्रत्येक पथ लंबाई ड्राइंग के लिए मिमी में एक पथ लंबाई दिखाएगा। यह आसानी से एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात किया है और किसी भी सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जा सकता है।

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Representative Results

रोवर और उपभेदों के लिए घर में रहनेवाला और पथ-लंबाई पर भोजन के अभाव के प्रभाव के पथ लंबाई में अंतर छवि में सचित्र हैं। । रोवर्स sitters से आगे यात्रा के साथ; (छवि 3 ए। एफ (1,421) = 351.89, पी <2.20 x 10 -16), 3 डेटा परीक्षण के लगातार तीन दिनों से अधिक एकत्र एक महत्वपूर्ण तनाव प्रभाव दिखाया। , लार्वा के साथ कि खाद्य चार घंटे के परीक्षण से पहले वंचित थे, तनाव प्रभाव के अलावा, वहाँ भी एक महत्वपूर्ण खाद्य उपचार प्रभाव (। अंजीर 3 ए एफ (1, 421) = 461.62, पी <2.20 x 10 -16) था तंग आ गया लार्वा की तुलना में काफी कम पथ-लंबाई वाले। इसके अलावा, एनोवा उपचार बातचीत के द्वारा एक महत्वपूर्ण तनाव से पता चला है (एफ (1,423) = 9.78, पी = 2 x 10 -3), जिसका अर्थ है रोवर्स और sitters भोजन के अभाव के लिए विभिन्न विस्तार से जवाब दिया।

"Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> हालांकि यह भी ऊपर डेटा परीक्षण के दिन का एक महत्वपूर्ण प्रभाव (एफ (2,420) = 7.22, पी = 8 x 10 -4; छवि 3 बी - 3 सी।) से पता चला है कि वहाँ दिन बातचीत के द्वारा कोई महत्वपूर्ण तनाव (एफ (2846) = 2.32, पी = 0.10), जिसका अर्थ है कि दिन प्रभावित रोवर्स और sitters इसी तरह। फिर भी वहां उपचार बातचीत के द्वारा एक महत्वपूर्ण दिन (एफ (2,420) = 8.07, पी = 4.00 x था 10 -4), दिखा रहा है कि इलाज का असर दिन भर में विविध। भोजन की गुणवत्ता भी पालन पथ-लंबाई (छवि पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है। 4) था। कुल मिलाकर पथ-लंबाई अब जब दोनों नस्लों के लार्वा पर ​​पाला थे कम पोषक तत्व भोजन की तुलना में हमारे उच्च पोषक तत्व भोजन (एफ (1, 352) = 126.38, पी <2.20 x 10 -16)। रोवर-घर में रहनेवाला मतभेद हालांकि अभी भी लार्वा के पालन के दौरान भोजन की गुणवत्ता के बावजूद बनाए रखा गया (एफ (1, 352) = 94.89, पी <2.20 x 10 -16 )। डे प्रभाव जो महत्वपूर्ण थे (एफ (2, 351) = 3.77, पी = 0.024) सांख्यिकीय मॉडल में शामिल किया गया। इसके अलावा, वहाँ दिन बातचीत के द्वारा एक महत्वपूर्ण तनाव (एफ (1,704) = 7.15, पी = 9.00 x 10 -4), साथ ही दिन बातचीत (एफ (1,704) = 5.06, पी द्वारा एक महत्वपूर्ण खाद्य = 7.60 x 10 था - 3)।

अंत में, यह ध्यान दें कि रिश्तेदार रोवर-घर में रहनेवाला मतभेद दिन, भोजन की गुणवत्ता और भोजन के अभाव प्रभाव भर में महत्वपूर्ण थे महत्वपूर्ण है, लेकिन पूर्ण पथ लंबाई माप दिन और उपचार के बीच मतभेद है। इन परिणामों के विश्लेषण में केवल दिन के प्रभाव में लार्वा पथ लंबाई परख की मजबूती, लेकिन यह भी, पालन की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए परीक्षण के हर दिन पर ब्याज की हर तनाव / उपचार चलाने का महत्व है, और फैक्टरिंग रेखांकित नहीं।

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चित्रा 1. होल्डिंग बोतलें और परीक्षण प्लेट्स की तैयारी। (ए) अंडे बिछाने के लिए अंगूर प्लेटों मीडिया के एक चिकनी गुंबद फार्म के लिए रिम से ऊपर भरा जाना चाहिए। ताजा खमीर पेस्ट (बी) की एक छोटी राशि के अलावा अंडे बिछाने को बढ़ावा देता है। कुओं और स्प्रेडर में धार के साथ (सी) Plexiglas परीक्षण थाली। (डी) हवा की आपूर्ति के लिए में कटौती छेद के साथ संस्कृति बोतल से उड़ना। संस्कृति की बोतल के लिए माता-पिता की आबादी में परिवर्तित करने के बाद, अंगूर प्लेटों मास्किंग टेप (ई) के साथ उद्घाटन पर लगाया जाना चाहिए और बोतलों नीचे (एफ) में अंगूर की थाली के साथ तैनात किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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चित्रा पथ-लंबाई जहां लार्वा को अपने स्वयं के पथ पर पार कर दी है जटिल पथ लंबाई के निशान। 2. छवि विश्लेषण मैन्युअल चौराहे पर अलग किया जाना चाहिए एक भी सतत लाइन उत्पन्न करते हैं। (ए), तीन स्कैन पथ-लंबाई का एक उदाहरण दिखाता शीर्ष पथ लंबाई के चौराहे बिंदु पर एक लाल तीर की ओर इशारा करते हैं। (बी) एक ही पथ लंबाई ImageJ में संपादित चौराहे अलग करने के लिए दिखाता है। (सी) चौराहे के कारण पारस्परिक पथ लंबाई के उत्पादन, पथ 1 की परिधि के गलत आकलन के साथ परिधि ImageJ दिखाता है। (डी) cleaved चौराहे और पथ लंबाई 1. की परिधि के सही आकलन के साथ संपादित फ़ाइल का उत्पादन परिधि ImageJ शो कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. फेड और खाद्य वंचित रोवर और सम्भालने लारवल पथ-लंबाई मतलब लार्वा पथ लंबाई रोवर्स और sitters के लिए (± SEM के मिलीमीटर), प्रदर्शन है। (ए) लगातार तीन ओवर खिलाया और 4 घंटा भोजन से वंचित लार्वा के लिए जमा पथ-लंबाई परीक्षण के दिन, 105 <n <120; 38 <n <40 प्रति दिन ब दिन (बी) फेड लार्वा पथ-लंबाई; और (सी) 4 घंटा भोजन से वंचित दिन, 38 <n <40 से लार्वा पथ-लंबाई, प्रति दिन। डी चक्र: सभी लार्वा और माता-पिता को 25 डिग्री सेल्सियस, 60% नमी और एक 00:12 एल में कम पोषक तत्व भोजन पर पाला थे। परीक्षण समूहों और / या उपचार के बीच मतभेद (एनोवा) विचरण के विश्लेषण और बाद तदर्थ जोड़ो में कई तुलना के लिए Tukey की परीक्षा द्वारा मूल्यांकन किया गया। (ए) के लिए दिन के एक अवरुद्ध कारक मॉडल के लिए जोड़ा गया है। पत्र सांख्यिकीय समूहों का प्रतिनिधित्व है, इसी पत्र के साथ मतलब सी नहीं कर रहे हैंgnificantly अलग (पी <0.05)। फेड और एफडी खिलाया और 4 घंटा भोजन से वंचित स्थितियों के लिए खड़े हो जाओ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. खाद्य गुणवत्ता और लार्वा पथ-लंबाई। मतलब लार्वा पथ लंबाई रोवर्स और sitters, प्रदर्शन उच्च और कम पोषक तत्व भोजन पर हो लार्वा के पथ-लंबाई के लिए (± SEM के मिलीमीटर)। डेटा दिन के एक अवरुद्ध कारक सांख्यिकीय मॉडल के लिए जोड़ा साथ परीक्षण के लगातार तीन दिनों में जमा, 75 <n <90. सभी लार्वा और माता-पिता को 25 डिग्री सेल्सियस, 60% नमी और एक 12:12 पर कम या उच्च पोषक तत्व भोजन पर पाला थे एल: डी चक्र। परीक्षण समूहों और / या उपचार के बीच मतभेद (एनोवा) विचरण के विश्लेषण और बाद तदर्थ जोड़ो में multipl के लिए Tukey की परीक्षा द्वारा मूल्यांकन किया गयाई तुलना। पत्र सांख्यिकीय समूहों का प्रतिनिधित्व है, इसी पत्र के साथ मतलब है काफी अलग (पी <0.05) नहीं हैं। उच्च पोषक तत्व और कम पोषक तत्व भोजन की गुणवत्ता के लिए उच्च और निम्न खड़े हो जाओ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पथ लंबाई परख यहाँ रेखांकित ड्रोसोफिला लार्वा की foraging व्यवहार का एक मजबूत और सरल उपाय प्रदान करता है। प्रोटोकॉल सामान्य कार्यप्रणाली Sokolowski 2 में वर्णित इस प्रकार है, लेकिन जब से दक्षता और प्रयोगात्मक नियंत्रण के संबंध में सुधार किया गया है। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए इस विधि लार्वा पथ लंबाई मापने के लिए ही उपलब्ध विधि है। पथ लंबाई प्रोटोकॉल 2, 3, 15, खमीर पेस्ट की एक पतली परत एक ब्रश के साथ लागू किया, और बाद में एक गिलास छड़ी के प्रसार के साथ पेट्री डिश पर 16 परीक्षण किया लार्वा के मूल संस्करण। प्रोटोकॉल 10 से अधिक हाल के संस्करण, 17 यहाँ वर्णित Plexiglas प्लेट का उपयोग करने के लिए transitioned। पेट्री डिश और कांच स्प्रेडर का उपयोग खमीर की एक बहुत पतली परत है, जो बहुत लंबे पथ-लंबाई झुकेंगे और रोवर और घर में रहनेवाला phenotypes के बीच मतभेद का फायदा विकट प्रस्तुत किया। Plexiglas प्लेटों का उपयोग समग्र छोटा पथ लंबाई में हुई है, लेकिन roदेखें-घर में रहनेवाला मतभेद बनाए रखा है और समान रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे। हालांकि Plexiglas प्लेटों का उपयोग बहुत कम श्रमसाध्य है, अब पथ-लंबाई पेट्री डिश विधि के साथ प्राप्त रोवर और घर में रहनेवाला phenotypes के बेहतर जुदाई के लिए अनुमति दी, जीन 3 के लिए करने के लिए रोवर-घर में रहनेवाला अंतर का आनुवंशिक मानचित्रण सुविधा। पेट्री डिश के बजाय Plexiglas परीक्षण प्लेटें, और पथ लंबाई निशान के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के उपयोग विधि के बाद से प्रोटोकॉल के लिए किए गए बड़े बदलाव पहले विकसित किया गया था, और बहुत लार्वा की संख्या है कि एक ही व्यक्ति द्वारा परीक्षण किया जा सकता वृद्धि हुई है के साथ-साथ डेटा की गति का विश्लेषण करती है। हम भी कई प्रयोगात्मक और पर्यावरणीय कारकों पर हमारे ज्ञान में सुधार किया है कि कि परख, जिनमें से कुछ नीचे दिए गए हैं के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं।

सबसे पहले, इस परख एक foraging सब्सट्रेट (एक खमीर-पानी पेस्ट) पर पथ लंबाई व्यवहार में व्यक्तिगत मतभेदों को मापता है। उल्लेखनीय घइस परख में ifferences सामान्य लार्वा हरकत में दोषों से हो सकता है। यह समवर्ती गैर पोषक अगर प्लेटों पर लार्वा हरकत व्यवहार के लिए परख करने की क्रिया द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। तनाव मतभेद अगर प्लेटों पर रखा जाता है, तो यह है कि एक खमीर-पानी सब्सट्रेट पर पाया मतभेद व्यवहार विशिष्ट चारा नहीं कर रहे हैं कल्पना करने के लिए सुरक्षित है। यह पहले से दिखाया गया है कि जबकि एलील के लिए रोवर खमीर पर काफी लंबे समय तक प्रदान पथ-लंबाई, रोवर्स और sitters भोजन के अभाव में अलग नहीं है के रूप में वे अगर 9 के आधार पर इसी तरह लंबे पथ-लंबाई दिखा रहे हैं। इसके अलावा, क्योंकि लार्वा आम तौर पर भोजन, अगर प्लेटों पर कम या कोई आंदोलन पाने की अनुपस्थिति में उनकी हरकत को बढ़ाने के हरकत में दोष की संभावना संकेत है। जब व्यवहार foraging की जांच के बाद से खाद्य-स्वतंत्र आंदोलन दोष एक confounding चर के रूप में कार्य कर सकते हैं, अगर नियंत्रण आनुवंशिक स्क्रीन 10 में झूठी सकारात्मक कम कर सकते हैं। यह भी नोट करना महत्वपूर्ण है कि अगर LARVAE परीक्षण से पहले क्षतिग्रस्त हो गए थे, वे सब पर कदम नहीं हो सकता है। निश्चल, मृत या क्षतिग्रस्त लार्वा मुंह हुक आंदोलन को देख कर स्वस्थ लार्वा से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। किसी भी मुंह हुक आंदोलनों के बिना स्थिर लार्वा खारिज किया जाना चाहिए।

दूसरा, अन्य कार्यों के साथ के रूप में, लार्वा पथ लंबाई पर्यावरणीय कारकों पर विचार किया और नियंत्रित किया जा सकता है जब इस परख के प्रदर्शन के लिए जरूरत है कि से प्रभावित हो सकते हैं। पर्यावरण पथ लंबाई को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है कारकों पालन तापमान, आर्द्रता, भोजन की गुणवत्ता, पालन घनत्व, खमीर पेस्ट मोटाई, दिनों के बीच बेतरतीब मतभेद, और लार्वा की हैंडलिंग शामिल हैं। परीक्षण के समय में लार्वा विकास और उम्र भी पथ लंबाई 11 प्रभावित करते हैं। चित्र में दिखाया गया है। 4, कम गुणवत्ता वाले भोजन में लार्वा को ऊपर उठाने के पथ लंबाई कम हो जाती है। मक्खी भोजन इस प्रोटोकॉल के लिए या किसी अन्य मृत खमीर नुस्खा है कि उसके पोषण सामग्री में बराबर है में वर्णित व्यंजनों में से एक का उपयोग की सिफारिश की है। यह भी sugge हैहमेशा 100 लार्वा के साथ भोजन प्लेटों बोने और भोजन पर समान रूप से उन्हें बाहर रिक्ति द्वारा उच्च या निम्न घनत्व पालन वातावरण से बचने के लिए sted। उच्च घनत्व में लार्वा पालन भोजन की उपलब्धता को सीमित करता है और लार्वा विकास है, जो परीक्षण 12 के समय में लार्वा के बीच विकास में अंतर कर सकते हैं परिणाम में देरी। कम घनत्व के पालन की स्थिति भी विकास को प्रभावित कर सकते हैं के बाद से ड्रोसोफिला लार्वा नीचे भोजन को तोड़ने और सफलता के 13 foraging बढ़ाने के लिए सामाजिक foraging समूहों के रूप में हो सकती है। जब म्यूटेशन कि लार्वा आकार को प्रभावित के साथ लार्वा यत्न कर रहे हैं, यह लार्वा शरीर की लंबाई या परिधि के एक समारोह के रूप में पथ-लंबाई की गणना के द्वारा इन प्रभावों के लिए खाते में करने के लिए आवश्यक हो सकता है। सभी मामलों में ऐसा नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लार्वा चरण भटक जब वे परीक्षण किया जा रहा है में संक्रमण नहीं किया है महत्वपूर्ण है। लार्वा परीक्षण के दौरान पेट्री डिश ढक्कन पर ऊपर ले जाते हैं, यह संभावना है कि वे भटक रहे हैं और प्रयोग के त्याग और छोटी ला के साथ दोहराया जाना चाहिएrvae।

उल्लेख के लायक एक और पहलू है खमीर पथ लंबाई परीक्षण में इस्तेमाल पेस्ट की निरंतरता यह लार्वा के रेंगने की गति को प्रभावित करता है के बाद से है। लार्वा एक मोटी खमीर पेस्ट पर परीक्षण के लिए एक अधिक जलीय खमीर पेस्ट पर परीक्षण किया गया लार्वा की तुलना में कम पथ-लंबाई होगा। इसके अलावा, परीक्षण दिनों के बीच मतभेद स्टोकेस्टिक भी निरपेक्ष पथ लंबाई स्कोर प्रभावित। यह आदेश है, जिस पर उपभेदों / जीनोटाइप दिनों के भीतर परीक्षण कर रहे हैं और उन्हें कुछ दिनों के बीच ब्लॉक करने के लिए randomize करने के लिए आवश्यक है। अंत में, देखभाल लार्वा पथ लंबाई परीक्षण करने से पहले तनाव नहीं लिया जाना चाहिए। दो तनाव है कि आमतौर से निपटने के माध्यम से पेश कर रहे हैं भुखमरी और डूब रहे हैं। चित्र में दिखाया गया है। 3, परीक्षण करने से पहले भूख से मर लार्वा कम हो जाती है पथ लंबाई, और हालांकि भुखमरी एक पर्यावरण हेरफेर के रूप में पेश किया जा सकता है, इसके अनजाने घटना से बचा जाना चाहिए। बल देते लार्वा धीरे लेकिन जल्दी से काम कर रहा है, इस प्रकार समय सपा की मात्रा सीमित करने से बचा जाना चाहिएईएनटी, एकत्रित की सफाई, और लार्वा स्थानांतरित। लार्वा प्रदर्शनी नकारात्मक phototaxis 14 के बाद से, तीव्र प्रकाश भी एक तनाव के रूप में कार्य कर सकते हैं और यहां तक कि परख, फैलाना प्रकाश व्यवस्था के तहत किया जाना चाहिए। कई पर्यावरणीय कारकों है कि पथ लंबाई बदल सकते हैं के बावजूद, यह ध्यान दें कि हालांकि निरपेक्ष पथ लंबाई स्कोर पर्यावरण की स्थिति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, तनाव के बीच सापेक्ष मतभेद रखा जाता है जब सभी व्यक्तियों को समान रूप से व्यवहार कर रहे हैं महत्वपूर्ण है।

सटीकता, दक्षता और मात्रा का ठहराव में मजबूती आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि व्यवहार मध्यस्थता को समझने के उद्देश्य से अध्ययन के दिल में हैं। ड्रोसोफिला लार्वा पथ लंबाई परख कम लागत, उच्च throughput, और प्रदर्शन करने के लिए आसान होने के अलावा इन फायदों के सभी प्रदान करता है। जैसे, इस परख व्यापक रूप से आनुवंशिक स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता व्यवहार प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े आणविक और आनुवंशिक रास्ते की पहचान करने के लिए। एक इसके अलावा, परख हो सकता हैविषाक्तता परीक्षण या औषधीय स्क्रीन करने के लिए pplied, या कक्षा में पढ़ाने के लिए अनुकूलित।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 oz fly culture bottles  Fisher Scientific  AS355 
Fly vial plugs Droso-Plugs 59-201
35 x 10 mm Petri dishes  Falcon 351008
100 x 15 mm Petri dishes  Fisher 875712
60 x 15 mm Petri dishes VWR 25384-168 
Dissecting probes Almedic 2325-58-5300 
Yeast Lab Scientific FLY-8040-20F

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References

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Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 110, व्यवहार आनुवंशिकी लार्वा चारा पोषक तत्व निर्भर हरकत प्लास्टिसिटी
चारा के लिए पथ-लंबाई प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; लार्वा
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Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, … More

Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, A. M., Sokolowski, M. B. Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (110), e53980, doi:10.3791/53980 (2016).

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