Abstract
Drosophila melanogaster larver väg längd fenotyp är ett etablerat mått som används för att studera de genetiska och miljömässiga bidrag till beteende variation. Larv assay path-längd utvecklades för att mäta individuella skillnader i födosöksbeteende som senare kopplad till födosök genen. Larver väg-längd är ett enkelt mål drag som underlättar insamling av stora provstorlekar, till en minimal kostnad, för genetiska skärmar. Här ger vi en detaljerad beskrivning av det nuvarande protokollet för larvanalysvägen längd användes först av Sokolowski. Protokollet beskriver hur reproducerbart hantera försöksdjur, utföra beteendeanalys och analysera data. Ett exempel på hur analysen kan användas för att mäta beteende plasticitet som svar på miljöförändringar, genom att manipulera mata miljö innan analysen utförs, finns också. Slutligen, lämpliga testdesign samt miljöfaktorer som kan ändralarver väg längd såsom livsmedelskvalitet, utvecklings ålder och dag effekter diskuteras.
Introduction
Sedan upptäckten av den vita genen i Thomas Hunt Morgan laboratorium 1910 har bananflugan, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), använts som en modell för att studera de molekylära och fysiologiska grunderna för olika biologiska processer. Populariteten av D. melanogaster till stor del härrör från den stora mängd och variation av genetiska verktyg. Drosophila lilla storlek, relativt enkel hantering och kort generationstid gör det till en idealisk modell för genetik studier. Lika viktigt är Drosophila förmåga att visa många av de fenotyper som framförts av flera komplexa organismer inklusive däggdjur. Detta inkluderar komplexa fenotyper såsom beteende som står i gränssnittet mellan organismen och dess omgivning. Som sådan, beteendestudier på bananfluga har bidragit avsevärt till vår förståelse av hur gener och miljö medla beteende1.
En av de första studierna av D. melanogaster larver beteende undersökte individuella skillnader i larv söker föda strategier genom att mäta väg-längder av larver 2 medan utfodring. Väg-längd definierades som den totala tillryggalagd sträcka av en enda larv på jäst, inom en fem minuters period. Både laboratoriestammar och flugor från en naturlig population i Toronto varierade i sina födosök beteenden och det fanns en genetisk komponent till individuella skillnader i väg-längd. Två larvbetes formerna beskrevs från de kvantitativa väg längd fördel och de kallades Rover och sitter. Rovers uppvisar längre väg-längder medan korsa en större yta samtidigt på en livsmedelssubstrat än sitters. Med hjälp av denna väg-längd-analys, de Belle et al. 3 kartlagt födosök (för) genen bakom dessa individuella beteendemässiga skillnader till en diskret plats på chromosome- 2 (24A3-24C5). D. melanogaster för genen senare klon 4 och visar sig vara en cGMP-beroende proteinkinas 5, en modulator för fysiologi och beteende i Drosophila och andra organismer 6.
Här redogör vi det nuvarande protokollet för larvanalysvägen längd som ursprungligen utvecklades i Sokolowski 2. Även om vissa aspekter av analysen har förändrats under åren, har konceptet bakom designen inte. Vi tillhandahåller även data för att illustrera analysens möjlighet att bedöma genetiska och miljömässiga bidrag till individuella skillnader i födosöksbeteende Drosophila larver. Larver analysvägen längd är enkel, effektiv och robust. En enda person kan testa upp till 500 larver med lätthet i fyra timmar och resultat kan erhållas med en hög grad av reproducerbarhet. Utvecklades ursprungligen för att lokalisera för det kan användas i genetiska skärmar, kvantitativa drag locus kartläggning, och i studierav gen-för-miljö (GXE) interaktioner. Dessutom, dess enkelhet och reproducerbarhet gör det en stor resurs för grundutbildningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered druvor tallrikar och hålla flaskor för insamling av larver
- För att göra hålla flaskor, skär hål i ena sidan av 6 oz flyga odlingsflaskor, tillräckligt stor för att passa en fluga flaska plugg för lufttillförsel (Fig. 1D).
- För att göra druvplattor, förbereda 250 ml druvsaft medium (1,8% agar, 45% druvsaft, 2,5% ättiksyra, 2,5% etanol) genom kokning av agar, druvsaft och det mesta av vattnet, svalna till 70 ° C ( rör under kylning), lägg sedan till ättiksyra och etanol och ta upp till volym med vatten.
- Använda en spruta (utan nål) för att fylla 35 x 10 mm petriskål lock tills ytan av druvsaft mediet gör en kupol ovanför läppen hos locket (Fig. 1A).
- Store druv plattor i en fuktig och lufttät behållare vid 4 ° C fram till användning (upp till maximalt 2 veckor).
2. Beredning av livsmedel plattor
- Bered standardrecept flyga mat.
Obs! För att test uppfödning livsmedelskvalitet effekter på path-längd vi använt låg näringsämne fluga mat: 10% sackaros, 1,3% agar, 0,8% kaliumnatriumtartrat, 0,1% monokaliumfosfat, 0,05% natriumklorid, 0,05% kalciumklorid, 0,05% magnesiumklorid, 0,05% ferrisulfat, 5% jäst och 0,5% propionsyra i vatten; och högt näringsinnehåll flyga mat: 1,5% sackaros, 1,4% agar, 3% glukos, 1,5% majsmjöl, 1% vetegroddar, 1% sojamjöl, 3% melass, 3,5% jäst, 0,5% propionsyra, 0,2% Tegosept och en % etanol i vatten. För båda livsmedel autoklav lösningen och kyl till 50 ° C före tillsats av propionsyra, Tegosept och etanol. - Häll 40 ml av flyg mat i 100 x 15mm petriskålar.
- Lagra mat plattor i en fuktig och lufttät behållare vid 4 ° C fram till användning (upp till maximalt 2 veckor).
3. Bered testplattorna
- Förbered 58 x 25 cm, 6 mm tjocka svarta plexiglas plattor med 10, 1 mm djupa cirkulära brunnar, 10 cm i diameter och anordnade i en 2 x 5 design (Fig. 1C) för att testa larver på.
Obs: Upp till 30 larver kan testas på en tid om tre eller flera av ovanstående plexiglasplattorna finns. Alternativt kan larver testas i petriskålar, 10 cm i diameter. Detta alternativ är mycket mer arbetskrävande och möjliggör lägre antal larver som skall testas. - Skaffa en svart 39 x 8 cm, 6 mm tjocka plexiglas spridare för att sprida jäst pasta på plexiglasprovplattorna.
- Förbered 100 x 15 mm petriskål lock för inspelning larv väg längder genom att separera lock från bottnar i förväg.
4. Konfigurera Föräldra populationer
- Håll uppfödningsförhållanden konstant genom hela analysen (t ex 25 ° C, 60% luftfuktighet och en 12:12 ljus: mörker-cykel på standard fluga mat).
- Höj föräldra befolkningen i samma uppfödningsförhållanden.
- Samla 100 - 150 kvinnor och 50 - 75 män och ålder dem för 5 ± 1 dagar för optimal fruktsamhet.
- Tillåt females och hanar att para natten i en 6 oz flyga odlingsflaska med standard fluga mat.
- Transfer flyger in i en håll flaska och säkra en druva platta (en liten mängd färsk jäst klistra på druvan plattan kommer att främja äggläggning, fig. 1B) over the top med maskeringstejp (Fig. 1E).
- Lämna flaskor står upp och ned (Fig. 1F), med druvplattan längst ner för att ge vuxna att lägga ägg på druvan plattan.
- Kasta den första druvan plattan efter 24 timmar och placera en ny druva platta i innehavet flaskan. Detta kommer att vara druvplattan som larver samlas nästa dag.
Obs: Grape plattor måste rensas larver 22 timmar efter att inrättas, inrätta plattor så att de kan avslutas tidigt nästa dag (. T.ex. inrätta plattan vid 12:00 och klart vid 10 am nästa dag). Det är lämpligt att göra den första druvan plattan för att undvika eventuella ägg som honor skulle ha varit undanhålla och that kan föras framåt i utvecklingen.
5. Samla L1 (första Instar) Larver från Grape Plates
- Ta bort druvplattor från flaskor 22 timmar efter att de sattes upp och lägg i en 60 x 15 mm petriskål.
- Placera en ny druva platta med färsk jäst pasta på anläggningen flaskan.
- Rensa och kassera alla larver från seedade druvplattan med en dissekera sond.
- Inkubera rensas druv plattor för fyra timmar i standardförhållanden.
- Efter 4 timmar, plocka 100 L1 larver per stam från druv tallrikar och placera på livsmedel plattor.
- Placera larver på maten försiktigt (utan att perforera mat och begrava larverna) och undvika trängsel genom att distribuera larverna över tallriken.
- Inkubera mat plattor tills försöksdjur är ungefär 10 timmar innan vandring.
Obs: Vid 25 ° C, 10 timmar innan vandrade allmänt motsvarar 72-96 timmar efter kläckning. den exact mängden inkubationstid bör bestämmas innan försöket genom att samla en första uppsättning av larver för varje stam och registrering av antalet timmar fram till början av vandrande (vandrande larver kommer att flytta ut ur maten på sidorna och lock i livsmedels plattor).
Obs: Om det behövs, kan samma föräldrar användas för att samla larver i 3 - 4 dagar av att testa genom att upprepa steg från 4,7 till 5,5. Ändra den ordning som stammar sätts upp och testas över dagar för att undvika ett test för effekt på väg-längd. Testa samma "kontroll" stam / stammar varje testdag för att styra för dagen effekter. - Om många stammar testas, vackla de inrättas och insamlingstiderna för larverna att möjliggöra testning av varje stam på lämplig tidpunkt senare.
6. Larv Path längd Test
- Lös upp torr-aktivt bagerijäst i vatten vid en 1: 2-förhållande (vikt till volym). Den färdiga jäst pasta bör vara tunnare än pancake smet, på ett sätt som vid lyft en sked ur pastan, droppar det och lämnar efter sig band på ytan av pastan som snabbt smälta bort.
Notera: Konsistensen på jäst pasta är viktig och bör vara konstant under hela experimentet. Den exakta jäst: vattenförhållandet kan behöva justeras beroende på märke och parti jäst. - plocka försiktigt larver av första stammen som skall testas från tallriken med hjälp av en pensel.
- Samla larver i en petriskål och försiktigt tvätta med vatten för att avlägsna all mat.
- Snabbt tvätta larver med 1 - 2 ml vatten och försiktigt sandskädda larver torrt med ett laboratorium torka att undvika att överföra något vatten när du placerar larverna på testplattan. För att undvika stress, hålla larver fuktig men inte nedsänkt i vatten.
- Ordna tre testplattorna sida vid sida och ställa in en 5 min timer för varje testplatta.
- Tillämpa jäst pasta till toppen av provplattorna och med hjälp av spridaren, sprida ett tunt layer av jäst pasta på varje testplatta, så att alla brunnar har ett jämnt lager av jäst.
- Placera försiktigt en larv i mitten av varje brunn med början 5 min timer efter placering av första larverna på varje platta. Obs: Tre plattor kan göras vid en tidpunkt, vilket gav en provstorlek av 30 / stam / prov dag, upp till totalt 500 larver.
- Placera en petriskål lock på toppen av varje brunn.
- När tiden är ute, utan att ta bort larverna från plattan, börja spåra väg längder kvar i jäst med hjälp av en permanent markör. Spår väg-längder i samma ordning som larver placerades på testplattorna.
- Utför spårning med samma hastighet som larver placerades på plattorna. För konsekvensens senare dataanalys, använder samma markör för alla väg-längder. Permanent markör rekommenderas.
- Upprepa steg 6,2 till 6.8.1 för varje stam som skall testas. Välj varje stam från maten omedelbart före testning för att undvika svält effekter på PAth-längd.
7. brist på mat
- Om larver är att vara mat berövade före testning, samla larver som beskrivs i steg 6,2 till 6,3, men den önskade mängden mat berövande tid tidigare (eg., Om larver ska mat berövade under 4 timmar, samla larver fyra timmar innan testtid).
- Dela tvättades larver i två grupper och placera maten berövade grupp i en 60 x 15 mm petriskål med 5 ml 1% agar och kontrollgruppen i en petriskål med 5 ml standard livsmedel.
- Placera en vikt på toppen av det inverterade locket av de petriskålar (annars larver har möjlighet att krypa ut när man söker efter maten).
- Inkubera i den tidigare etablerade brist på mat period och fortsätta med tester som beskrivs i steg 6,2 till 6,9.
- Om många stammar är som skall testas, stagger maten deprivation starttider för att möjliggöra provning av varje stam vid lämplig tidpunkt.
8. Dataanalys
Obs: Det här avsnittet beskriver en metod för dataanalys med hjälp av ImageJ 7 eller Fiji 8 för bearbetning av väg-längder, även om andra program kan användas.
- Använd ett ljusbord för att överföra alla spåras väg längder från petriskålen lock vitt papper (lock kan tvättas med etanol och återanvändas för ytterligare inspelning väg-längd).
- Spåra en 50 mm rak referenslinje på en av pappersarken.
- Skanna väg-längder med en upplösning på 300 dpi och spara som bitmap eller TIFF-bildfiler.
- Öppna bildfilen, välj "Process" fliken> "Binary"> "Gör binär". Sedan under "Process", välj "Binary"> "Skeletonize". Detta ger en pixelbredd linje, oavsett tjocklek på spår.
- Se till att varje bana längd visas som en kontinuerlig enda rad utan korsningar.
- Separera eventuella korsningar med "Straight line funktionen "och färg linjen vita (kontinuitet av banan kan kontrolleras med" Wand "(spårning) verktyg, bör hela sökvägen markeras gul (Fig. 2).
- Välj "Analysera" fliken> Set mätningar och välj "Perimeter" och "Display label".
- Välj "Analysera" -fliken> "Set skala" och välj "Ta bort skala".
- På bilden, välj referenslinjen endast välja "Analyse" -fliken> "Analysera partiklar" och välj "Visa: konturer", "Visa resultat" och "Tydliga resultat bord". Obs: Utgången visar antalet pixlar som motsvarar 50 mm skala linje.
- Välj "Analysera" -fliken> "Set skala" och fyll i antal pixlar i "Avstånd i bildpunkter" och motsvarande avstånd (50 mm) i "kända avstånd".
- Slutligen, välj alla väg-längd ritningar av en genotyp en deta tid, välj "Analyse" -fliken> "Analysera partiklar" och välj "Visa: konturer", "Visa resultat" och "Tydliga resultat bord".
- Ta bort eventuella skriftliga etiketter eller uppenbara yttre markeringar (de kommer att erkännas som väg-längder) inom det markerade området genom att välja område och fylla den vit.
- Inspektera "konturer" utdatafil för att säkerställa att omkrets var korrekt fastställas. Utgången kommer att visa en väg-längd i mm för varje väg-längd ritning i valet. Detta kan enkelt exporteras till ett kalkylblad och analyseras med någon statistisk programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skillnader i väg-längd rover och sitter för stammar och effekten av brist på mat på väg-längd visas i fig. . 3 Data samlas under tre på varandra följande dagar av tester visade en signifikant stam effekt (F (1421) = 351,89, p <2,20 x 10 -16, fig. 3A), med rovers reser längre än sitters. Förutom stammen effekten, det fanns också en signifikant behandlingslivsmedels effekt (F (1, 421) = 461,62, p <2,20 x 10 -16, fig. 3A), med larver som mat berövade under fyra timmar före testning har betydligt lägre bana längder än matas larver. Dessutom ANOVA visade en signifikant påfrestning genom interaktion behandling (F (1423) = 9,78, p = 2 x 10 -3), vilket innebär Rovers och barnvakter svarade på brist på mat i olika utsträckning.
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Även om ovanstående data visade också en signifikant effekt av testdagen (F (2420) = 7,22, p = 8 x 10 -4, Fig 3B - 3C.) Där fanns ingen signifikant påfrestning vid dag-interaktion (F (2846) = 2,32, p = 0,10), vilket innebär att den dagen påverkas rovers och sitters på liknande sätt. Icke desto mindre fanns det en betydelsefull dag genom interaktion behandling (F (2420) = 8,07, p = 4,00 x 10 -4), visar att effekten av behandlingen varierade mellan dagar. uppfödnings kvaliteten på maten hade också en signifikant effekt på väg längder (Fig. 4). Generellt väg längder var längre när larver av båda stammarna föddes upp på vår höga närings mat jämfört med låg närings mat (F (1, 352) = 126,38, p <2,20 x 10 -16). Rover-sitter skillnader men var fortfarande kvar trots livsmedelskvalitet under larvodling (F (1, 352) = 94,89, p <2,20 x 10 -16 ). Dag effekter som var signifikant (F (2, 351) = 3,77, p = 0,024) ingick i den statistiska modellen. Dessutom fanns det en betydande stam av dag interaktion (F (1704) = 7,15, p = 9,00 x 10 -4), samt en betydande mat dag interaktion (F (1704) = 5,06, p = 7,60 x 10 - 3).Slutligen är det viktigt att notera att de relativa rover-sitter skillnader var signifikanta över dagen, livsmedelskvalitet och livsmedelsbrist effekter, men att de absoluta väg längd skiljde mellan dagar och behandlingar. Dessa resultat inte bara understryka robustheten hos larver analys väg-längd, men också att det är viktigt att kontrollera för uppfödningsförhållanden, kör varje stam / behandling av ränta på varje testdag, och factoring i dag effekter i analyserna.
1 "src =" / filer / ftp_upload / 53980 / 53980fig1.jpg "/>
Figur 1. Beredning av att hålla flaskor och testplattor. (A) Grape plattor för äggläggning bör fyllas över kanten till en slät kupol av media. Tillsats av en liten mängd av färsk jäst pasta (B) befrämjar äggläggning. (C) plexiglasprovplåten med kanter i brunnar och spridare. (D) Fly odlingsflaska med hål skära i för lufttillförsel. Efter överföring föräldra befolkningen odlingsflaskan bör druvplattor monteras över öppningen med maskeringstejp (E) och flaskor bör placeras med druvan plattan i botten (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra .
g "/>
Figur 2. bildanalys av veckad bana längd Spår. Path längder där larverna har passerat över sin egen väg bör manuellt separeras vid korsningen för att generera en enda sammanhängande linje. (A) visar ett exempel på tre skannade väg längder, med en röd pil som pekar på skärningspunkten av den övre väg-längd. (B) visar samma väg-längd redigeras i ImageJ för att separera korsningen. (C) visar den ImageJ omkretsen utsignalen från den korsande bana-längd, med felaktig bedömning av omkretsen av banan 1 på grund av korsningen. (D) Visar ImageJ omkrets produktionen av den redigerade filen med den kluvna korsningen och korrekt bedömning av omkretsen av väg-längd 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fed och livsmedel berövat Rover och Sitter Larvernas Path längder Mean larver väg-längd (mm ± SEM) för rovers och barnvakter, visar:. (A) Sammanslagna väg-längder för utfodras och 4 h mat berövade larver över tre på varandra följande dagars test, 105 <n <120; (B) Fed larver väg längder efter dag 38 <n <40 per dag; och (C) 4 timmar mat berövade larver väg längder efter dag, 38 <n <40, per dag. Alla larver och föräldrar föddes upp på låg närings mat vid 25 ° C, 60% luftfuktighet och 00:12 L: D cykel. Skillnader mellan testgrupper och / eller behandlingar bedömdes genom variansanalys (ANOVA) och Tukeys test för post hoc parvis multipla jämförelser. För (A) en blockerande faktor dag sattes till modellen. Bokstäverna representerar statistiska grupperingar; innebär med samma bokstav är inte significantly olika (p <0,05). Fed och FD står för Fed och 4 tim mat berövade villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Livsmedelskvalitet och Larv Path-längder. Medel larver väg längd (mm ± SEM) för Rovers och barnvakter, visar väg-längder av larver odlas på hög och låg närings mat. Data poolade över tre dagar i rad av tester med en blockerande faktor dag läggs till den statistiska modellen, 75 <n <90. Alla larver och föräldrar föddes upp på låg eller hög närings mat vid 25 ° C, 60% luftfuktighet och 12:12 L: D cykel. Skillnader mellan testgrupper och / eller behandlingar bedömdes genom variansanalys (ANOVA) och Tukeys test för post hoc parvisa Multiple jämförelse. Bokstäverna representerar statistiska grupperingar; innebär med samma bokstav är inte signifikant olika (p <0,05). Högt och lågt står för högt näringsinnehåll och låg näringslivsmedelskvalitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys väg-längd som beskrivs här erbjuder en robust och enkel åtgärd av födosöksbeteende Drosophila larver. Protokollet följer den allmänna metod som beskrivs i Sokolowski 2, men har sedan dess förbättrats när det gäller effektivitet och experimentella kontroller. Så vitt vi vet denna metod är den enda tillgängliga metoden för att mäta larver väg-längd. Den ursprungliga versionen av vägen längd protokoll 2, 3, 15, 16 testade larver på petriskålar med ett tunt lager av jäst pasta appliceras med en pensel, och senare ett glas spridningsstav. Nyare versioner av protokollet 10, 17 över till att använda plexiglasplattor som beskrivs här. Användningen av petriskålar och glas spridare presenterade fördelen av ett mycket tunt skikt av jäst, vilket gav mycket långa väg-längder och exacerbated skillnaderna mellan rover och barnvakt fenotyper. Användningen av plexiglas plattor resulterade i totalt kortare väglängd, men rover-sitter skillnader bibehölls och lika reproducerbar. Även om användningen av plexiglasplattor är mycket mindre arbetskrävande, de längre väg-längder som erhålls med petriskålen metod medges för bättre separation av rover och barnvakt fenotyper, underlätta den genetiska kartläggningen av rover-sitter skillnaden till för gen 3. Användningen av plexiglasprovplattor i stället för petriskålar och beräknings analyser av väg-längd spår är de stora förändringar som gjorts i protokollet eftersom metoden utvecklades först, och har kraftigt ökat antalet larver som kan testas av en enda person , såväl som hastigheten för dataanalyser. Vi har också förbättrat vår kunskap om flera experimentella och miljöfaktorer som kan påverka resultatet av analysen, av vilka några beskrivs nedan.
För det första, denna analys mäter individuella skillnader i väg-längd beteende på en föda substrat (en jäst-vatten pasta). betydande differences i denna analys skulle kunna leda till brister i allmänhet larv förflyttning. Detta kan kontrolleras genom samtidig analys med avseende på larv locomotion beteende på icke-närande agarplattor. Om stamskillnader hålls på agarplattor, är det säkert att anta att skillnaderna som finns på en jäst-vattensubstrat inte födosöksbeteende specifik. Det har tidigare visats att medan rover för allelen ger betydligt längre väg-längder på jäst, behöver rovers och sitters inte avvika i frånvaro av livsmedel, som de uppvisar på liknande sätt långa väg-längder på agar 9. Dessutom, på grund larver ökar i allmänhet deras förflyttning i avsaknad av mat, att hitta lite eller ingen rörelse på agarplattor sannolikt indikativ för defekter i förflyttning. Eftersom livsmedels oberoende rörelse defekter kan fungera som en confounding variabel vid utredning födosöksbeteende, kan agar kontroll minska falska positiva genetiska skärmar 10. Det är också viktigt att notera att om larvae skadades före testning, kan de inte röra sig alls. Immobile, döda eller skadade larver kan skiljas från friska larver genom att observera mun krok rörelse. Immobile larver utan mun krok rörelser ska kasseras.
För det andra, som med andra beteenden, larver väg-längd kan påverkas av miljöfaktorer som måste beaktas och kontrolleras för när de utför denna analys. Miljöfaktorer som påverkar väg-längd inkluderar uppfödning temperatur, luftfuktighet, livsmedelskvalitet, djurtäthet, jäst pasta tjocklek, slumpmässiga skillnader mellan dagar, och hanteringen av larver. Larvutveckling och ålder vid testtillfället påverkar också väg-längd 11. Såsom visas i fig. 4, lyfta larver i livsmedel lägre kvalitet minskar väg-längd. Användningen av en av flugan mat recept som beskrivs i detta protokoll eller annan döda recept jäst som är likvärdigt med dess näringsinnehåll rekommenderas. Det är också Suggested att undvika höga eller låga densitet uppfödningsmiljöer genom att alltid sådd livsmedel plattor med 100 larver och avstånd ut dem jämnt på maten. Uppfödning larver vid höga densiteter begränsar tillgången på mat och fördröjer larvutveckling, vilket kan resultera i utvecklings skillnader mellan larver vid tidpunkten för testning 12. Low Density uppfödningsförhållanden kan också påverka utvecklingen eftersom Drosophila larver kan bilda sociala betesgrupper att bryta ner mat och öka födosök framgång 13. När larverna med mutationer som påverkar larv storlek analyseras, kan det bli nödvändigt att ta hänsyn till dessa effekter genom beräkning av path-längd som en funktion av larvkroppen längd eller omkrets. I samtliga fall är det viktigt att se till att larverna inte har övergått till vandrande skede när de testas. Om larver flytta upp på fat locket Petri under testet, är det troligt att de vandrar och experimentet ska kasseras och upprepas med yngre larvae.
En annan faktor värt att nämna är konsekvensen av jäst pasta som används vid testning väg-längd eftersom det påverkar krypande hastighet av larver. Larver testas på en tjock jäst pasta kommer att ha kortare väg längder än larver testades på en mer vatten jäst pasta. Dessutom stokastiska skillnader mellan testdagar påverkar också absoluta väg längd poäng. Det är absolut nödvändigt att slumpmässig ordning på vilka stammar / genotyper testas inom några dagar och blockera dem mellan dagar. Slutligen bör man inte stressa larver före testning väg-längd. Två faktorer som vanligen införs genom hantering är svält och drunkning. Såsom visas i fig. 3, svältande larver före testning minskar väg-längd, och även svält kan införas som en miljö manipulation, bör dess oavsiktlig förekomst undvikas. Betonar larver bör undvikas genom att arbeta försiktigt men snabbt, vilket begränsar den tid spent insamling, rengöring, och överföra larver. Eftersom larver uppvisar negativa phototaxis 14, kan intensivt ljus också fungera som en stress och analysen bör göras i enlighet med, diffus belysning. Trots de många miljöfaktorer som kan förändra väg-längd, är det viktigt att notera att även absoluta väg längd poäng är känsliga för miljöförhållanden, är relativa skillnader mellan stammar bibehålls när alla personer behandlas lika.
Noggrannhet, effektivitet och robusthet i kvantifiering är i centrum för studier som syftar till att förstå de genetiska och miljömässiga faktorer som förmedlar beteende. Larv assay Drosophila path-längd erbjuder alla dessa fördelar förutom att vara låg kostnad, hög genomströmning, och lätt att utföra. Som sådan, kan denna analys används i stor utsträckning för genetiska skärmar för att identifiera de molekylära och genetiska vägar som är förknippade med beteendereaktioner. Vidare kan analysen vara enpplied testning toxicitet eller farmakologiska skärmar, eller anpassade för undervisning i klassrummet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz fly culture bottles | Fisher Scientific | AS355 | |
| Fly vial plugs | Droso-Plugs | 59-201 | |
| 35 x 10 mm Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher | 875712 | |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-168 | |
| Dissecting probes | Almedic | 2325-58-5300 | |
| Yeast | Lab Scientific | FLY-8040-20F |
References
- Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
- Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
- de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
- Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
- Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).
- Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
- Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
- Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
- Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9 (4), e95495 (2014).
- Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
- Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).
