Summary
För att detektera friska celler i hela djur som innehåller låga halter av kaspas-aktivitet, var mycket känsliga biosensorn betecknad CaspaseTracker genereras för Drosophila. Kaspas-beroende biosensor aktivitet upptäcks i långlivade friska celler genom de inre organen av vuxna djur som fötts upp under optimerade betingelser i frånvaro av döds stimuli.
Introduction
Kaspaser är cysteinproteaser som förmedlar apoptotisk celldöd genom att klyva många intracellulära proteiner efter viktiga aspartat rester. Till exempel, initiator kaspaser aktivera effektor kaspaser, derepress DNA nukleaser, klyver cytoskelettala komponenter och förändra lipidkompositionen av cellmembran för att snabbt avveckla celler och stimulera deras erkännande och omvälvning av angränsande celler som omhändertar cell lik. 1-4 Det uppskattas att miljarder celler dör per dag i den mänskliga kroppen, och apoptos är en viktig mekanism för kemoterapiinducerad tumörcelldöd. 5 en annan uppsättning av caspaser kan orsaka celldöd av distinkta icke-apoptotiska processer för att stimulera medfödd immunitet. 6 Därför den mesta forskningen på kaspaser har fokuserat på sina pro-döden funktioner.
Intressant tidiga tecken på området visade att samma kaspaser ansvarar för att främja celldöd har också icke-död fSpecialfunktioner. Banbrytande studier har visat att kaspaser är involverade i olika cellulära funktioner i friska celler, inklusive reglering av celltillväxt och migration under fosterutvecklingen. 7-9 Kaspaser krävs för spermatid individualisering i Drosophila 10,11, för att blockera ett alternativ necroptotic celldöd vägen i möss 12,13, och mikroRNA bearbetning i C. elegans. 14,15 I kanske längsta bodde celler, neuroner, kaspaser och andra apoptotiska maskiner är inblandade i regleringen av nervaktivitet genom beskärning synaptiska ändelser, en process tros vara nödvändigt att stärka andra synapser för inlärning och minne. 16- 18 Det är möjligt att kaspaser underlättar synaptiska beskärning av en typ av mini-apoptos av små neuronala projektioner utan hela celldöd. 19 emellertid kaspaser kan ha alternativa funktioner inte har samband med apoptos-liknande händelser. 20,21 dubbla rollsi liv och död är inte unika för kaspaser, BCL-2 familjeproteiner och cytokrom c har roller i cell energier i friska celler, men är också en del av kärnan apoptotiska vägen som aktiveras av många typer av cellstress. 22-25 Även om det inte bevisat, verkar det logiskt att evolutionen har kopplat dag -jobb till döds jobb inom samma molekyler för att snabbt avskaffa olämpliga eller oönskade celler.
För närvarande är de molekylära mekanismerna för icke-apoptotiska kaspas-aktivitet inte förstått, och omfattningen av icke-apoptotiska kaspas aktivitet under embryonal utveckling och i vuxna vävnader är inte heller känt. En stor utmaning är att det är svårt att skilja dagsjobb från döds jobb kaspaser. I motsats till apoptos och pyroptosis, när kaspasaktivitet förstärks av en proteolytisk kaskad, är dags jobb kaspaser förväntas ske vid mycket lägre nivåer av enzymatisk aktivitet, sannolikt under upptäckt av många tillgängliga teknologies.
Före det arbete som presenteras här, andra utvecklat en rad olika caspase biosensorer för olika ändamål. Scat biosensorer (t.ex. ECFP-DEVD-Venus) snabbt upptäcka realtid kaspas-aktivitet i odlade celler och djurvävnader med hjälp av FRET. 26,27 Vid caspase klyvning, kärn riktade GFP delen av Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) genomgår subcellulära relocalization inom några minuter när dess plasmamembran-tjuder klyvs av kaspaser. 28 Likaså ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes från cytosolen till kärnan på caspase klyvning. 29,30 Mer nyligen kromoforen i iCasper skickligt konstruerad för att fluorescera när klyvs av kaspaser, medger detektering av biosensoraktivitet i realtid i nervceller i Drosophila embryon, men framför allt i samband med utvecklings celldöd. 31 kaspas-beroende död lukt neuroner under åldrandet var demonstrankad av immuno-detektion av kaspas-klyvd form av CPV biosensorer (t.ex. mCD8-PARP-Venus). 32,33 Viktigt var den aktiverade formen av kaspas-3 detekterades i frånvaro av celldöd genom känsliga immunostain i taggar i odlade nervceller, och i soma med hjälp av kaspas-beroende fluorescens av kärn CellEvent reporter färgämne, men svårigheter påträffades på grund av fototoxicitet, men celldöd försenades tills efter eliminering ryggraden. 19 Således nya kaspas biosensorer behövs för att upptäcka och spåra celler med basal kaspas-aktivitet in vivo.
För att övervinna dessa svårigheter, genererade vi en ny dubbel färg kaspas biosensor, betecknad CaspaseTracker. Denna strategi kombinerar en modifierad version av Drosophila kaspas känsliga Apoliner biosensor 28 med Drosophila G-TRACE FRT rekombinassystem 34 för att permanent märka och spåra celler in vivo. <sup> 35 Den Gal4-aktiverade G-TRACE systemet tillåter mycket låga nivåer av kaspaser att aktivera CaspaseTracker, vilket resulterar i RFP uttryck i cytoplasman och permanent kärninriktade GFP-uttryck i någon cell som någonsin har upplevt kaspas-aktivitet. 35 Detta system kan märka celler under hela livet i hela djur med användning av Drosophila melanogaster, en lätthanterlig och mycket använt modellsystem för studium av kaspaser och celldöd. 36-38
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av CaspaseTracker Flies
- För att förbereda CaspaseTracker (DQVD) flyger för experiment, utföra inlägg: UBI-CaspaseTracker x G-trace (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi> Stopp> GFP-NLS), genom att överföra 7-10 virgin kvinnor (eller män) flugor bär kaspas biosensor substratet mCD8-DIAP1-Gal4 driven av ubikitinpromotorn 35 tillsammans med samma antal män (eller kvinna) G-TRACE flugor, som har den andra kromosomen cyo balancer att undvika letaliteten av den homozygota kombination av G- SPÅR (UAS-RFP, UAS-FLP, och Ubi> Stoppa> GFP-NLS) 34. Plats flugor i en färsk mat flaska med färsk jäst pasta som proteinkälla.
- Inkubera filer vid 18 ° C under 5 till 7 dagar (max 2 veckor) och sedan ta bort den överordnade flyger från flaskan för att undvika överbeläggning med nya avkomma, och att inrätta nya avels flaskor.
- Fortsätta inkubation vid 18 ° C tills avkomman flugor Eclose. Välj icke-cyo [icke-cURLy vinge] avkomma av korrekt genotyp CaspaseTracker, som är transgena för CaspaseTracker och G-Spårelement 35.
- Samtidigt generera styrföräldra icke-transgena w118 flugor och kaspas-okänsliga (DQVA) flugor parallellt att kontrollera specifika CaspaseTracker RFP och GFP-fluorescens.
- Utför PCR genotypning för att bekräfta filer med CaspaseTracker med hjälp av primers: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, som producerar en produkt 3897 bp. För genotypning G-Trace loci, använda följande primers för GFP (474 bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; för RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; och för Flpase (655 bp), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. För genotypning Gal4 i pUWR vektorn (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.
2. Vävnadsberedning, Färgning och Montering
- För flyga dissektioner, förhindra dissekerade vävnader fastnar till plast pipettspetsar och centrifugrör, päls tips och rör med 1% bovinserumalbumin (BSA) löst i vatten.
- Dissekera flyger på en silikonkudde med pincett.
- För att undvika skador på tips av tång på en hård yta när du utför vävnaden dissektion, utföra dissektion på en kiselyta. För att göra silikon dissektion plattor, smälta kislet i kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner (Materials List). Efter smältning av silikon, tillsätts 3 till 4 ml till en 60 mm vävnads diameter odlingsskål. Kisel rätter kan återanvändas.
- Söva en fluga med CO2, och överföra den till en silikonplatta med 1 ml kall PBS. Presentera CO2 till en flaska innehållande farten med hjälp av en blåsrör, och sedan överföra sövda flyga toa Pad som har en CO2 leverans.
- Använda en pincett för att hålla farten huvudet, och ett andra par av pincett för att dra bröstkorgen i den motsatta riktningen för att koppla bort flugan huvudet från det organ som täcker utan att skada förbindelsen mellan huvudet och foregut.
- Använd 2 par pincett för att ta bort vingar och ben från bröstkorgen.
- Använd en pincett för att hålla bröstkorgen, och en annan pincett att dra buken för att separera den från bröstkorgen igen utan att skada förbindelsen mellan foregut och midgut.
- Dissekera inre organ, inklusive hjärnan, gut, malpighian tubuli och äggstockar som tidigare visats. 39-41
- Ta bort alla delar av nagelband och fett organ med pincett eftersom dessa vävnader producerar starka autofluorescens. Tålamod och praxis är skyldiga att upprätta en komplett organsystem som visas.
- Överför dissekerade vävnader till 1,5 ml centrifugrör och fixa vävnader with 0,5 ml 4% paraformaldehyd i PBS (fosfatbuffrad saltlösning) vid RT under 20 till 30 min med rotation i mörker för att undvika blekning RFP och GFP i vävnaderna. Undvik långvarig fixering som kan äventyra efterföljande färgningsresultat.
- Avlägsna paraformaldehyden genom försiktig pipettering och tvätta 3 gånger med 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) vid rumstemperatur.
- Permeabilisera vävnader med 0,5 ml PBST vid 4 ° C över natt med försiktig skakning. Kortare inkubationer kan orsaka ofullständiga permeabilization och kompromissfärgningsresultat.
- Om det är nödvändigt att minska bakgrundsfärgning, överväga att inkubera vävnader i 0,5 ml PBST med 1% BSA, i stället för PBS.
- Tvätta vävnaderna 3 gånger med 0,5 ml PBST.
- Att färga kärnor och fintrådiga aktin (F-aktin), applicera 0,5 ml PBST med 10 mikrogram / ml Hoechst 33342 blå kärn färgämne och 0,3 iM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-aktin fläck och inkubera samtidigt med vävnader under 1 h vid RT w: te varsam rotation i mörker. Undvik långvarig färgning, eftersom detta kommer att öka bakgrunden.
- För immunfärgning, inkubera fasta och permeabiliserades vävnader med 0,1% Triton X-100 i 0,5 ml PBS över natt vid 4 ° C, fläcken med 1: 100 utspädning av anti-Elav antikropp eller med ett: 200 utspädning av anti-caspas-3 natten vid 4 ° C (300 | il). Följa av motsvarande sekundär antikropp utspädd 1: 100 och inkubera i 1 till 3 h vid RT. Se Material Lista för specifik antikropp information.
- Tvätta vävnaderna 3 gånger, varje gång under 5 min i 0,5 ml PBST med försiktig rotation.
- Med en pipett, ta bort alla PBST, och sedan lägga till 200 mikroliter anti-blekmedel monteringsmedel (se material) för att helt täcka vävnader för 1-3 timmar vid RT, eller 4 ° C över natten. Optimala vävnader som till fullo har absorberat monteringsmedel kommer att sjunka till botten av röret.
- Pre-rengör glasskiva med vatten eller 70% etanol och överföra vävnader med fästmedel för glass bild.
- Placera försiktigt en glaskupa halka över vävnaderna. Applicera vaselin på objektglas och täckglaset för att undvika att förstöra vävnaden genom överkompression. Ta extra monteringsmedel med silkespapper.
- Försegla locket glida genom att tillämpa nagellack längs kanterna på täckglas för att undvika läckage av monteringsmedel från vävnaderna.
3. konfokalmikroskopi
- Använd en inverterad konfokala epi-fluorescensmikroskop. Emellertid kan upp-rätta mikroskop också användas. För att avbilda vävnader med hjälp av plattsättning, upprätthålla en stabil rumstemperatur för att undvika avdrift av fokus och förskjutning av xy-planet på grund av den termiska expansionen och kontraktionen av komponenterna. Miljö styrsystem och fokus glida kompensationssystem bidra till att undvika detta problem på grund av förlust av termo jämvikt av mikroskopsystemet.
- Placera bilden på scenen av mikroskopet. Ta några testbilder med hjälp av låg upplösning (125 x 125 pixlar) end bestämma lämpligt antal plattor som krävs för att täcka hela regionen av intresse (ROI).
- Ställ in svepmikroskopsystem för att ta bilder med skanningsupplösningen som 500 x 500 pixlar. Välj målet som en 20X NA 0,8 eller en 63X NA 1,4 Plan-Apochromat mål för att analysera vävnader genom täckglas, så att var och en av bilder (plattor) överlappar med 20% på alla sidor.
- Ställ in bildsekvensen från längst till kortaste excitationsvåglängder, som den långa våglängd orsakar lägre fotoblekning. Sekvensen från längsta till kortaste excitationsvåglängd är: (i) 633 nm för Phalloidin F-aktin och för antikropp till aktiverade kaspaser, (ii) 561 nm för RFP, (iii) 488 nm för GFP, och (iv) 405 nm för Hoechst nukleär färgning.
- Under avbildning, minimera exponeringen av celler till fluorescerande laser excitation under avbildningsprocessen för att undvika fotoblekning genom att minska laserintensiteten för att erhålla högkvalitativa bilder av vävnader kvalitet.
- Efter jagmagiker samlas, sammanfoga bilderna med hjälp mikroskop programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns två viktiga komponenter som gör det möjligt CaspaseTracker att upptäcka kaspas-aktivitet i normala friska celler (Figur 1A). Den första av dessa är en 146 aminosyra kaspas-klyvbar polypeptid modellerad efter kaspas biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Denna polypeptid är härledd från DIAP1 (Drosophila inhibitor av apoptos) innehållande en enda naturligt förekommande caspas webbplats som klyvs under apoptos typiskt av kaspas DrICE. 42,43 DrICE motsvarar kaspas-3 i däggdjur och klyver mest kända cellulära substrat. 4,32 Karakteristiskt för kaspaser, DIAP1 och dess härledda polypeptiden klyvs efter en viss asparaginsyra, Asp20 ligger inom kaspas erkännande sekvens 17-DQVD-20, och mutation av den obligatoriska Asp20 rest till Ala (DQVA) upphäver klyvning. 42,43 likhet med Apoliner, 28 denna DIAP1 fragment är anchorött i cytoplasman vid plasmamembranet via mus CD8 (alfa kedjan aminosyror 1-220), ett ofta använt verktyg i Drosophila. CD8 membranankare förhindrar varje tjudrad last som bär en nukleär transloka sekvens (nucGFP i fallet med Apoliner) från translokera till kärnan i frånvaro av kaspas-aktivitet. 28 Den andra nyckelkomponent i CaspaseTracker är Drosophila G-TRACE system i vilket jästtranskriptionsfaktorn Gal4 inducerar uttrycket av flippas (FLP) rekombinas (och samtidigt inducerar RFP). 34 Flippase skär ut ett stoppkodon leder till permanent uttryck av nucGFP. För att göra G-TRACE reagerar för kaspas-aktivitet, var det i kombination med den Apoliner systemet genom att tjudra Gal4, som krävs för att aktivera G-TRACE, till plasmamembranet-förankrade kaspas-klyvbar DIAP1 fragmentet av Apoliner (Figur 1a). 35
Vi gjorde ytterligare modifIKATION till Apoliner komponenten i CaspaseTracker att förbättra användbarheten. Viktigast av allt, är det viktigt att kaspas biosensor själv inte hämmar kaspaser, potentiellt bevara celler som annars skulle dö. Även om Apoliner transgen inte orsakade tydliga fenotyper i Drosophila 28, som kan förväntas av en potent kaspas-inhibitor skulle även enstaka bevarandet av celler motverka syftet att identifiera normala celler med kaspas-aktivitet. Men det DIAP1 fragmentet i Apoliner innehåller ett motiv (135-DICG-138) som senare visade sig potent hämma DrICE, samma kaspas som klyver DIAP1 på 43 Mekanismen för kaspas hämning Asp20. Avslöjades av en kristallstruktur i vilken DIAP1 Asp135 är bunden till DrICE aktiva stället som en kaspas substrat härma (men inte klyvs). 43 biokemisk analys visade att en Arg substitution vid Asp135 upphäver DrICE hämmande funktion. 43 Därför, CaspaseTracker var konstruerad med samma D135R mutation att undvika kaspas inhibition (Figur 1b). 35 I likhet med Apoliner, var den naturligt förekommande DIAP1 Asn-Asn sekvensen vid de novo N-terminal efter klyvning vid Asp20 ändrades till Gly-Val i CaspaseTracker att förhindra nedbrytning av Gal4 av N-ändregeln vid kaspas klyvning (Figur 1b). 28 Dessutom smält vi en myc-tag till C-terminalen av Gal4 för redo detektion av CaspaseTracker uttryck. 35 av nödvändighet, Apoliner egen RFP och nucGFP kassetter ströks för att göra den kompatibel med G-TRACE, som även innehåller RFP och nucGFP. 28,35
Eftersom Gal4 bär sin egen nukleär lokaliseringssignal och kraftigt aktiverar transkription via sitt mål-DNA-svarselement (UAS) när sammansmält med andra transgener i Drosophila, förmodligen bara ett fåtal molekyler av Gal4 rellättas genom cytoplasmatiska kaspaser är tillräckliga för att slå på RFP uttryck inom några timmar (uppskattat ≤12 h). Eftersom biosensoraktivitet kräver de novo transkription och translation av RFP, det inte rapportera i realtid enzymatisk aktivitet. Även CaspaseTracker RFP kommer att degraderas avsevärt sannolikt inom en dag efter kaspas verksamhet upphör, kommer nucGFP uttryckas av ubiquitin promotor för livet av cellen och dess avkomma.
Att först visa att CaspaseTracker reagerar på kaspasaktivering in vivo, var vuxna CaspaseTracker biosensor flugor utsätts för celldöd framkallande stimuli. Drosophila äggstocken är en väl studerad celldöd modell som ägg kammare genomgår programmerad celldöd när djuren är stressade, en förmodad mekanism för att matcha miljöförhållanden avkomma produktion. 37,44,45 att inducera celldöd, biosensor flugor var kall chockade 1 h vid -7° C (frysning djuren), och äggstockar dissekerades från levande djur nästa dag (Figur 2a). I motsats till obehandlade biosensor flugor, ägg kamrarna efter köldchock var märkbart mindre och uppvisade stark röd (senaste) och grön (permanent) biosensoraktivitet, kontrollera biosensor aktivering efter en celldöd stimulus (figur 2b, slå samman). Biosensor aktivitet detekterades i kärnan av både könsceller (sjuksköterska celler och ägg) och somatiska celler (follikelstimulerande celler) i ägg kammare, men endast i de behandlade flugor. 35 morfologier karakteristiska för apoptos var också lätt observeras i biosensorpositiva ägg kamrar inklusive nukleär fragmentation, DNA kondens och nedbrytning (förlust av blånad). Biosensoraktivitet kan detekteras i samma celler med både nukleär kondensation (Hoechst) och aktiva kaspaser (immunostain), men den mest intensiva färgningen för aktiva kaspaser inträffat i områden där både nukleärt DNA och caspase biosensor signaler minskas eller försämrade (Figur 2b). 46,47 celldöd mekanismer som inträffar efter kallchock är inte väl karakteriserade, och andra mekanismer döds kan vara på spel. Emellertid erhölls liknande resultat följande aminosyra svält, vilket är känt för att orsaka apoptos. 35
För att bestämma om CaspaseTracker kunde upptäcka icke-apoptotiska kaspas-aktivitet, var de inre organen hos friska en dag gamla flugor minutiöst dissekeras genom att ta bort autofluorescent nagelband och fett. Vävnader från en enda representativ fluga fixerades monterad, färgades med Hoechst för att markera kärnor och med Phalloidin fläck för F-aktin för att detektera muskelceller. I motsats till friska ägg kammare, som saknar biosensor aktivering av F-aktin-färgade muskelceller mellan ägg kamrarna hade både röd och grön biosensor-aktivitet (figur 3a, infälld). Det är emellertid möjligt att den biosensor etiketter även andra celler. Många andra friska vävnader och organ optimalt uppfödda en dag gamla flugor uppvisade framträdande kaspas biosensor aktivitet förmodligen återspeglar basal icke-apoptotiska kaspas-funktion (figur 3a). Biosensor-positiva celler dök morfologiskt normala och inträffade i organiserade mönster i vävnader som tyder på att specifika delmängder av celler aktiverar kaspaser, till exempel ränder av biosensor-positiva celler omslag hindgut (figur 3a, infälld).
Det bästa beviset på att CaspaseTracker är en specifik reporter av caspaser är bristen på signalen i flugor som uttrycker styr biosensor, som är identisk med CaspaseTracker undantag för en enda Asp till Ala aminosyra mutation vid den obligatoriska kaspas-klyvningsstället, ändra DQVD till DQVA ( Figur 1b och 3b). Med undantag för en exceptionellt sällsynt cell (Figur 3b, grön pil), den enda signalen Observed i DQVA kontrollbiosensor flugor är autofluorescerande strukturer, såsom mundelar (figur 3b) och intas mat i grödan och på andra ställen (figur 3b och 4), som också observerats i icke-transgena föräldra flugor som saknar kaspas biosensor. 35 de CaspaseTracker-märkta cellerna inträffar med jämna mellanrum längs malpighian (njure) tubuli och ofta uppvisar både nyligen (röd) och tidigare (grön) kaspasaktivering samtidigt, medan många celler i hjärnan, optiska lober, magmunnen, skörd, midgut och äggledare är antingen röda eller gröna (figurerna 4 och 5a).
För bevis på att långlivade celler kan överleva kaspas-aktivitet, var synnerven lob immun för pan-neuronal markör Elav (embryonal dödlig onormal syn). 48 Kärnorna hos många neuroner var dubbla märkt med kärn riktade GFP från CaspaseTracker och Elav, i linje med långlivade cells använder kaspaser för icke-döds funktioner (figur 5B). Dessutom, om biosensorn är avstängd i 10 dagar (med Gal80ts), biosensor-positiva celler kvarstår så länge i tarmen (figur 6a och b), hjärna och på andra ställen (ej visad). Använda kaspas biosensor CaspaseTracker, ger vi den första översikt över basala kaspas-aktivitet i hela djur.
Figur 1: CaspaseTracker biosensorsystem för detektering av icke-apoptotiska kaspas-aktivitet. (a) Komponenter i Drosophila kaspas biosensor. (b) Den kaspas-klyvbar del av CaspaseTracker biosensorsystem är sammansatt av en plasmamembranankare (mCD8), ett fragment av DIAP1 innehållande en naturlig kaspas-spaltningsställe Asp20 fusionerad till Gal4-transkription faktor med en C-terminal 3x-myc tag och uttrycks via ubiquitin promoter. Caspase klyvning resulterar i translokation av Gal4 till kärnan för att inducera G-TRACE systemet. I ett kontroll biosensor, är den erforderliga Asp20 resten i 4-aminosyra kaspas-klyvningsställe (DQVD) ändrats till Ala (DQVA) att avskaffa caspase klyvning. Transgena CaspaseTracker flugor innehåller 4 transgener. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CaspaseTracker aktiveras av kaspaser under celldöd. (a) Schematisk bild av Drosophila äggstocken och flödesschema för köldchock celldöd. Drosophila äggstock ritning (från Polan Santos) och Drosophila bild (av Darren Obbard) används med tillstånd. (b) ägg kammare från äggstocken av 6- dag kvinnlig CaspaseTracker flugor fed w te normal fluga mat för 6 dagar (obehandlade) eller en dag efter köldchock (-7 ° C, en timme, följt av 25 ° C under 24 h) för att inducera kaspas-aktivering i ägg kammare. Utvidgningar av kallbehandlat äggstock (nere till höger ramar) visar tre ägg kammare i ett utvecklings ovariole kedja (ungefär centrerade vertikalt) med bevis på kärn kondens (topp ägg kammare), nukleär fragmentation (mitten ägg kammare och inläggningar) och nedbrytning (lägre ägg kammare) baserat på Hoechst DNA-färgen (blå). Aktiva kaspaser (anti-kaspas-3, magenta) upptäcks i mellersta och nedre ägg kammare. RFP och GFP biosensoraktivitet (röd, grön och gula pilar) förekommer i celler med kärn-DNA kondens som ofta färgas diffust med aktiva kaspaser (sätter in). Vita pilar markerar kärnor som saknar både biosensoraktivitet och aktiv kaspas immunostain. * Autofluorescens signaler. Dessa data återges med tillstånd från Tang et al., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bevis för utbredd fysiologisk kaspas-aktivitet. (a) Sammanslagen konfokal bild av CaspaseTracker (DQVD) RFP och nucGFP från en enda nyligen eclosed fluga upp vid 18 ° C, dissekeras och färgades med H33342 för kärnor och Phalloidin för F-aktin (rosa), och avbildas med DIC. Phalloidin visas endast i infällda för ägg kammare. (B) Samma förfarande och avbildningsbetingelser följdes under kontroll CaspaseTracker (DQVA) flugor. * Autofluorescent strukturer. Dessa data återges med tillstånd från Tang et al., Sci Rep 2015. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.
Figur 4:. Basal kaspas-aktivitet i många vävnader Högre förstoringar av DIC och fluorescens konfokala bilder av GFP (tidigare) och RFP (senaste) CaspaseTracker (DQVD) aktivitet och Hoechst-färgade kärnor i hjärnan, övre magmunnen, skörd, midgut, Malpighian tubuli och äggledarna från figur 3a. * Autofluorescent strukturer. Dessa data återges med tillstånd från Tang et al., Sci Rep 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Icke-apoptotiska kaspas-aktivitet i nervceller i Drosophila optisk lob. (a) DIC och konfokala bilder med RFP (senaste) och GFP (tidigare) CaspaseTracker (DQVD) aktivitet och Hoechst-färgade kärnorna i hjärnan. RFP + GFP dubbelmärkta celler (gula pilar). (B) NucGFP colocalizes med immunostain för pan neuronal nukleär Elav protein i synnerven lob av CaspaseTracker (DQVD) flyga hjärnan. Neuroner med samlokaliserade signaler om NucGFP och Elav visas (vita pilar). Observera RFP-märkta neuroner förekommer inte i detta område. Dessa data återges med tillstånd från Tang et al., Sci Rep 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi bygg- och inre arbetet i CaspaseTracker som underlättar upptäckt av omfattande basal kaspas-aktivitet i friska vävnader. De kritiska stegen för detektering av icke-apoptotiska kaspas-aktivitet in vivo är: 1) att generera flugor med biosensor transgen, 2) kontrollera kaspas-specifik reporter funktion med lämpliga kontroller, 3) tränar dissekering tekniker för att observera alla system av vuxna Drosophila inre organ, och 4) särskiljande biosensoraktivitet från autofluorescerande artefakter.
Det naturliga kaspas-klyvbar polypeptid som fungerar som den kaspas-specifik sensor modifierades för att undvika varje kaspas-hämmande aktivitet genom biosensorn. Ytterligare modifikationer gjordes för att undvika snabb nedbrytning av Gal4 transkriptionsfaktor, och insättningen av en epitopmärkning. Vi beskriver också hela kroppen organ dissektion av flugor, immunfärgning, montering och konfokalmikroskopi flyga vävnads för att upptäcka icke-apoptotiska kaspas-aktivitet.
Medan CaspaseTracker är idealisk för detektering av celler som överlever med låga nivåer av kaspasaktivitet, är det inte en reporter av realtidsenzymaktivitet, eftersom flera timmar krävs för att slå på biosensorn. Emellertid har vi inte bestämt den minsta tid på detektering, som sannolikt mycket kortare än vad som behövs för de tillämpningar som beskrivs här. I motsats till CaspaseTracker, är den huvudsakliga begränsningen av andra caspase biosensorer deras oförmåga att detektera låga nivåer av kaspas-aktivitet, eftersom de är utformade primärt för att studera celldöd. Kaspas-aktivitet förstärks efter en celldöd stimulans, orsakade omfattande cell rivning på mindre än 30 minuter. 49 Därför är upptäckt av caspase-aktivering ofta antas vara en markör för vissa celldöd. 50,51 Men montera bevis tyder på att kaspaser har icke-apoptotiska, även icke-nedbrytande funktioner hos friska celler. 7-21 Den PRESUMed låga nivåer av spatialt och temporärt begränsade enzymatisk aktivitet av kaspaser som utför deras dag jobb är sannolikt under detektions av tillgänglig teknik. Detta problem övervinns genom CaspaseTracker, vilket sannolikt kräver få kaspas klyvningshändelser för att generera stabila signaler, och inte kräver pågående kaspas enzymatisk aktivitet för att permanent märka dessa celler in vivo.
Bevisen som presenteras indikerar att CaspaseTracker är specifik för kaspaser, även om vi inte kan utesluta att andra oidentifierade Asp-specifika proteaser kan aktivera CaspaseTracker. Men flugor matning med en cocktail av kaspas-inhibitor peptider blockerar CaspaseTracker aktivitet (opublicerad). Vi betonar också vikten av att undvika biosensorer som själva hämmar kaspaser, och vikten av kontroll biosensorer och icke-transgena flugor för att undvika felaktiga slutsatser på grund av autofluorescens inneboende insekten nagelbanden, inre fett depositter, intagen föda eller andra confounders.
En annan utmaning är att skilja pro-döden och icke-döds funktioner kaspaser. Pro-död och icke-döds funktioner kan kopplas evolutionärt för att övergången celler mellan en normal fysiologisk tillstånd till ett lämpligt tids död, till exempel utbyggnad av immunceller för att bekämpa en infektion och efterföljande eliminering av dessa celler för att förhindra cancer. Vi kan alltså inte utesluta möjligheten att en del av den observerade basal kaspas-aktivitet i inre organ är i stället ett försök att främja celldöd, till synes i linje med de uppskattade tiotals miljarder cell dödsfall inträffar dagligen i människokroppen. 52 Den friska morfologi av celler som uttrycker biosensor indikerar starkt att CaspaseTracker kan upptäcka kaspas-aktivitet avsedd för normal dags jobb kaspaser.
Kaspaser föreslås att ha icke-döds roller som cellspridning. Detta överensstämmer med tidigare försök att generera däggdjurscellinjer som stabilt uttrycker virala proteiner som binder och direkt inhiberar cellulära kaspaser (t.ex. crmA). Medan hundratals cellkolonier uppstod under drogselektion med den tomma styrvektorn oväntat noll kolonier som bildas i parallella kulturer transfekterade med vektor som uttrycker kaspas-hämmare (opublicerade). Således, kaspaser har sannolikt omfattande funktioner i normala celler som för närvarande är underskattad. Detta stöds ytterligare av upptäckten att basala biosensoraktivitet i CaspaseTracker flugan detekteras i många celltyper i de flesta organsystem, inklusive neuroner, i normala friska flugor. Friska kaspas-aktivitet i nervceller kan avveckla synaptiska ändelser för att främja normal hjärnfunktion genom att klyva samma substrat som under apoptos, eller deras dag jobb funktioner kan vara helt skild från apoptos liknande aktiviteter. Medan låg kontra hög enzymatiska nivåer av aktivkaspaser kan vara en viktig skillnad mellan dag-jobb och celldöd, det finns få Knockin muterade djur med specifika kaspas-uncleavable substrat som stöder denna möjlighet. 17,53 visar dock den senaste utvecklingen att kaspas-8 hämmar necroptosis eventuellt genom att klyva RIPK, 54 synaptiska depression och AMPA-receptor endocytos kan regleras genom kaspas klyvning av Gap43, 55 och mikroRNA bearbetning kan regleras genom kaspas klyvning av Dicer. 14,15,56
Det finns många fler tillämpningar av denna biosensor. För att avgöra om kaspaser aktiveras vid specifika tidpunkter eller i specifika vävnader, uttryck av biosensorn kan lätt regleras tidsmässigt (t.ex. med hjälp av Gal80ts) och i specifika celltyper (t.ex. luktspecifika Gal4 förare). Använda Gal80ts att undertrycka biosensor uttryck tills uppkomsten av vuxna flugor fortfarande resulterade i omfattande biosensoraktivitet, vilket indikerar att caspases kan aktiveras på vuxna stadier (figur 6c och d). 35 Genom att ersätta DIAP1 fragmentet med andra kaspas substrat, andra applikationer kan innefatta biosensorer som är specifika för olika kaspaser och för att detektera klyvning av specifika substrat. Den CaspaseTracker Biosensor kommer att öka vår förståelse av den roll som icke-apoptotiska kaspas aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Polan Santos och Darren Obbard för Drosophila illustrationer i Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena för användning av JHMRI insectary. Detta arbete stöddes av Life Science Research Foundation gemenskap (HLT), University Nämndens i Hongkong AoE / B-07/99 (MCF), och NIH bidrag NS096677, NS037402 och NS083373 (JMH). Ho Lam Tang är en Shurl och Kay Curci Foundation Fellow av Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
References
- Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
- Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
- Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
- Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
- Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
- Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
- Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
- Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
- Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
- Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
- Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
- Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
- Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
- Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
- Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
- Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
- To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
- Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
- Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
- Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
- Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
- Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
- Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
- Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
- Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
- Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
- Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
- Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
- Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
- Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
- Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
- Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
- Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).
