Abstract
Endotelceller linje den inre väggen av blodkärlen och spelar en viktig roll vid regleringen av det vaskulära tillståndet, vaskulär permeabilitet, och ny kärlbildning. Endothelial celldysfunktion är inblandad i utvecklingen och utvecklingen av många kardiovaskulära sjukdomar, inklusive ischemisk hjärtsjukdom. Att undersöka funktionen och karakterisering av koronara endotelceller, är cellisolering det första steget och det kräver hög renhet och mängd för att utföra efterföljande experiment. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att isolera en vuxen mus koronära endotelceller. Musen hjärta är dissekeras och hackades till små bitar. Efter uppslutningen av hjärtat med användning av dispas och kollagenas II, tvättas cellerna och inkuberas med magnetiska kulor som är konjugerade med anti-CD31-antikropp. Pärlorna med endotelceller tvättas flera gånger och är redo för användning i olika tillämpningar, inklusive avbildning och molekylärbiologisk experiments. Effektiv isolering ger ungefär 10 4 celler per ett hjärta med över 90% renhet.
Introduction
Musmodeller av olika kardiovaskulära sjukdomar och ämnesomsättningssjukdomar bära fysiologiska och molekylära förändringar som är liknande de som finns hos patienter. Dessutom är genetisk förändring av möss ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för oss att undersöka den patogena roll specifika gener i utvecklingen och utvecklingen av sjukdomar. Numera celltyp-specifik gen-knock-in eller -out möss lätt bildas i många laboratorier och mätningen av mRNA och proteinnivåer i specifika celltyper är det första steget vid bestämning av huruvida mössen verkligen genetiskt modifierade.
Endotel är ett tunt enda skikt av endotelceller (ECS) som linjer inre kärlväggen. Endotelceller spelar en avgörande roll i regleringen av vaskulär spänning, vaskulär permeabilitet och ny kärlbildning 1,2. Endoteldysfunktion är ett kännetecken för många patologiska tillstånd och förändringar i endotelfunktion kan leda till olika bildiovascular sjukdomar 3,4. Det är sålunda betydelsefullt att studera funktionen av endotelceller under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd.
Det finns flera sätt att isolera EC 08/05 och isoleringsmetoden måste optimeras beroende på vilken vävnader och arter kommer att användas. Detta beror på att EC från olika vävnader uppvisar en hög nivå av heterogenitet med avseende på deras ytmarkörer och proteinuttryck 9. Framgångsrik isolering av endotelceller kan ofta vara svårt och kräver en viss grad av utbildning och praktik. En gång uppnåtts, metoden av isolering som föreslås i detta protokoll visar sig vara stabil och effektiv.
Det övergripande målet med denna metod är att få mus krans EC (MCECs) av hög kvalitet och kvantitet. Även om den mängd av celler som samlats in från ett hjärta är mindre än celler som samlats in från andra vävnader med hjälp av andra tekniker, ger denna teknik fortfarande satsningter kvalitet. Renheten av endotelceller i den resulterande populationen är större än 90%. Således skulle denna teknik vara perfekt för applikationer som är beroende på rent isolerade endotelceller såsom cell imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen på möss godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Arizona och genomfördes i enlighet med National Institute of Health (NIH) riktlinjer.
OBS: Avsnitt 1, 2 och 3 ska utföras dagen före experimentet som installationen.
1. framställning av lösningar
- CD31-buffert (50 ml)
- Tillsätt 50 ml 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en 50 ml-rör. Väg 0,05 g bovinserumalbumin (BSA) och 0,037 g etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och tillsätt 50 ml rör och sätta röret att rotera i ungefär en timme tills pulver löser sig. Justera pH till 7,4, filtrera genom ett 0,2 pm filter in i ett nytt 50 ml rör, och förvara vid 4 ° C fram till användning.
- Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med HEPES (500 ml)
- Lägga 1,1915 g HEPES för att göra 10 mM HEPES i HBSS-lösning och blanda väl. Mäta pH och justera till 7,4. Filter och förvara vid 4C.
- 1x Krebs-lösning (1 L)
- Tillsätt 100 ml 10 × Krebs-lösning [Tabell 1] att dubbla destillerat vatten i en 1-liters kolv. Väg 2,1 g natriumbikarbonat och 2 g D-glukos och lägg till kolven. Blanda och justera den totala volymen till 1 L.
- Bubbellösning med 95% O2 / 5% CO2-gas under 30 minuter och filtrera lösningen inuti huven. Förvara vid 4 ° C och hålla på is under experimentet.
2. Förbereda magnetiska kulor
- Tillsätt 1 ml CD31 buffert i varje 1,5 ml rör (ett rör per prov). Blanda får anti-råtta IgG pärlor och tillsätt lämplig mängd till varje prov [Tabell 1]. Skaka rören kraftigt 30 gånger och placera dem i den magnetiska plattan i 1 minut av skakning. Öppna rören medan på plattan och dumpa lösningar i en hink.
- Tillsätt 1 ml CD31-buffert i varje rör. Lägg 2 | il rått-anti-mus-CD31 antikroppen till varje rör och rotera rören O / N vid 4 ° C.
3. Autoklavering
- Autoklav alla kirurgi verktyg och pipettspetsar. Skära ändarna av pipettspetsar, så att det finns tips med 4 olika diametrar, från bredaste till smalaste. Ungefärliga diametrar för tips är 3 mm, 2,5 mm, 2 mm och 1,5 mm respektive. Skära spetsarna och autoklavera dagen innan med 30 min av sterilisering vid en temperatur på 121 ° C.
OBS: Sektioner 4-11 bör utföras på dagen för experimentet.
4. framställning av lösningar
- Bered tvättbuffert innehållande 2% järn-berikade kalvserum (IFCS) i M199. För avbildning, förbereda 30 ml / mus.
- Förbered enzymlösning (10 ml / prov). Väg 0,6 enhet / ml Dispase och 1 mg / ml kollagenas typ II in i ett 50 ml rör. Lägg M199 och rotera röret vid 4 ° C i 15 minuter. Filtrera genom 0,2 pm filter in i ett nytt 50 ml rör inside huven och hålls vid 4 C fram till användning.
- Förbered HBSS / HEPES med heparin. Tillsätt 10 ml HBSS med 10 mM HEPES i 15 ml rör. Tillsätt 100 pl av Heparin till röret och hålla vid 4 C fram till användning.
5. tvättning av pärlorna
- Ta ut rören med pärlor från rotator vid 4 ° C och ta till huven. Placera rören i den magnetiska plattan och skaka i 1 min. Dumpa lösningen och tillsätt 1 ml CD31 buffert i varje rör.
- Ta rören ur den magnetiska plattan och skaka kraftigt 30 gånger. Sätta rören tillbaka i magnetplattan och upprepa för totalt 3 tvättar. Efter avslutad, sätta rören tillbaka till 4C och hålla vrida fram till användning.
6. Dissektion
- Injicera mössen intraperitonealt med 0,1 ml Heparin att förhindra blodkoagulation. Vänta 10 minuter, sedan söva möss med intraperitoneal injektion av 0,01 ml av pentobarbital. Kontrollera om musen kännersmärta genom att klämma foten.
- Placera musen på en polystyren styrelse med huvudet upp och hålla armarna med stiften. Använd pincett och tuffa-cut-sax för att skära in i huden på övre bröstområdet upp till halsen.
- Gör ett snitt i mitten av bröstkorgen precis ovanför membranet. Skära benet i sidled och uppåt mot halsen för att göra en triangel exponera hjärtat och lungorna. Skär aortan just ovanför membranet.
- Håll bräss med pincett utan att dra och använda sax för att klippa någon bindväv försiktigt för att ta bort lungor och hjärta tillsammans. Placera vävnader i en bägare med ett × Krebs, skaka med pincett och överföra till 6 cm skål med 1 x Krebs.
- Avlägsna lunglober med hjälp av sax och pincett. Sätt en 20 G steril kateter i aorta. Spola blod i kranscirkulationssystemet med HBSS / Heparin. Gör ett litet snitt i kammaren, skaka hjärtat och överföra till ett provrör av M199. Hålla rören på is.
- Överföra hjärtat till en 6 cm skål fylld med 10 ml enzymlösning och finhacka den i små bitar med hjälp av sax. Placera skålarna i 37 ° C inkubator under 15 minuter. Agitera spjälkade material genom att pipettera upp och ned 30 gånger genom en spets med en kapad ände för att tillåta vävnaden att passera genom enklare.
- Sätt tillbaka den i 37 ° C inkubator för ytterligare 15 minuter. Upprepa agitation tre gånger, varje gång med användning av pipettspetsar från största öppningarna smalaste och 15 min inkubation mellan varje.
- Efter förra 15 min inkubation, ta prover ut och in i huven. Pipettera lösningen upp och ner 30 gånger med användning av pipettspetsen med den smalaste öppningen och passera genom en 40 | im cellfilter in i ett nytt 50 ml rör.
- Tvätta skålen med 10 ml tvättbuffert med hjälp av en 10 ml pipett och överföra till cell sil. Sätta 50 ml rör i centrifugen och centrifugera vid 400 g under 10 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten. Tvätta cellerna med 5 ml tvättbuffert två gånger.
- Få en av den tidigare framställda 1,5 ml rör med pärlor och arbete på ett rör i taget. Sätt en 1,5 ml rör i den magnetiska plattan, skaka 3 gånger och öppna den.
- Efter förra centrifug, ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten. Ta avstånd cellklumpar genom att slå kraftigt.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert till 50 ml rör och blanda cellerna med en 1 ml pipett. Dumpa lösningen från 1,5 ml rör och tillsätt 1 ml av cellsuspension från 50 ml rör till pärlorna. Flick rören 30 gånger sedan rotera vid 4 ° C i 30 minuter.
9. Förberedelser för cellodling / Imaging
- Förbered kammare för plätering celler. Lägg gelatinlösning (5% vikt / volym, 300 | j, l) till kammaren väl att belägga ytan och inkubera under 30 min vid 37 ° C. Efter inkubation remove gelatin och torr yta.
- Ta ut rören med pärlor / celler efter 30 min av rotation och sätta i den magnetiska plattan inuti huven. Skaka i 2 min, dumpa och tillsätt 1 ml tvättbuffert.
- Ta rören ur plattan, skaka kraftigt 30 gånger sedan flick 30 gånger. Sätt tillbaka dem i magnetisk platta och skaka i 1 minut. Upprepa 4 gånger för totalt 5 tvättar, men med en min skakning på plattan.
- Efter den sista tvätten, ta ut ett rör och arbeta på varje rör en i taget. Skaka 30 gånger sedan flick 30 gånger. Sätt den på magnetplattan och skaka i 1 minut. Dumpa och tillsätt 1 ml 20% IFCS EG media (förvärmas vid 37 ° C).
- Skaka kraftigt 30 gånger flick sedan 30 gånger. Justera pipett till 500 l och pipettera upp och ned 10 gånger. Överför 500 l till varje kammare.
- Sätt vid 37 ° C inkubator och lämna O / N. Nästa dag, tvätta cellerna med 10% FBS EG media.
10. Förberedelser för Western Blot (WB) Prover
- Take ut rören med pärlor / celler efter en timme av rotation. Lägg dem i den magnetiska plattan och skaka i 2 min. Dumpa supernatanten och tillsätt 1 ml kall HBSS. Skaka kraftigt 30 gånger flick sedan 30 gånger. Upprepa två gånger för 3 tvättar, men med en min skakning på plattan.
- Efter sista tvättningen, lägga rören på magnetplattan och skaka i 1 minut. Ta bort buffert med hjälp av pipett och lysera cellerna för WB med hjälp av en metod som tidigare beskrivits 11,12. Insamlade lysat innehåller vanligtvis omkring 30 mikrogram av protein.
11. Imaging
- Tvätta cellerna 3 gånger med medium, med slutlig volym av 250 | il för en kammare. Tillsätt 1,5 pl av Dil-AcLDL till cellerna. Från denna punkt, hålla cellerna i mörker.
- Inkubera i 3,5 h vid 37 C. Tillsätt 1,5 | il av Hoechst, blanda väl och inkubera under 30 min vid 37 ˚C.Wash celler med PBS och fäst med 4% paraformaldehyd (PFA) under 20 min vid RT.
- Tvätta två gånger med PBS och blockera med 5% BSA-PBS i 30 min vid RT. Tvätta två gånger med 1% BSA-PBS. Späd BS-lektin-FITC med användning av 1% BSA-PBS till en koncentration av 2 | ig / ml och tillsätt 300 | il till varje kammare.
- Sätta kammaren på orbitalskak vid RT under 30 min. Tvätta med PBS 3 gånger.
- Visualisera celler under fluorescerande mikroskop med exponeringstid på 200 ms för FITC (Lectin färgning, ett EG-markör, excitation / emission 488 nm / 519 nm), 30 ms för DAPI (Hoechst, en nukleär färgning, excitation / emission vid 358 nm / 461 nm), och 300 msek för TRITC (AcLDL färgning, ett EG-markör, excitation / emission vid 557 nm / 576 nm). Förvärva bilder med hjälp av en 20X objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den framgångsrika isoleringen av koronara endotelceller från en mus hjärta ger typiskt cirka 10 4 celler med över 90% renhet med en gatsten form. För en ren population av endotelceller, bör försiktighet iakttas i hela protokollet för att säkerställa en steril miljö fri från föroreningar. Uppkomsten av långsträckta celler eller förstorade celler inom populationen indikerar kontaminering med andra celltyper, glatta muskelceller och fibroblaster. Endotelcell renhet test utförs genom att färga celler med en endotelcell ytmarkör, BS-lektin och AcLDL (fig 1). Procentandelen positiva celler som uppvisar båda färgerna var över 90% i MCEC. Ett sådant resultat tyder på att tekniken har genomförts framgångsrikt.
| PBS (10x) (1 L) | </ Td> | ||
| Material | MW | Mängd (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCl | 74,55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6,1 | |
| KH 2 PO 4 | 136,08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L) | |||
| Material | MW | Konc (mM) | Mängd (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCl | 74,56 | 4,7 | 3,5 |
| CaCl2 • 2 H2O | 147 | 1,8 | 2,6 |
| MgSO 4 • 7 H2O | 246,5 | 1,2 | 2,96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,2 | 1,44 |
| EG-medier (20%) (500 ml) | |||
| Material | Belopp | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10-20 U / ml heparin | 500 ^ | ||
| D-valin | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicillin / streptomycin | 5 ml | ||
| Mängden pärlor som skall användas för en mus | |||
| för avbildning | 5 pl | ||
| Feller WB / PCR | 10 pl | ||
Tabell 1. Kemisk sammansättning av lösningar som används.
Figur 1. Representativa bilder från MCECs. Fluorescensbilder visar att mus coronary ECS (MCEC) isolerad från hjärtan uppvisar hög renhet i EG befolkningen. Renhet testades både AcLDL upptag av röd färg (A) och lektin färgning i grön färg (B) i MCEC. Kärnan färgades av Hoechst i blå färg (C). Procentandelen positiva celler som uppvisar båda färgerna var över 90% i MCEC. Bar är representativ för 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest använda endotelceller i forskning är mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC) på grund av deras bekvämlighet och odling. Men en hel del forskning kräver tillgång till en fysiologisk modell uppnås genom isolering av endotelceller från andra specifika organ 10. Endotelceller utgör en mycket liten population av celler i hjärtvävnaden; deras isolering och odling kan visa sig vara mycket svårt.
Det finns tre viktiga steg i detta protokoll. Den första är att spola blod väl. Detta är nödvändigt, eftersom leukocyter inom blod också uttrycka CD31 som en cellytmarkör, och kommer att tävla mot EC för bindningen av den CD31-antikroppen. Som andra endotelceller också kan vara närvarande i blodet, rodnad är viktigt att förhindra kontaminering av sådana celler. Det andra kritiska steget är att bibehålla en steril miljö under hela isoleringsprocessen. Kontaminering Results i en dramatisk minskning av antalet celler uppnås. Slutligen är det tredje kritiskt steg för att justera pH-värdet i CD31 buffert, som underlåtenhet att göra detta kommer att minska effektiviteten av isoleringen.
Cellernas kvalitet är viktigast under denna isolering. Glattmuskelcelltillväxt kan hämmas genom tillsats av en lämplig mängd av heparin till odlingsmediet. Fibroblastproliferation kunde saktas ned genom tillsats av D-valin till mediet. Endotelceller kan kännetecknas av upptag av Dil-AcLDL och co-färgning med BS-lektin för att testa för renheten hos population.The endotelceller fenotyp är instabilt och deras beteende kan förändras snabbt en gång tas ur den ursprungliga vävnaden och odlas. En begränsning av tekniken är att cellerna inte bör användas efter 5 dagars odling för att säkerställa att de fortfarande bibehåller sin fenotyp. Det rekommenderas starkt att inte passera cellerna. De primära cellerna kommer att ge konsekvent Result.
Sammantaget resulterar tekniken i ett stort antal celler av enastående renhet. Med den kompetens som krävs, kan isoleringen processen vara avslutad inom sex timmar. Det ger en bra metod för att erhålla mus krans endotelceller för antingen cellkultur eller molekylärbiologisk experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (HL115578 till A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
