Abstract
Drosophila melanogaster larvebanelengde fenotype er et etablert mål som brukes for å studere genetiske og miljømessige bidrag til atferdsvariasjon. Larvebanelengde analysen ble utviklet for å måle individuelle forskjeller i foraging atferd som senere ble knyttet til beite genet. Larve banelengde er en lett scoret egenskap som muliggjør innsamling av store utvalgsstørrelser, med minimal kostnad, for genetiske skjermer. Her gir vi en detaljert beskrivelse av dagens protokoll for larvebanelengde analysen først brukt av Sokolowski. Protokollen detaljer hvordan du reproduserbart håndtere forsøksdyr, utføre atferdsanalyse og analysere dataene. Et eksempel på hvordan analysen kan brukes til å måle atferds plastisitet som respons på miljøendringer, ved å manipulere mate miljø forut for utførelse av analysen, er også tilveiebrakt. Endelig passende test design så vel som miljømessige faktorer som kan endrelarve banelengde som mat kvalitet, utviklings alder og dag effekter er diskutert.
Introduction
Siden oppdagelsen av det hvite genet i Thomas Hunt Morgan laboratorium i 1910, har bananflue, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), blitt brukt som modell for studiet av molekylære og fysiologiske fundamentet for ulike biologiske prosesser. Populariteten til D. melanogaster i stor grad stammer fra den betydelige mengde og utvalg av genetiske verktøy. Drosophila lille størrelse, relativ enkel håndtering og kort generasjonstid gjengi det en ideell modell for genetiske studier. Like viktig er Drosophila kapasitet til å demonstrere mange av fenotyper uttrykt av mer komplekse organismer inkludert pattedyr. Dette omfatter komplekse fenotyper som adferd som skiller seg ved grenseflaten mellom organismen og dens omgivelser. Som sådan, atferdsstudier på bananflue har bidratt vesentlig til vår forståelse av hvordan gener og miljø megle atferd1.
En av de første studier av D. melanogaster larve atferd undersøkt individuelle forskjeller i larve foraging strategier ved å måle banelengder av larver to mens fôring. Sti-lengde ble definert som den totale distansen som en enkelt larve på gjær, innenfor en fem minutters periode. Både laboratoriestammer og fluer fra en naturlig populasjon i Toronto variert i sine foraging atferd, og det var en genetisk komponent til individuelle forskjeller i banelengde. To larve foraging morphs ble beskrevet fra de kvantitative banelengde fordelinger og de ble kalt rover og sitter. Rovers stille lengre bane-lengder mens traversering et større område, mens på en mat underlaget enn stedfortreder. Ved hjelp av denne banelengde analysen, de Belle et al. 3 kartlagt beite (for) genet underliggende disse individuelle atferdsforskjeller til en diskret plassering på chromosome- 2 (24A3-24C5). Den D. melanogaster for genet ble senere klonet 4 og viser seg å være en cGMP avhengig proteinkinase 5, en modulator av fysiologi og oppførsel i Drosophila og andre organismer 6.
Her skisserer vi den gjeldende protokollen for larvebanelengde analysen opprinnelig utviklet i Sokolowski 2. Selv om noen aspekter av analysen har endret seg gjennom årene, har konseptet bak utformingen ikke. Vi gir også data for å illustrere analysen potensial for å vurdere genetiske og miljømessige bidrag til individuelle forskjeller i foraging atferd Drosophila larver. Larvebanelengde analysen er enkel, effektiv og robust. En enkelt person kan teste opptil 500 larver med letthet i fire timer og resultater kan oppnås med en høy grad av reproduserbarhet. Opprinnelig utviklet for å lokalisere for, det kan brukes i genetiske skjermer, kvantitativ egenskap locus kartlegging, og i studierav gen-by-miljø (GXE) interaksjoner. Videre sin enkelhet og reproduserbarhet gjør det til en stor ressurs for lavere undervisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Grape Plater og Holding Flasker for innsamling av larver
- For å gjøre holder flasker, skjære hull i den ene siden av 6 oz fly kulturflasker, store nok til å passe en flue hetteglass plugg for lufttilførsel (Fig. 1D).
- For å gjøre drue plater, fremstille 250 ml av druesaft-medium (1,8% agar, 45% druesaft, 2,5% eddiksyre, 2,5% etanol) ved koking av agar, druesaft og det meste av vannet, avkjøles til 70 ° C ( rør under avkjøling), og deretter legge eddiksyre og etanol, og bringe opp til volum med vann.
- Bruke en sprøyte (uten nål) for å fylle 35 x 10 mm petriskål lokk inntil overflaten av druesaft medium gjør en kuppel over kanten av lokket (fig. 1A).
- Oppbevares drue platene i en fuktig og lufttett beholder ved 4 ºC inntil bruk (opp til maksimalt 2 uker).
2. Utarbeidelse av mat platene
- Forbered standard fly mat oppskrift.
Merk: For å test stell matvarekvalitet virkninger på bane-lengde vi brukte lavt nærings flue mat: 10% sukrose, 1,3% agar, 0,8% kaliumnatriumtartrat, 0,1% monokaliumfosfat, 0,05% natriumklorid, 0,05% kalsiumklorid, 0,05% magnesiumklorid, 0,05% jern-III-sulfat, 5% gjær og 0,5% propionsyre i vann; og høyt nærings flue mat: 1,5% sukrose, 1,4% agar, 3% glukose, 1,5% maismel, 1% hvetekim, 1% soyamel, 3% melasse, 3,5% gjær, 0,5% propionsyre, 0,2% Tegosept og ett % etanol i vann. For begge matvarer autoklaver løsningen og kjølig til 50 o C før du legger til propionsyre, Tegosept og etanol. - Hell 40 ml av flua mat til 100 x 15 mm petriskåler.
- Oppbevar mat platene i en fuktig og lufttett beholder ved 4 ºC inntil bruk (opp til maksimalt 2 uker).
3. Forbered Test Plates
- Fremstille 58 x 25 cm, 6 mm tykk svart pleksiglass plater med 10, 1 mm dype brønner sirkulære, 10 cm i diameter og ordnet i en 2 x 5 dEsign (fig. 1C) for å teste larver på.
Merk: Opp til 30 larver kan testes i en tid hvis tre eller flere av de ovenfor pleksiglassplater er tilgjengelige. Alternativt kan larver testes i Petri-skåler, 10 cm i diameter. Dette alternativet er mye mer arbeidskrevende og gjør det mulig for lavere antall larver som skal testes. - Skaff en svart 39 x 8 cm, 6 mm tykt pleksiglass spreder for å spre gjær lim på Pleksiglass prøveplatene.
- Forbered 100 x 15 mm petriskål lokk for opptak larve bane-lengder ved å skille lokk fra bunnen på forhånd.
4. Sette opp sperre populasjoner
- Hold oppdrettsforhold konstant gjennom hele analysen (f.eks 25 ºC, 60% luftfuktighet og en 12:12 lys: mørke syklus på standard fly mat).
- Hev foreldre befolkningen i samme oppdrettsforhold.
- Samle 100 - 150 kvinner og 50 - 75 menn og alder dem i 5 ± 1 dager for optimal fruktbarhet.
- Tillat females og hanner å parre over natten i en 6 oz flue kultur flaske med standard fly mat.
- Transfer flyr inn i et holdingselskap flaske og sikre en drue plate (en liten mengde av fersk gjær lim på druen plate vil fremme egglegging, Fig. 1B) over toppen med maskeringstape (Fig. 1E).
- La flaskene stående opp ned (Fig. 1F), med druen plate i bunnen for å tillate voksne å legge egg på druen plate.
- Kast den første drue plate etter 24 timer og plassere en ny drue plate i å holde flasken. Dette vil være den druen plate som larver samles neste dag.
Merk: Drue platene må være ryddet for larvene 22 timer etter at de er satt opp, sette opp platene slik at de kan rettes opp tidlig neste dag (. F.eks sette opp plate på 24:00 og klar kl 10 neste dag). Det anbefales å forkaste den første drue plate for å unngå eventuelle egg som kvinner kan ha vært forskuddstrekk og that kan være avansert i utvikling.
5. Samle L1 (første stadium) Larver fra Grape Plates
- Fjern drue plater fra flasker 22 timer etter at de ble satt opp og plasseres i en 60 x 15 mm petriskål.
- Plasser en ny drue plate med fersk gjær lim på driftsenheten flasken.
- Klar og forkaste alle larver fra seeded drue platen med en dissekere sonde.
- Inkuber ryddet drue plater for 4 timer i standardbetingelser.
- Etter 4 timer, plukke 100 L1 larver per belastning fra drue platene og legg på mat platene.
- Plasser larver på mat forsiktig (uten perforering mat og begrave larver) og unngå trengsel ved å fordele larvene over maten plate.
- Inkuber mat platene til forsøksdyr er ca 10 timer før starten av vandrende.
Merk: Ved 25 ºC, 10 timer før vandrende vanligvis tilsvarer 72-96 timer etter klekking. den kalle nøyaktiget mengde av inkubasjonstid bør bestemmes før forsøket ved å samle et første sett av larver for hver stamme og registrering av antall timer inntil starten av vandrende (vandrende larver vil bevege seg ut av maten på sidene og lokket av mat plater).
Merk: Om nødvendig kan de samme foreldre brukes til å samle larver i 3 - 4 dager med testing ved å gjenta trinn 4.7 til 5.5. Endre rekkefølgen som stammer er satt opp og testet på tvers dager for å unngå en test for effekt på bane-lengde. Test den samme "kontroll" belastning / påkjenningen hver dag med testing for å kontrollere for dagen effekter. - Hvis mange stammer er testet, rave satt opp og samling tider av larver for å tillate testing av hver stamme på riktig tidspunkt senere.
6. Larve Sti lengde Test
- Oppløs tørr-aktiv bakegjær i vann ved en 1: 2-forhold (vekt til volum). Den ferdige gjær lim skal være tynnere enn pancake batter, på en slik måte at ved løfting av en skje ut av pastaen, drypper det og etterlater bak bånd på overflaten av pastaen som raskt smelte bort.
Merk: Konsistensen av gjær pastaen er viktig og bør være konstant gjennom hele forsøket. Den nøyaktige gjær: vann forholdet kanskje må justeres avhengig av merke og batch av gjær. - Forsiktig plukke larver av den første stammen som skal testes fra maten platen ved hjelp av en pensel.
- Samle larver i en petriskål og forsiktig vask med vann for å fjerne all mat.
- Hurtig vaske larver med 1 - 2 ml vann og forsiktig dab larver tørr med en laboratorie-tørke for å unngå overføring av en hvilken som helst vann ved plassering av larver på testplaten. For å unngå stress, holde larver fuktig, men ikke senket i vann.
- Ordne tre prøveplater ved siden av hverandre og satt en 5 minutters timer for hver testplate.
- Gjelder gjær masse på toppen av prøveplatene, og ved hjelp av sprederen, spre et tynt layeh av gjærpasta på hver prøveplate, slik at alle brønnene har et jevnt lag av gjær.
- Forsiktig en larve i midten av hver brønn, med start 5 min timer etter å ha plassert den første larver på hver plate. Merk: Tre plater kan gjøres på en gang, hvilket gir en prøvestørrelse på 30 / belastning / testdagen, opp til en total på 500 larver.
- Plasser en petriskål lokket på toppen av hver brønn.
- Når tiden går ut, uten å fjerne larvene fra platen, start sporing banelengder etterlatt i gjær ved hjelp av en permanent markør. Trace bane-lengder i samme rekkefølge som larver ble plassert på testplater.
- Utfør sporing med samme hastighet som larver ble plassert på platene. For konsistens i senere dataanalyse, bruke samme markør for alle bane-lengder. Permanent markør anbefales.
- Gjenta trinn 6.2 til 6.8.1 for hver stamme som skal testes. Plukk hver stamme fra mat umiddelbart før testing for å unngå sult effekter på path-lengde.
7. Mat deprivasjon
- Dersom larver skal være mat fratatt før testing, samle larver som beskrevet i trinn 6.2 til 6.3, men den ønskede mengde av mat deprivasjon gang tidligere (f.eks., Hvis larver skal mat fratatt i 4 timer, samle larver 4 timer før testtid).
- Fordel vasket larver i to grupper og sett maten medtatte i et 60 x 15 mm petriskål med 5 ml 1% agar og kontrollgruppen i en petriskål med 5 ml standard mat.
- Plasser en vekt på toppen av den omvendte lokket av petriskåler (ellers larvene er i stand til å krype ut når du søker etter mat).
- Inkuber i den tidligere etablert en sulteperiode og fortsetter med testingen som beskrevet i trinn 6.2 til 6.9.
- Dersom mange stammer er som skal testes, rave maten deprivasjon starttider for å tillate testing av hver stamme på et passende tidspunkt.
8. Data Analysis
Merk: Denne delen beskriver en metode for dataanalyse ved hjelp ImageJ 7 eller Fiji 8 for behandling av banelengder, selv om annen programvare kan brukes.
- Bruk en lys bord å overføre alle spores bane-lengder fra petriskål lokk til hvitt papir (lokk kan vaskes med etanol og gjenbrukt for videre banelengde opptak).
- Spore en 50 mm rett referanselinje på en av de ark.
- Scan banelengder med en oppløsning på 300 dpi og lagre som bitmap eller TIFF-bildefiler.
- Åpne bildefilen, velg "Process" tab> "Binary"> "Make binære". Så under "Process" -kategorien, velg "Binary"> "Skeletonize". Dette frembringer en en piksel bredde linje, uavhengig av tykkelsen av spor.
- Sørg for at hver bane-lengde vises som en kontinuerlig enkelt linje uten crossovers.
- Separer eventuelle skjæringspunkter ved hjelp av "Straight line funksjonen "og farging linjen hvitt (kontinuiteten av banen kan kontrolleres med" Wand "(sporing) verktøyet, bør hele banen bli markert gult (fig. 2).
- Velg "Analyse" tab> Sett målinger og velg "Perimeter" og "Display label".
- Velg "Analyse" tab> "Set skala" og velg "Fjern skala".
- På bildet, velge referanselinjen, velg "Analyse" tab> "Analyse partikler" og velg "Vis: Outlines", "resultatvisning" og "Clear resultater bordet". Merk: Utgangen vil vise antall piksler som tilsvarer 50 mm skala linje.
- Velg "Analyse" tab> "Set skala" og fyll i pikselantall i "Avstand i piksler" og tilsvarende avstand (50 mm) i "kjent distanse".
- Til slutt velger du alle bane-lengde tegninger av en genotype enta tid, velg "Analyse" tab> "Analyse partikler" og velg "Vis: skisserer", "resultatvisning" og "Clear resultater bordet".
- Fjern eventuelle skriftlige etiketter eller åpenutenforliggende tegninger (de vil bli anerkjent som banelengder) innenfor det valgte området ved å velge det området og fylle det hvite.
- Inspiser "Outlines" output file for å sikre utkant ble riktig konstatert. Utgangen vil vise en bane-lengde i mm for hver bane-lengde tegning i utvalget. Dette kan enkelt eksporteres til et regneark og analysert med noen statistisk programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forskjeller i banelengde på roveren og sitter for stammer og effekten av mat deprivasjon på banelengde er illustrert i fig. . 3 Data samlet inn over tre sammenhengende dager med testing viste en betydelig belastning effekt (F (1421) = 351,89, p <2,20 x 10 -16, Fig. 3A), med rovere reise lenger enn stedfortreder. I tillegg til den belastning virkning, var det også en signifikant behandlingseffekt mat (F (1, 421) = 461,62, p <2,20 x 10 -16, Fig. 3A), med larver som ble fratatt mat i fire timer før testing har betydelig lavere bane-lengder enn matet larver. Videre ANOVA viste en betydelig belastning ved behandling interaksjon (F (1423) = 9,78, p = 2 x 10 -3), noe som betyr at rovere og stedfortreder svarte på mat deprivasjon i forskjellig grad.
"Fo: hold-together.within-siden =" en "> Selv om dataene ovenfor viste også en signifikant effekt av testdagen (F (2,420) = 7,22, p = 8 x 10 -4, fig 3B - 3C.) Der var ingen signifikant belastning for dag interaksjon (F (2846) = 2,32, p = 0,10), noe som betyr at dagen påvirket rovere og stedfortreder på samme måte. Likevel var det en betydelig dag ved behandling interaksjon (F (2,420) = 8.07, p = 4,00 x 10 -4), som viser at effekten av behandlingen varierte over dager. den oppdra kvaliteten på maten hadde også en betydelig effekt på bane-lengder (Fig. 4). Totalt banelengder var lengre når larver av begge stammer ble oppdratt på vår høye nærings mat i forhold til lavt nærings mat (F (1, 352) = 126,38, p <2,20 x 10 -16). Rover hybelen forskjeller men ble likevel opprettholdt til tross for kvaliteten maten under larveoppdragelse (F (1, 352) = 94,89, p <2,20 x 10 -16 ). Dag virkninger som var signifikant (F (2, 351) = 3,77, p = 0,024) ble inkludert i den statistiske modell. Videre var det en betydelig påkjenning ved dag interaksjon (F (1,704) = 7,15, p = 9,00 x 10 -4), så vel som en betydelig mat dagen interaksjon (F (1,704) = 5,06, p = 7,60 x 10 - 3).Til slutt er det viktig å merke seg at de relative rover hybelen forskjellene var betydelig over døgnet, matkvalitet og mat deprivasjon effekter, men at de absolutte banelengdemålinger forskjellig mellom dager og behandlinger. Disse resultatene ikke bare understreke hvor robust larvebanelengde analysen, men også viktigheten av å kontrollere for oppdrett forhold, kjører hver stamme / behandling av interesse på hver dag med testing, og factoring i dag effekter i analysene.
1 "src =" / files / ftp_upload / 53980 / 53980fig1.jpg "/>
Figur 1. Utarbeidelse av Holding Flasker og Testing plater. (A) Drue plater for egglegging skal fylles over kanten for å danne en jevn kuppel av media. Tilsetning av en liten mengde frisk gjær-pasta (B) fremmer egglegging. (C) pleksiglass testing plate med kanter i brønner og sprederen. (D) Fly kultur flaske med hull skåret i for lufttilførsel. Etter overføring foreldre befolkningen til kulturen flaske, bør drue plater monteres over åpningen med maskeringstape (E) og flasker bør plasseres med drue plate nederst (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
g "/>
Figur 2. Bilde Analyse av convoluted Sti lengde Spor. Banelengder hvor larvene har krysset over sin egen vei bør manuelt separert i krysset for å generere en eneste sammenhengende linje. (A) viser et eksempel på tre skannede bane-lengder, med en rød pil som peker på skjæringspunktet mellom den øverste banelengde. (B) viser den samme bane-lengde redigert i ImageJ å separere skjæringspunktet. (C) Viser ImageJ omkretsen utgangen fra den kryssende bane-lengde, med feilvurdering av omkretsen av banen 1 på grunn av veikryss. (D) Viser ImageJ omkretsen produksjonen av den redigerte filen med det spaltede kryss og riktig vurdering av omkretsen av banelengde 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fed og matdepartementet Fratatt Rover og Sitter Larvebanelengder Mean larvebanelengde (mm ± SEM) for rovere og stedfortreder, demonstrerer. (A) Samlede banelengder for matet og 4 timers mat fratatt larver over tre år på rad dager med testing, 105 <n <120; (B) Fed larve bane-lengder etter dag 38 <n <40 per dag; og (C) 4 timer mat fratatt larve bane-lengder etter dag, 38 <n <40, per dag. All larver og foreldre ble oppdratt på lavt nærings mat ved 25 ºC, 60% luftfuktighet og en 12:12 L: D syklus. Forskjeller mellom testgruppene og / eller behandlinger ble vurdert ved analyse av varians (ANOVA) og Tukey test for post hoc parvis multiple sammenligninger. For (A) en blokkerende faktor på dag ble tilsatt til modellen. Letters representerer statistiske grupperinger; betyr med samme bokstav er ikke SIgnificantly forskjellige (p <0,05). Fed og FD står for fôres og 4 timers mat fratatt forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Matkvalitet og Larvebanelengder. Mean larvebanelengde (mm ± SEM) for rovere og stedfortreder, som viser banelengder av larver dyrket på høyt og lavt næringsinnhold mat. Data samlet over tre sammenhengende dager med testing med en blokkerende faktor på dag lagt til den statistiske modellen, 75 <n <90. Alle larver og foreldre ble oppdratt på lavt eller høyt næringsinnhold mat ved 25 ºC, 60% luftfuktighet og en 12:12 L: D syklus. Forskjeller mellom testgruppene og / eller behandlinger ble vurdert ved analyse av varians (ANOVA) og Tukey test for post-hoc parvis multiple sammenligning. Letters representerer statistiske grupperinger; betyr med den samme bokstav er ikke signifikant forskjellige (p <0,05). Høyt og lavt standpunkt for høye næringsinnhold og lavt nærings matkvalitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stien lengde analysen beskrevet her har en robust og enkelt mål på beite atferd Drosophila larver. Protokollen følger den generelle metoden beskrevet i Sokolowski 2, men har siden blitt forbedret i forhold til effektivitet og eksperimentelle kontroller. Så langt vi kjenner til denne metoden er den eneste tilgjengelige metoden for måling larve banelengde. Den opprinnelige versjon av banelengden protokoll 2, 3, 15, 16 testet larver på Petri-skåler med et tynt lag av gjærpasta påføres med en børste, og senere et glass sprer stang. Nyere versjoner av protokollen 10, 17 overført til ved hjelp av pleksiglass plater som er beskrevet her. Bruken av Petri retter og glass spreader present fordelen av et svært tynt lag av gjær, som ga svært lange banelengder og forsterket forskjellene mellom rover og hybelen fenotyper. Bruken av pleksiglass plater resulterte i samlede kortere banelengder, men rover-sitter forskjeller ble opprettholdt og like reproduserbar. Selv om bruken av pleksiglassplater er mye mindre arbeidskrevende, de lengre banelengder oppnådd med petriskål-metoden tillot bedre separasjon av de rover og hybelen fenotyper, legge til rette den genetiske kartlegging av rover-sitter forskjell til den for genet tre. Bruken av pleksiglass prøveplater i stedet for petriskåler, og beregnings analyser av banen lengde spor er de viktigste endringene i protokollen siden metoden ble først utviklet, og har betydelig økt antall larver som kan testes av en enkelt person , såvel som hastigheten av dataanalyser. Vi har også forbedret vår kunnskap på flere eksperimentelle og miljømessige faktorer som kan påvirke resultatet av analysen, hvorav noen er skissert nedenfor.
Først måler denne analysen individuelle forskjeller i banelengde oppførsel på et beite substrat (en gjær-vann lim). betydelig differences i denne analysen kan skyldes defekter generelt larve bevegelse. Dette kan kontrolleres for ved samtidig å analysere for larve locomotion oppførsel på ikke-nærings agarskåler. Hvis belastningsskader forskjeller opprettholdes på agarskåler, er det trygt å anta at forskjellene som finnes på en gjær-vann underlaget ikke er beite atferd bestemt. Det har tidligere vært vist at mens den vandrer for allel overfører betydelig lengre bane-lengder på gjær, trenger rovere og stedfortreder ikke forskjellig i fravær av mat, som de oppviser tilsvarende lange banelengder på agar 9. Dessuten, fordi larver generelt øker sin bevegelse i fravær av mat, finner liten eller ingen bevegelse på agarplater er sannsynlig indikerer defekter i bevegelse. Siden mat-uavhengig bevegelse defekter kan fungere som en konfunderende variabel når undersøker beite atferd, kan agar kontroll redusere falske positiver i genetiske skjermer 10. Det er også viktig å merke seg at hvis larVAE ble skadet før testing, de kan ikke bevege seg i det hele tatt. Immobile, døde eller skadet larver kan skilles fra sunne larver ved å observere munnen krok bevegelse. Immobile larver uten munn krok bevegelser skal kastes.
Andre, som med andre atferd, larve banelengde kan påvirkes av miljømessige faktorer som må vurderes og kontrolleres for når du utfører denne analysen. Miljøfaktorer kjent for å påvirke banelengde omfatter oppdrett temperatur, fuktighet, matkvalitet, oppdrett tetthet, gjær lim tykkelse, tilfeldig forskjeller mellom dager, og håndteringen av larver. Larveutvikling og alder på tidspunktet for testing påvirker også banelengde 11. Som vist på fig. 4, heve larver i lavere kvalitet på maten synker banelengde. Anvendelse av en av de flue matoppskrifter som er beskrevet i denne protokoll, eller en annen død gjær oppskrift som er tilsvarende i dens ernæringsmessige innholdet er anbefalt. Det er også SuggeSTED unngå tetthet oppdrettsmiljøer høye eller lave ved alltid seeding mat platene med 100 larver og avstand dem ut jevnt på mat. Oppdragelse larver ved høye tettheter begrenser tilgjengeligheten av mat og forsinker larveutvikling, noe som kan resultere i utviklings forskjeller mellom larver på tidspunktet for testing 12. Lav tetthet oppdretts forhold kan også påvirke utviklingen siden Drosophila larver kan danne sosiale foraging grupper for å bryte ned maten og øke beite suksess 13. Når larver med mutasjoner som påvirker larvenes størrelse blir analysert, kan det være nødvendig å ta hensyn til disse effektene ved å beregne banelengde som en funksjon av larve legeme lengde eller omkrets. I alle tilfeller er det viktig å sikre at larvene har ikke overført til vandrende stadium når de blir testet. Hvis larver bevege seg opp på petriskål lokket under testen, er det sannsynlig at de vandrende og forsøket må kastes og gjentatt med yngre larvae.
En annen faktor verdt å nevne er konsistensen av gjær lim som brukes i banelengde testing siden det påvirker gjennomgangen hastighet av larver. Larvene testet på en tykk gjær lim vil ha kortere banelengder enn larver testet på en mer vandig gjær lime. Videre stokastiske forskjeller mellom testdager også påvirke absolutte banen lengde score. Det er viktig å randomisere rekkefølgen på som stammer / genotyper er testet i løpet av dager og til å blokkere dem mellom dager. Til slutt, bør man være forsiktig for ikke å stresse larver før banelengde testing. To stressfaktorer som ofte introdusert gjennom håndtering er sult og drukning. Som vist på fig. 3, sultne larver før testing avtar bane-lengde, og selv om sult kan innføres som en miljø manipulasjon, bør dens utilsiktet forekomst unngås. Stressing larver bør unngås ved å arbeide forsiktig men raskt, og således å begrense mengden av tid spent samle, rengjøring, og overføre larver. Siden larver utstillings negativ phototaxis 14, kan intenst lys også fungere som en stressor og analysen bør gjøres under selv, diffus belysning. Til tross for de mange miljøfaktorer som kan endre banelengden, er det viktig å merke seg at selv om absolutt bane-lengde score er utsatt for miljøforhold, er relative forskjeller mellom stammer som opprettholdes når alle personer behandles likt.
Nøyaktighet, effektivitet og robusthet i kvantifisering er i hjertet av studier som tar sikte på å forstå de genetiske og miljømessige faktorer som medierer atferd. Drosophila larve banelengde assay har alle disse fordeler i tillegg til å være lav pris, høy gjennomstrømning, og lett å utføre. Som sådan, kan denne analysen bli mye brukt for genetiske skjermer for å identifisere de molekylære og genetiske trasé forbundet med atferdsmessige respons. Videre kan analysen blipplied til toksisitet testing eller farmakologiske skjermer, eller tilrettelagt for undervisning i klasserommet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz fly culture bottles | Fisher Scientific | AS355 | |
| Fly vial plugs | Droso-Plugs | 59-201 | |
| 35 x 10 mm Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher | 875712 | |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-168 | |
| Dissecting probes | Almedic | 2325-58-5300 | |
| Yeast | Lab Scientific | FLY-8040-20F |
References
- Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
- Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
- de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
- Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
- Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).
- Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
- Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
- Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
- Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9 (4), e95495 (2014).
- Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
- Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).
