Abstract
Endotheelcellen lijn de binnenwand van bloedvaten en spelen een belangrijke rol bij de regulatie van de vasculaire tonus, vasculaire permeabiliteit en nieuwe vasculaire vorming. Endotheelcellen dysfunctie is betrokken bij de ontwikkeling en progressie van vele cardiovasculaire aandoeningen waaronder ischemische hartziekte. De functie en karakterisering van coronaire endotheelcellen onderzocht celisolatie is de eerste stap en vereist hoge zuiverheid en hoeveelheid en daaropvolgende experimenten. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om volwassen muizen coronaire endotheliale cellen te isoleren. De muis hart wordt ontleed en gehakt in kleine stukjes. Na de digestie van het hart met behulp dispase en collagenase II worden de cellen gewassen en geïncubeerd met magnetische kralen die geconjugeerd met anti-CD31 antilichaam. De korrels met endotheelcellen zijn gewassen meerdere malen en zijn klaar voor gebruik in diverse toepassingen, zoals beeldvorming en moleculaire biologische experimegen. Efficiënte isolatie levert ongeveer 10 4 cellen per één van hart met meer dan 90% zuiverheid.
Introduction
Muismodellen van diverse cardiovasculaire aandoeningen en metabolische aandoeningen dragen fysiologische en moleculaire veranderingen die lijken op die van patiënten. Bovendien, genetische verandering van muizen is een krachtig instrument dat ons toelaat om de pathogene rol van specifieke genen in de ontwikkeling en progressie van ziekten te onderzoeken. Tegenwoordig celtype-specifiek gen-knock-in muizen of uitchecken worden gemakkelijk opgewekt in veel laboratoria en de meting van mRNA en eiwitniveaus in specifieke celtypen is de eerste stap bij het bepalen of de muizen werden werkelijk genetisch gemodificeerd.
Endotheel is een enkele laag endotheelcellen (EC) waarmee de binnenkant vaatwand. Endotheliale cellen spelen een cruciale rol in het reguleren van de vasculaire spanning, vasculaire permeabiliteit en nieuwe vasculaire vorming van 1,2. Endotheliale disfunctie is een kenmerk van vele pathologische aandoeningen en veranderingen in endotheelfunctie kan leiden tot verschillende autocardiovasculaire ziekten 3,4. Het is dus belangrijk om de functie van endotheliale cellen te bestuderen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.
Er zijn verschillende manieren om EC 5-8 uitschakelen en de isolatiewerkwijze moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de weefsels en soorten worden gebruikt. Dit komt omdat EC uit verschillende weefsels een hoge mate van heterogeniteit tonen met betrekking tot hun oppervlaktemarkers en eiwitexpressie 9. Succesvolle isolatie van endotheelcellen kan vaak lastig zijn en vereist een zekere mate van opleiding en praktijk. Eenmaal bereikt, de werkwijze in dit protocol voorgesteld isolatie blijkt stabiel en efficiënt.
Het algemene doel van deze methode is om het verkrijgen van de muis coronaire EC (MCECs) van hoge kwaliteit en kwantiteit. Hoewel de hoeveelheid cellen verzameld uit een hart minder dan cellen verzameld uit andere weefsels met behulp van andere technieken, deze techniek nog betkwaliteit ter. De zuiverheid van endotheelcellen in de resulterende populatie groter dan 90%. Zo zou deze techniek ideaal voor toepassingen die afhankelijk zijn van louter geïsoleerde endotheelcellen zoals cell imaging zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek op muizen werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Arizona en werd uitgevoerd in overeenstemming met de National Institute of Health (NIH) richtlijnen.
LET OP: de delen 1, 2 en 3 moeten worden op de dag uitgevoerd voor het experiment als setup.
1. Voorbereiding Solutions
- CD31 buffer (50 ml)
- Voeg 50 ml 1 x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) aan een 50 ml buis. Weeg 0,05 g runderserumalbumine (BSA) en 0,037 g Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en aan de 50 ml buis en plaats de buis roteert gedurende ongeveer 1 uur tot poeder oplost. Breng de pH op 7,4, filtreer door een 0,2 urn filter in een nieuwe 50 ml buis en bewaard bij 4 ° C tot gebruik.
- Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met HEPES (500 ml)
- Voeg 1,1915 g HEPES 10 mM HEPES in HBSS oplossing te maken en meng. Meet de pH en pas aan 7,4. Filter en bewaar bij 4˚C.
- 1x Krebs oplossing (1 L)
- Voeg 100 ml van 10 × Krebs oplossing [Tabel 1] om gedestilleerd water te verdubbelen in een kolf van 1 liter. Weeg 2,1 g natriumbicarbonaat en 2 g D-glucose en toe te voegen aan de kolf. Meng en pas het totale volume tot 1 L.
- Bellenoplossing met 95% O2 / 5% CO2 gas voor 30 minuten en filter oplossing in de kap. Bewaar bij 4 ° C en blijf op ijs tijdens het experiment.
2. De voorbereiding van de Magnetic Beads
- Voeg 1 ml CD31 buffer in elk 1,5 ml buis (één buis per monster). Meng de schapen anti-rat IgG kralen en voeg de juiste hoeveelheid aan elk monster [Tabel 1]. Schud de buizen krachtig 30 keer en plaats ze in de magneetplaat gedurende 1 min schudden. Open de tubes terwijl op de plaat en dump de oplossingen in een emmer.
- Voeg 1 ml CD31 buffer in elke buis. Voeg 2 ul rat anti-muis CD31 antilichaam aan elke buis en draai buizen O / N bij 4 ºC.
3. Autoclaveren
- Autoclaaf alle chirurgie en pipetpunten. Snijd de uiteinden van pipetpunten zodat er tips met 4 verschillende diameters van breedste smalste. Benaderde diameter voor tips 3 mm, 2,5 mm, 2 mm en 1,5 mm respectievelijk. Snijd de uiteinden en de autoclaaf dag vóór 30 minuten sterilisatie bij een temperatuur van 121 ° C.
LET OP: Profielen 4-11 moet op de dag van het experiment worden uitgevoerd.
4. Voorbereiden Solutions
- Bereid wassen buffer met 2% IJzer-Versterkte Calf Serum (IFCS) in M199. Voor de beeldvorming, voor te bereiden 30 ml / muis.
- Bereid enzymoplossing (10 ml / monster). Weeg 0,6 eenheid / ml Dispase en 1 mg / ml collagenase type II in een 50 ml buis. Voeg M199 en draai de buis bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Filteren door middel van 0,2 um filter in een nieuwe 50 ml buis inside de motorkap en te houden bij 4 ° C tot gebruik.
- Bereid HBSS / HEPES met heparine. Voeg 10 ml HBSS met 10 mM HEPES in 15 ml buis. Voeg 100 ul van heparine aan de buis en laten 4 ° C tot gebruik.
5. Het wassen van de kralen
- Haal de buizen met kralen uit de rotator bij 4 ºC en breng aan de kap. Plaats de buizen in de magnetische plaat en schud gedurende 1 minuut. Dump de oplossing en voeg 1 ml CD31 buffer in elke buis.
- Neem de buizen uit de magnetische plaat en schud krachtig 30 keer. Zet de buizen terug in de magneetplaat en herhaald voor een totaal van 3 wassingen. Na voltooiing, zet de buizen terug naar 4 ° C en blijven draaien tot gebruik.
6. Dissection
- Injecteer de muizen intraperitoneaal met 0,1 ml Heparine om bloedstolling te voorkomen. Wacht 10 minuten, daarna verdoven de muizen via intraperitoneale injectie van 0,01 ml pentobarbital. Controleer of de muis voeltpijn door het knijpen de voet.
- Plaats de muis op een polystyreen bord met hoofd omhoog en houd de armen met pinnen. Tang en hard-cut-schaar om de huid op de bovenste borstkas gesneden tot de keel.
- Wordt gesneden in het midden van de ribben net boven het membraan. Snijd het bot zijwaarts en omhoog naar de keel een driehoek blootstellen van het hart en de longen maken. Snijd de aorta net boven het membraan.
- Houd de thymus met een pincet zonder te trekken en met een schaar aan een bindweefsel zorgvuldig snijden aan de longen en het hart samen te verwijderen. Plaats weefsels in een bekerglas met 1 x Krebs, schudden met een pincet overgebracht, 6 cm schaal met 1 x Krebs.
- Verwijder de long lobben met een schaar en forceps. Plaats een 20 G steriele katheter in de aorta. Spoel het bloed in de coronaire vaatstelsel met HBSS / heparine. Maak een kleine snede in de ventrikel, schud het hart en over te dragen aan een monsterbuis van M199. Houd buizen op ijs.
- Breng het hart van een 6 cm schaal gevuld met 10 ml enzymoplossing en gehakt in kleine stukjes met een schaar. Leg de schalen in de 37 ° C incubator gedurende 15 minuten. Schud verteerd materialen door en neer te pipetteren 30 keer door middel van een tip met een afgesneden uiteinde om het weefsel door makkelijker te passen.
- Zet het terug in de 37 ° C incubator voor nog eens 15 min. Herhaal agitatie drie keer, telkens met een pipet tips van de grootste openingen naar smalste en 15 minuten incubatie tussen elke.
- Na de laatste 15 minuten incubatie, monsters te nemen uit en in de kap. Pipet oplossing op en neer 30 keer met behulp van pipet tip met de smalste opening en gaan door een 40 um cel zeef in een nieuwe 50 ml buis.
- Was de schaal met 10 ml wasbuffer met een 10 ml pipet overgebracht naar cel zeef. Zet de 50 ml buizen in de centrifuge en centrifugeren bij 400 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant zonder verstoring van de pellet. Was de cellen met 5 ml wasbuffer tweemaal.
- Verkrijg een eerder bereide 1,5 ml buizen met bolletjes en werken op één buis per keer. Zet een 1,5 ml buis in de magnetische plaat, schud 3 keer en open het.
- Na de laatste centrifuge, verwijder zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de pellet. Distantiëren de cel klonten door de knop krachtig.
- Voeg 1 ml wasbuffer aan de 50 ml buis en meng de cellen met een 1 ml pipet. Dump de oplossing van 1,5 ml buis en voeg 1 ml van de celsuspensie uit de 50 ml buis aan de korrels. Flick de buizen 30 keer en draai vervolgens bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
9. Voorbereiding voor Cultuur van de Cel / Imaging
- Bereid kamers voor plating cellen. Voeg gelatineoplossing (5% w / v, 300 ui) aan de kamer en het bekleden van de oppervlakte en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Na incubatie remove gelatine en droog het oppervlak.
- Haal de buizen met kralen / cellen na 30 min van de rotatie en zet in de magnetische plaat in de motorkap. Schud gedurende 2 minuten, dump en voeg 1 ml wasbuffer.
- Neem buizen uit de plaat, schud krachtig 30 keer dan flick 30 keer. Leg ze terug in de magnetische plaat en schud gedurende 1 minuut. Herhaal 4 keer voor een totaal van 5 wassingen, maar met 1 min schudden op de plaat.
- Na de laatste wasbeurt, neem één buis en werken op elke buis een voor een. Schud 30 keer en veeg 30 keer. Zet het op de magnetische plaat en schud gedurende 1 minuut. Dump en voeg 1 ml 20% IFCS EC media (voorverwarmd bij 37 ºC).
- Schud krachtig 30 keer flick dan 30 keer. Pas pipet tot 500 pi en pipet op en neer 10 keer. Transfer 500 ul aan elke kamer.
- Zet bij 37 ° C incubator en laat O / N. De volgende dag wassen cellen met 10% FBS EG media.
10. Voorbereidingen voor Western Blot (WB) Samples
- Take de buizen met kralen / cellen na 1 uur rotatierichting. Leg ze in de magnetische plaat en schud gedurende 2 minuten. Dump supernatant en voeg 1 ml koud HBSS. Schud krachtig 30 keer flick dan 30 keer. Tweemaal herhalen voor 3 wassingen, maar met 1 min schudden op de plaat.
- Na de laatste wasbeurt, zet buizen op magnetische plaat en schud gedurende 1 minuut. Verwijder buffer gebruiken pipet en lyseren de cellen gedurende WB onder toepassing van een eerder beschreven werkwijze 11,12. Verzamelde lysaat bevat gewoonlijk ongeveer 30 ug eiwit.
11. Imaging
- Was de cellen 3 maal met media, met een uiteindelijk volume van 250 pl voor een kamer. Voeg 1,5 gl Dil-AcLDL aan de cellen. Vanaf dit punt blijven de cellen in het donker.
- Incubeer gedurende 3,5 uur bij 37 ° C. Voeg 1,5 gl Hoechst, meng en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ˚C.Wash cellen met PBS en bevestig met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Was tweemaal met PBS en geblokkeerd met 5% BSA-PBS gedurende 30 min bij RT. Twee keer wassen met 1% BSA-PBS. Verdun BS-lectine-FITC middels 1% BSA-PBS tot een concentratie van 2 ug / ml en voeg 300 gl aan elke kamer.
- Zet de kamer op de orbitale schudder bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Wassen met PBS 3 keer.
- Visualiseren cellen onder de fluorescentiemicroscoop met belichtingstijd van 200 msec voor FITC (lectine kleuring, een EG-markering, excitatie / emissie 488 nm / 519 nm), 30 msec voor DAPI (Hoechst, een nucleaire kleuring, excitatie / emissie bij 358 nm / 461 nm), en 300 msec voor TRITC (AcLDL kleuring, een EG-markering, excitatie / emissie bij 557 nm / 576 nm). Het verwerven van beelden met behulp van een 20X objectief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De succesvolle isolatie van coronaire endotheliale cellen van een muis hart typisch levert ongeveer 10 4 cellen met meer dan 90% zuiverheid met een geplaveide vorm. Voor een zuivere populatie van endotheelcellen, is voorzichtigheid in de gehele protocol worden genomen om een steriele omgeving vrij van verontreinigingen te waarborgen. Het uiterlijk van langwerpige cellen of vergrote cellen in de populatie aangeeft verontreiniging met andere celtypen, gladde spiercellen en fibroblasten. Endotheelcel zuiverheid wordt uitgevoerd door kleuring cellen met een endotheliale celoppervlak marker, BS-lectine en AcLDL (figuur 1). Het percentage positieve cellen die beide kleuren vertonen was meer dan 90% in MCEC. Een dergelijk resultaat geeft aan dat de techniek is gelukt.
| PBS (10x) (1 L) | </ Td> | ||
| Materiaal | MW | Bedrag (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136,08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L) | |||
| Materiaal | MW | Conc (mM) | Bedrag (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCl | 74,56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO4 • 7H O 2 | 246.5 | 1.2 | 2.96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| EG Media (20%) (500 ml) | |||
| Materiaal | Bedrag | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10 - 20 U / ml heparine | 500 gl | ||
| D-Valine | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicilline / streptomycine | 5 ml | ||
| Hoeveelheid kralen worden gebruikt voor een muis | |||
| voor beeldvorming | 5 gl | ||
| Fof WB / PCR | 10 gl | ||
Tabel 1. chemische samenstelling van Gebruikte oplossingen.
Figuur 1. Vertegenwoordiger Beelden van MCECs. Fluorescentie beelden tonen dat de muis coronaire EC (MCEC) geïsoleerd uit harten vertonen een hoge zuiverheid van het EG-bevolking. De zuiverheid werd getest door zowel AcLDL opname van rode kleur (A) en lectine kleuring in groene kleur (B) in MCEC. De kern werd gekleurd door Hoechst in blauwe kleur (C). Het percentage positieve cellen die beide kleuren vertonen was meer dan 90% in MCEC. Bar is representatief voor 20 pm. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest gebruikte endotheelcellen onderzoek humane navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC's) vanwege hun gemak en kweken. Echter, veel onderzoek nodig is dat een fysiologisch model verkregen door isolatie van endotheelcellen uit andere specifieke organen 10. Endotheelcellen vormen een zeer kleine populatie van cellen in het hartweefsel; hun isolement en het kweken kan blijken te zijn zeer moeilijk te zijn.
Er zijn drie cruciale stappen in dit protocol. De eerste is om het bloed goed te spoelen. Dit is nodig omdat leukocyten in bloed ook CD31 tot expressie als een celoppervlak marker en zal concurreren met EC's voor de binding van het CD31 antilichaam. Zoals andere endotheelcellen aanwezig in het bloed, blozen kan essentieel is voor besmetting door dergelijke cellen voorkomen. De tweede kritische stap is om een steriele omgeving gedurende de isolatiewerkwijze handhaven. Verontreiniging results in een dramatische afname van het aantal cellen verkregen. Het derde essentiële stap is om de pH van de buffer CD31 passen, zoals indien dit niet de efficiëntie van de isolatie verminderen.
Cell kwaliteit is van groot belang tijdens dit isolement. Gladde spiercel groei kan worden geremd door de toevoeging van een geschikte hoeveelheid heparine aan het kweekmedium. Fibroblast proliferatie kan worden vertraagd door toevoeging van D-valine met de media. Endotheliale cellen kunnen worden gekenmerkt door de opname van Dil-AcLDL en co-kleuring BS-lectine om te testen voor de zuiverheid van de bevolking.Het endotheliale cel fenotype instabiel en hun gedrag kan veranderen één keer snel genomen uit de oorspronkelijk weefsel en gekweekt. Een beperking van deze techniek is dat cellen niet worden gebruikt na 5 dagen kweken zodat zij steeds hun fenotype behouden. Het wordt sterk aanbevolen de cellen niet te passen. De primaire cellen zullen een consistente resu biedenlt.
Kortom, de techniek resulteert in een groot aantal cellen uitstaande zuiverheid. Met de vereiste vaardigheden, kan de isolatie proces binnen 6 uur worden voltooid. Het voorziet in een geweldige methode voor het verkrijgen van de muis coronaire endotheelcellen voor zowel celkweek of moleculair biologische experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de subsidie van de National Institutes of Health (HL115578 A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
