Abstract
Endotelceller linje den indre væg af blodkar og spiller en vigtig rolle i reguleringen af vaskulær tonus, vaskulær permeabilitet, og nye vaskulær formation. Endotelcelle dysfunktion er impliceret i udviklingen og progressionen af mange cardiovaskulære sygdomme, herunder iskæmisk hjertesygdom. For at undersøge funktionen og karakterisering af koronare endotelceller, celleisolering er det første skridt, og det kræver høj renhed og mængde til at udføre efterfølgende eksperimenter. Denne protokol beskriver en effektiv fremgangsmåde til isolering voksne mus koronare endotelceller. Musen hjerte dissekeres og hakket i små stykker. Efter fordøjelsen af hjertet ved hjælp dispase og collagenase II cellerne vasket og inkuberet med magnetiske kugler, der er konjugeret med anti-CD31 antistof. Perlerne med endotelceller vaskes flere gange og er klar til brug i forskellige anvendelser, herunder billeddannelse og molekylærbiologiske experimeNTS. Effektiv isolering giver ca. 10 4 celler pr ét hjerte med over 90% renhed.
Introduction
Musemodeller for forskellige kardiovaskulære sygdomme og metaboliske lidelser bærer fysiologiske og molekylære ændringer, som ligner dem, der findes i patienter. Endvidere genetisk ændring af mus er et stærkt værktøj, der giver os mulighed for at undersøge det patogene rolle af specifikke gener i udviklingen og progressionen af sygdomme. I dag, celle-typespecifikke gen-knock-in eller udtjekning mus let genereres i mange laboratorier og måling af mRNA og protein niveauer i bestemte celletyper er det første skridt i at afgøre, om musene blev virkelig genetisk modificeret.
Endotel er et tyndt enkelt lag af endotelceller (EC'er), der i indre vaskulære væg. Endotelceller spiller en kritisk rolle ved regulering af vaskulær spændinger, vaskulær permeabilitet, og nye vaskulær dannelse 1,2. Endothelial dysfunktion er et kendetegn for mange patologiske tilstande og ændringer i endotelfunktion kan føre til forskellige bil-kar sygdomme 3,4. Det er således væsentligt at studere funktionen af endotelceller under fysiologiske og patofysiologiske tilstande.
Der er flere måder at isolere EC'er 5-8 og isoleringen metode skal optimeres afhængigt af hvilke væv og arter vil blive anvendt. Dette skyldes EC'er fra forskellige væv vise en høj grad af heterogenitet med hensyn til deres overflademarkører og proteinekspression 9. Vellykket isolering af endotelceller kan ofte være udfordrende og kræver en vis grad af uddannelse og praksis. Når opnået, metoden til isolering foreslået i denne protokol viser sig at være stabile og effektive.
Det overordnede mål med denne metode er at opnå musen koronar EC'er (MCECs) af høj kvalitet og kvantitet. Selvom mængden af celler opsamlet fra et hjerte er mindre end celler opsamlet fra andre væv ved anvendelse af andre teknikker, giver denne teknik stadig better kvalitet. Renheden af endotelceller i den resulterende population er større end 90%. Således ville denne teknik være ideel til applikationer, der er afhængige af rent isolerede endotelceller såsom cell imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen på mus blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Arizona og blev udført ifølge National Institute of Health (NIH) retningslinjer.
BEMÆRK: Afsnit 1, 2 og 3 skal udføres dagen før eksperimentet opsætning.
1. Forberedelse Solutions
- CD31-buffer (50 ml)
- Tilsæt 50 ml 1 × Phosphatbufferopløsning (PBS) til et 50 ml rør. Afvej 0,05 g bovint serumalbumin (BSA) og 0,037 g ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og føje til 50 ml rør og anbringes derefter at rotere i ca. 1 time, indtil pulveret er opløst. Indstil pH til 7,4, filtreres gennem et 0,2 um filter over i en ny 50 ml rør, og opbevar ved 4 ° C indtil anvendelse.
- Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) med HEPES (500 ml)
- Tilføj 1,1915 g HEPES at gøre 10 mM HEPES i HBSS opløsning og bland godt. PH måles og justeres til 7,4. Filter og opbevares ved 4˚C.
- 1x Krebs 'opløsning (1 I)
- Der tilsættes 100 ml 10 x Krebs 'opløsning [Tabel 1] at fordoble destilleret vand i en 1 liters kolbe. Afvej 2,1 g natriumbicarbonat og 2 g D-Glucose og tilføje til kolben. Blandes og justeres den samlede mængde til 1 L.
- Boble opløsning med 95% O2 / 5% CO2 gas i 30 minutter og filter-opløsningen inden i hætten. Opbevar ved 4 ˚C og holde på is under forsøget.
2. Forberedelse af magnetiske perler
- Tilsæt 1 ml CD31 puffer i hver 1,5 ml rør (ét rør per prøve). Bland får anti-rotte IgG perler og tilsæt passende mængde til hver prøve [Tabel 1]. Ryst rørene kraftigt 30 gange og placere dem i den magnetiske plade i 1 min af omrystning. Åben tuberne mens på pladen og dump opløsningerne i en spand.
- Der tilsættes 1 ml CD31 puffer i hvert rør. Tilsæt 2 pi rotte-anti-muse CD31-antiorgan til hvert rør og rotere rørene O / N ved 4 * C.
3. Autoklavering
- Autoklavér alle kirurgi værktøjer og pipettespidser. Skær enderne af pipettespidser, så der er tips med 4 forskellige diametre, fra bredeste at smalleste. Omtrentlige diametre for de tips er 3 mm, 2,5 mm, 2 mm, og 1,5 mm. Skær spidserne og autoklaver dagen før med 30 min på sterilisering ved en temperatur på 121 * C.
BEMÆRK: Afsnit 4 - 11 bør udføres på dagen for eksperimentet.
4. Klargøring Solutions
- Forbered vaskebuffer indeholder 2% Jern-berigede kalveserum (IFCS) i M199. For billedbehandling, forberede 30 ml / mus.
- Forbered enzymopløsning (10 ml / prøve). Afvej 0,6 enhed / ml Dispase og 1 mg / ml collagenase type II i et 50 ml rør. Tilføj M199 og drej røret ved 4 ºC i 15 min. Filtreres gennem 0,2 um filter over i en ny 50 ml rør inside hætten og holde ved 4 C indtil brug.
- Forbered HBSS / HEPES med Heparin. Der tilsættes 10 ml HBSS med 10 mM HEPES i 15 ml rør. Tilsæt 100 pi heparin til røret og holde ved 4 ° C indtil anvendelse.
5. Vask perlerne
- Tag rørene med perler fra rotator ved 4 ºC og bringe til emhætten. Anbring glassene i den magnetiske plade og omrystes i 1 minut. Dump løsningen, og der tilsættes 1 ml CD31 buffer i hvert rør.
- Tag rørene ud af den magnetiske plade og rystes kraftigt 30 gange. Sæt rørene tilbage i den magnetiske plade og gentag for i alt 3 vaske. Efter afslutning, sætte rørene tilbage til 4C og med at rotere indtil anvendelse.
6. Dissektion
- Injicer musene intraperitonealt med 0,1 ml Heparin at forhindre blodkoagulation. Vente 10 minutter, derefter bedøver de mus under anvendelse intraperitoneal injektion af 0,01 ml af pentobarbital. Kontroller, om musen følersmerter ved at klemme foden.
- Placer musen på en polystyren bord med hovedet op og holde armene med stifter. Brug pincet og hårde-cut-saks til at klippe huden på øverste thorax område op til halsen.
- Lave et snit i midten af brystkassen lige over membranen. Skær knoglen sidelæns og opad mod halsen til at gøre en trekant udsætte hjertet og lungerne. Skær aorta lige over membranen.
- Hold brissel med pincet uden at trække og bruge en saks til at klippe alle bindevæv forsigtigt at fjerne lunger og hjerte sammen. Placer væv i et bæger med 1 × Krebs, ryst med pincet og overførsel til 6 cm skål med 1 × Krebs.
- Fjern lungelapperne med en saks og pincet. Sæt en 20 G sterilt kateter ind i aorta. Skyl blod i den koronare kredsløb med HBSS / Heparin. Lav et lille snit i ventriklen, ryste hjerte og overføre til et prøverør af M199. Hold rør på is.
- Overfør hjertet til en 6 cm skål fyldt med 10 ml enzymopløsning og hakkekød den i små stykker med en saks. Placer retter i 37 ºC inkubator i 15 min. Agitere fordøjede materialer ved pipettering op og ned 30 gange gennem en spids med en afskårne ende for at tillade vævet at passere gennem lettere.
- Sæt den tilbage i 37 ºC inkubator for en anden 15 min. Gentag agitation tre gange, hver gang ved hjælp af pipettespidser fra største åbninger smalleste og 15 min inkubation mellem hver.
- Efter sidste 15 min inkubation, udtage prøver ud og ind i hætten. Pipette løsningen op og ned 30 gange ved hjælp pipettespids med den smalleste åbning og passerer gennem en 40 um celle si i en ny 50 ml rør.
- Vask skålen med 10 ml vaskebuffer anvendelse af en 10 ml pipette og overføres på cellefilter. Sæt 50 ml rør i centrifugen og centrifugering ved 400 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre bundfaldet. Vask cellerne med 5 ml vaskebuffer to gange.
- Få en af den tidligere fremstillede 1,5 ml rør med perler og arbejde med ét rør ad gangen. Put en 1,5 ml rør i den magnetiske plade, ryste 3 gange og åbne den.
- Efter sidste centrifuge, fjerne så meget supernatanten som muligt uden at forstyrre pelleten. Adskille de celleklumper ved at tænde kraftigt.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer til 50 ml rør og blandes cellerne med en 1 ml pipette. Dump opløsningen fra 1,5 ml rør, og der tilsættes 1 ml af cellesuspension fra 50 ml rør til perlerne. Flick rørene 30 gange så rotere ved 4 ºC i 30 min.
9. Forberedelse til Cell Culture / Imaging
- Forbered kamre for plating celler. Tilføj gelatineopløsning (5% w / v, 300 pi) til kammeret godt at belægge overfladen og inkuberes i 30 minutter ved 37 * C. Efter inkubation remove gelatine og tør overfladen.
- Tag rørene med perler / celler efter 30 min af rotation og sat i den magnetiske plade inde i hætten. Ryst i 2 min, dump og der tilsættes 1 ml vaskebuffer.
- Tag rør ud af pladen, rystes kraftigt 30 gange så flick 30 gange. Sæt dem tilbage i magnetisk plade og ryst i 1 min. Gentag 4 gange for i alt 5 vaske, men med 1 min rystning på pladen.
- Efter den sidste vask, tage et rør og arbejde på hvert rør en ad gangen. Ryst 30 gange så svirp 30 gange. Sæt det på den magnetiske plade og ryst i 1 min. Dump og der tilsættes 1 ml 20% IFCS EF medier (forvarmet ved 37 ºC).
- Rystes kraftigt 30 gange så svirp 30 gange. Juster pipette til 500 pi og pipetteres op og ned 10 gange. Overfør 500 ul til hvert kammer.
- Sæt på 37 ºC inkubator og lade O / N. Næste dag, vaske cellerne med 10% FBS EC medier.
10. Forberedelse til Western Blot (WB) Prøver
- Take ud rørene med perler / celler efter 1 time af rotation. Læg dem i den magnetiske plade og ryst i 2 min. Dump supernatanten og tilsæt 1 ml kold HBSS. Rystes kraftigt 30 gange så svirp 30 gange. Gentag to gange for 3 vaske, men med 1 min rystning på pladen.
- Efter sidste vask, lægge rør på magnetisk plade og rystes i 1 min. Fjern puffer under anvendelse pipette og lysere cellerne for WB anvendelse af en fremgangsmåde beskrevet tidligere 11,12. Indsamlet lysat indeholder normalt omkring 30 ug protein.
11. Imaging
- Vask cellerne 3 gange med medier, med slutvolumen på 250 pi til et kammer. Tilføj 1,5 pi Dil-AcLDL til cellerne. Fra dette punkt, holde cellerne i mørke.
- Inkuber i 3,5 timer ved 37 ° C. Tilføj 1,5 pi Hoechst, bland godt og inkuberes i 30 minutter ved 37 ˚C.Wash celler med PBS og fastgøres med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Vask to gange med PBS og blokere med 5% BSA-PBS i 30 min ved stuetemperatur. Vask to gange med 1% BSA-PBS. Fortynd BS-lectin-FITC anvendelse af 1% BSA-PBS til en koncentration på 2 ug / ml, og der tilsættes 300 pi til hvert kammer.
- Sætte kammeret på orbitalryster ved stuetemperatur i 30 minutter. Vask med PBS 3 gange.
- Visualiser celler under fluorescerende mikroskop med eksponeringstid på 200 ms for FITC (Lectin farvning, en EF-markør, excitation / emission 488 nm / 519 nm), 30 msek for DAPI (Hoechst, en nuklear farvning, excitation / emission ved 358 nm / 461 nm), og 300 msek for TRITC (AcLDL farvning, en EF-markør, excitation / emission på 557 nm / 576 nm). Anskaf billeder ved hjælp af en 20X objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede isolering af koronare endotelceller fra en mus hjerte giver typisk omkring 10 4 celler med over 90% renhed med en brosten form. For en ren population af endotelceller, bør der udvises forsigtighed i hele protokollen for at sikre et sterilt miljø fri for enhver forurening. Udseendet af aflange celler eller forstørrede celler i populationen indikerer kontaminering med andre celletyper, glatte muskelceller og fibroblaster. Endotelcelle renhed testen udføres ved farvning af celler med en endotelcelleoverfladen markering, BS-lectin og AcLDL (figur 1). Procentdelen af positive celler, som udviser både farver var over 90% i MCEC. Et sådant resultat indikerer, at teknikken blev udført med succes.
| PBS (10x) (1 I) | </ Td> | ||
| Materiale | MW | Mængde (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCI | 74,55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136,08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 I) | |||
| Materiale | MW | Konc (mM) | Mængde (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCI | 74,56 | 4.7 | 3,5 |
| CaCl2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO4 • 7H 2 O | 246,5 | 1.2 | 2,96 </ Td> |
| NaH 2 PO4 | 120 | 1.2 | 1,44 |
| EF Media (20%) (500 ml) | |||
| Materiale | Beløb | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10 - 20 U / ml heparin | 500 pi | ||
| D-valin | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicillin / streptomycin | 5 ml | ||
| Mængden af perler, der skal anvendes til en mus | |||
| Til billedbehandling | 5 pi | ||
| Feller WB / PCR | 10 pi | ||
Tabel 1. kemiske sammensætninger af anvendte opløsninger.
Figur 1. Repræsentative Billeder af MCECs. Fluorescens billeder viser, at mus koronar EC'er (MCEC) isoleret fra hjerter udviser høj renhed i EF befolkning. Renhed blev testet af både AcLDL optagelse af rød farve (A) og lektin farvning i grøn farve (B) i MCEC. Kernen blev farvet af Hoechst i blå farve (C). Procentdelen af positive celler, som udviser både farver var over 90% i MCEC. Bar er repræsentativt for 20 pm. Klik her for at se et større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest anvendte endotelceller i forskning er humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) på grund af deres bekvemmelighed og let dyrkning. Men en masse forskning kræver adgang til en fysiologisk model opnås ved isolering af endotelceller fra andre specifikke organer 10. Endotelceller udgør en meget lille population af celler i hjertevævet; deres isolation og dyrkning kan vise sig at være meget vanskeligt.
Der er tre kritiske trin i denne protokol. Den første er at skylle blodet godt. Dette er nødvendigt, da leukocytter i blod også udtrykke CD31 som en celleoverflademarkør, og vil konkurrere mod EC'er for bindingen af CD31-antistoffet. Som andre endotelceller også kan være til stede i blodet, rødmen er vigtigt at forhindre forurening med sådanne celler. Det andet kritiske trin er at opretholde et sterilt miljø i hele isoleringsprocessen. Enhver forurening results i et dramatisk fald i antallet af celler opnået. Endelig er den tredje kritiske trin at justere pH af CD31 buffer, som i modsat fald vil mindske effektiviteten af isoleringen.
Cell kvalitet er vigtigst i denne isolation. Glat muskel cellevækst kan inhiberes ved tilsætning af en passende mængde heparin til dyrkningsmediet. Fibroblastproliferation kunne blive bremset ved tilsætning af D-valin til medierne. Endotelceller kan karakteriseres ved optagelsen af Dil-AcLDL og co-farvning med BS-lectin for at teste for renheden af population.The endotelcelle fænotype er ustabil og deres adfærd kan hurtigt ændre sig, når taget ud af det oprindelige væv og dyrkes. En begrænsning af teknikken er, at cellerne ikke bør anvendes efter 5 dages dyrkning for at sikre, at de stadig bevarer deres fænotype. Det anbefales kraftigt ikke at passere cellerne. De primære celler vil give en konsistent result.
Samlet set teknikken resulterer i en god antal celler af udestående renhed. Med de nødvendige færdigheder, kan isolation processen være afsluttet inden for 6 timer. Det giver en stor fremgangsmåde til opnåelse muse koronare endotelceller til enten cellekultur eller molekylær biologisk eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af bevilling fra National Institutes of Health (HL115578 til A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
