Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In vivo Biosensor Tracks Ikke-apoptotisk Caspase aktivitet i Drosophila

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

For at detektere sunde celler i hele dyr, der indeholder lave niveauer af caspaseaktivitet, blev den meget følsomme biosensor betegnet CaspaseTracker genereret for Drosophila. Caspase-afhængige biosensor aktivitet detekteres i langlivede raske celler i hele de indre organer af voksne dyr, der er opdrættet under optimerede betingelser i fravær af død stimuli.

Introduction

Caspaser er cysteinproteaser, som medierer apoptotisk celledød ved spaltning mange intracellulære proteiner efter centrale aspartatrester. For eksempel, initiator-caspaser aktivere effektor-caspaser, derepressere DNA nukleaser, spalter cytoskeletale komponenter, og ændre lipidsammensætning af cellemembraner til hurtigt demontere celler og stimulere deres anerkendelse og engulfment ved naboceller, som bortskaffer cellen lig. 1-4 Det anslås at milliarder af celler dø per dag i det menneskelige legeme, og apoptose er en vigtig mekanisme af kemoterapi-induceret tumor celledød. 5 et andet sæt af caspaser kan forårsage celledød ved distinkte ikke-apoptotiske processer til at stimulere medfødte immunitet. 6 Derfor, mest forskning i caspaser har fokuseret på deres pro-død funktioner.

Interessant første undersøgelsesresultater på området afslørede, at de samme caspaser ansvarlige for at fremme celledød har også ikke-død funktioner. Banebrydende undersøgelser har vist, at caspaser er involveret i forskellige cellulære funktioner i raske celler, herunder reguleringen af celledeling og migrering under embryogenese. 7-9 Caspaser er nødvendige for sædcelleantal individualisering i Drosophila 10,11, for at blokere en alternativ necroptotic celledød vej i mus 12,13, og for microRNA forarbejdning i C. elegans. 14,15 I måske de længste levede celler, neuroner, caspaser og andre apoptotisk maskiner er impliceret i reguleringen af neuronal aktivitet ved beskæring synaptiske slutninger, en proces menes være vigtigt at styrke andre synapser for indlæring og hukommelse. 16- 18. Det er muligt, at caspaser lette synaptisk beskæring af en type mini-apoptose af bittesmå neuronale projektioner uden hele celledød. 19 imidlertid caspaser kan have alternative funktioner ikke er relateret til apoptose-lignende begivenheder. 20,21 dobbeltrolles i liv og død er ikke enestående for caspaser; BCL-2 familie proteiner og cytochrom c har roller i cellulære energetik i sunde celler, men er også en del af kernen apoptosecyklus, der aktiveres af mange typer af celle stress. 22-25 Selvom det ikke er bevist, synes det logisk, at evolutionen har kædet dag -jobs til døden-jobs inden for de samme molekyler at sikre rettidig eliminering af uegnede eller uønskede celler.

På nuværende tidspunkt er de molekylære mekanismer i ikke-apoptotisk caspaseaktivitet ikke forstået, og omfanget af ikke-apoptotisk caspaseaktivitet under embryonisk udvikling og i voksent væv vides heller ikke. En stor udfordring er vanskeligheden ved at skelne dag-job fra død-job af caspaser. I modsætning til apoptose og pyroptosis, når caspase aktivitet forstærkes af et proteolytisk kaskade, der forventes at forekomme ved meget lavere niveauer af enzymatisk aktivitet, sandsynligvis under påvisning af mange tilgængelige techn dag-job caspaserologies.

Før arbejdet præsenteret her, andre har udviklet en række caspase biosensorer til forskellige formål. De SCAT biosensorer (f.eks ECFP-DEVD-Venus) hurtigt opdage realtid caspase aktivitet i dyrkede celler og animalske væv ved hjælp FRET. 26,27 Ved caspase spaltning, den nukleare målrettet GFP-delen af Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) undergår subcellulær relocalization inden for minutter, når dens plasmamembran-tether spaltes af caspaser. 28 Tilsvarende ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes fra cytosolen til cellekernen ved caspase-spaltning. 29,30 Mere for nylig blev kromoforen i iCasper ødelagde manipuleret til at fluorescere ved spaltning ved caspaser, hvilket tillader påvisning af biosensor aktivitet i realtid i neuroner i Drosophila embryoner, men primært i forbindelse med udviklingstoksicitet celledød. 31 Caspase-afhængig død olfaktoriske neuroner under lagringen var demonstbedømt af immuno-påvisning af caspase-spaltet form af CPV biosensorer (f.eks mCD8-PARP-Venus). 32,33 vigtigt, blev den aktiverede form af caspase-3 påvises i fravær af celledød ved følsomme immunofarvningsprocedure i ryggen på dyrkede neuroner, og i soma hjælp af caspase-afhængig fluorescens af nukleare CellEvent reporter-farvestof, men vanskeligheder har man mødt på grund af foto-toksicitet, selvom celledød blev forsinket til efter rygsøjlen elimination. 19 er således behov for nye caspase biosensorer til påvisning og spore celler med basal caspase-aktivitet in vivo.

For at overvinde disse vanskeligheder, genereret vi en ny dual farve caspase biosensor, betegnet CaspaseTracker. Denne strategi kombinerer en modificeret version af Drosophila caspase-følsomme Apoliner biosensor 28 med Drosophila G-TRACE FRT rekombinasesystem 34 permanent mærke og spore celler in vivo. <sup> 35 Gal4-aktiverede G-TRACE system tillader meget lave niveauer af caspaser at aktivere CaspaseTracker, hvilket resulterer i RFP udtryk i cytoplasmaet og permanent nuklear målrettet GFP-ekspression i en celle, der nogensinde har oplevet caspase aktivitet. 35 Dette system kan mærke celler hele livet i hele dyr ved hjælp Drosophila melanogaster, en tractable og udbredte modelsystem til undersøgelse af caspaser og celledød. 36-38

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af CaspaseTracker Flies

  1. For at forberede CaspaseTracker (DQVD) flyver til forsøg, udføre denne indlæg: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi> Stop> GFP-NLS), ved at overføre 7-10 jomfru kvindelige (eller mand) fluer bærer caspase biosensor substrat mCD8-DIAP1-Gal4 drevet af ubiquitinpromotoren 35 sammen med det samme antal mænd (eller kvinde) G-TRACE fluer, som har den anden kromosom cyo balancer at undgå letalitet den homozygote kombination af G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, og Ubi> Stop> GFP-NLS) 34. Sted flyver i en frisk mad hætteglas med frisk gær pasta som proteinkilde.
  2. Inkuberes filer ved 18 ° C i 5 til 7 dage (højst 2 uger) og derefter fjerne den forælder flyver fra hætteglasset for at undgå overbelægning med nye afkom, og at etablere nye avl hætteglas.
  3. Fortsæt inkubation ved 18 ° C, indtil afkom flyver Eclose. Vælg den ikke-cyo [non-curlY fløj] afkom af den korrekte genotype CaspaseTracker, som er transgene for CaspaseTracker og G-sporstoffer 35.
  4. Samtidig genererer kontrol forældrenes ikke-transgene w118 fluer og caspase-ufølsom (DQVA) fluer parallelt at kontrollere specifikke CaspaseTracker RFP og GFP-fluorescens.
  5. Udfør PCR genotypebestemmelse at bekræfte filer med CaspaseTracker anvendelse af primerne: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, der producerer en 3.897 bp produkt. Til genotypebestemmelse G-Trace loci, bruge følgende primere til GFP (474 ​​bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; for RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; og for Flpase (655 bp), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. For genotypebestemmelse Gal4 i pUWR vektor (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT KAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Tissue Forberedelse, Farvning og Montage

  1. For flyve dissektioner, forhindre dissekeret væv klistrer til plast pipettespidser og centrifugerør, frakke tips og rør med 1% bovint serumalbumin (BSA) opløst i vand.
  2. Dissekere fluer på en silikone pude med en pincet.
    1. For at undgå at beskadige spidsen af ​​tangen på en hård overflade, når du udfører vævet dissektion, udføre dissektion på en silicium overflade. For at gøre silikone dissektion plader, smelte silicium i den kommercielle kit ifølge producentens instruktioner (Materialer List). Efter smeltning af silicone, tilsættes 3 til 4 ml til en 60 mm tissue diameter dyrkningsskål. Silicon retter kan genbruges.
    2. Bedøver en flue med CO 2, og overføre det til en silikone plade med 1 ml kold PBS. Indføre CO 2 til et hætteglas indeholdende fluen ved hjælp af en blæsepistol, og derefter overføre den bedøvede flyve toa Pad, der har en CO 2 forsyning.
    3. Brug en pincet til at holde fluen hoved, og et andet par pincet til at trække thorax i den modsatte retning for at afbryde fluen hoved fra kroppen dækker uden at beskadige forbindelsen mellem hovedet og fortarm.
    4. Brug 2 par pincet til at fjerne de vinger og ben fra brystkassen.
    5. Brug en pincet til at holde thorax, og en anden pincet til at trække maven at adskille den fra brystkassen igen uden at beskadige forbindelsen mellem fortarm og midttarm.
    6. Dissekere indre organer, herunder hjerne, tarm, Malpighian tubuli og æggestokke som tidligere demonstreret. 39-41
    7. Fjern alle stykker af neglebånd og de fede organer med pincet, da disse væv producerer stærke autofluorescens. Tålmodighed og praksis er forpligtet til at udarbejde en komplet organsystem som vist.
  3. Overfør dissekerede væv til 1,5 ml centrifugerør, og løse væv with 0,5 ml 4% paraformaldehyd i PBS (phosphatpufret saltvand) ved stuetemperatur i 20 til 30 min med rotation i mørke for at undgå blegning RFP og GFP i vævene. Undgå langvarig fiksering, der kan kompromittere efterfølgende farvningsresultater.
  4. Fjern paraformaldehyd ved forsigtig pipettering og vask 3 gange med 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) ved stuetemperatur.
  5. Permeabilisere vævene med 0,5 mL PBST ved 4 ° C natten over med forsigtig omrystning. Kortere inkubationer kan forårsage ufuldstændige permeabilisering og kompromis farvning resultater.
    1. Hvis det er nødvendigt at reducere baggrundsfarvning, overveje inkubere væv i 0,5 ml PBST med 1% BSA i stedet for PBS.
  6. Vask vævet 3 gange med 0,5 ml PBST.
  7. Til at farve kerner og filamentøse actin (F-actin), anvendes 0,5 ml PBST med 10 ug / ml Hoechst 33342 blå nuklear farvestof og 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-actin pletten og inkuberes samtidigt med væv i 1 time ved stuetemperatur wi'te forsigtig rotation i mørke. Undgå langvarig farvning, da dette vil øge baggrunden.
    1. For immunfarvning, inkuber fikseret og permeabiliseret væv med 0,1% Triton X-100 i 0,5 ml PBS natten over ved 4 ° C, pletten med 1: 100 fortynding af anti-ELAV antistof eller med 1: 200 fortynding af anti-caspase-3 natten over ved 4 ° C (300 pi). Følge ved at den tilsvarende sekundære antistof fortyndet 1: 100 og inkuberes i 1 til 3 timer ved stuetemperatur. Se Materialer Liste for specifikt antistof information.
  8. Vask vævet 3 gange, hver i 5 minutter i 0,5 ml PBST med forsigtig rotation.
  9. Med en pipette, fjerne alt PBST, og derefter tilsættes 200 pi anti-blegemiddel monterings middel (se materialer) til helt at dække væv i 1-3 timer ved stuetemperatur eller 4 ° C natten over. Optimale væv, der har fuldt absorberet monteringselementet middel vil synke til bunden af ​​røret.
  10. Pre-rengøre glasplade med vand eller 70% ethanol og overføre væv med montering middel til glass dias.
  11. Placer forsigtigt et dækglas over væv. Anvend vaseline til objektglas og dækglasset for at undgå at ødelægge vævet ved overkompression. Fjern ekstra montering agent med silkepapir.
  12. Forsegl dækglasset ved at anvende neglelak langs kanterne af dækglasset for at undgå lækage af montering midler fra vævet.

3. Konfokal mikroskopi

  1. Brug en omvendt konfokal epi-fluorescens mikroskop. Dog kan op-rigtige mikroskoper også anvendes. Til billedet væv ved hjælp af fliser, opretholde en stabil rumtemperatur for at undgå afdrift af fokus og skift af xy-planet på grund af den termiske udvidelse og sammentrækning af komponenterne. systemer miljøstyring og fokus afdrift erstatningsordninger bidrage til at undgå dette problem på grund af tab af termo-ligevægt af mikroskopet systemet.
  2. Placer dias på scenen af ​​mikroskopet. Tag et par test billeder med lav opløsning (125 x 125 pixels) end bestemme den passende antal fliser, der er nødvendige for at dække hele regionen af ​​interesse (ROI).
  3. Indstil mikroskopet scanning system til at tage billeder med scanningsopløsning såsom 500 x 500 pixels. Vælg målet, såsom en 20X NA 0.8 eller en 63X NA 1.4 Plan-Apochromat mål til analyse væv gennem dækglas, således at hver af billederne (fliser) overlapper med 20% på alle sider.
  4. Opsætning billedet sekvens fra længst til korteste excitationsbølgelængder, som den lange bølgelængde lys får lavere foto-blegning. Sekvensen fra længste til korteste excitationsbølgelængde er: (i) 633 nm for Phalloidin F-actin og for antistoffer til aktiverede caspaser, (ii) 561 nm for RFP, (iii) 488 nm for GFP, og (iv) 405 nm i Hoechst nuklear farvning.
  5. Under billedbehandling, minimere eksponering af celler for fluorescerende laser excitation under billeddannelse proces for at undgå foto-blegning ved at reducere laser intensitet for at opnå kvalitet billeder af væv høje.
  6. efter jegmagikere indsamles, flette billeder ved hjælp af mikroskop software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der er to vigtige komponenter, der tillader CaspaseTracker at detektere caspaseaktivitet i normale sunde celler (figur 1A). Den første af disse er en 146 aminosyre caspase-spaltelig polypeptid modelleret efter caspase biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Dette polypeptid er afledt af DIAP1 (Drosophila inhibitor af apoptose) indeholdende en enkelt naturligt forekommende caspase site, der spaltes under apoptose typisk af caspase DrICE. 42,43 DrICE svarer til caspase-3 i pattedyr og spalter mest kendte cellulære substrater. 4,32 Karakteristisk af caspaser, DIAP1 og dens afledte polypeptid spaltes efter en specifik asparaginsyre, Asp20 placeret i caspasegenkendelsesstedet sekvens 17-DQVD-20, og mutation af den obligatoriske Asp20 rest til Ala (DQVA) afskaffer spaltning. 42,43 Ligner Apoliner, 28 dette DIAP1 fragment er anchorød i cytoplasmaet på plasmamembranen via muse CD8 (alfa kæde aminosyrerne 1-220), et udbredt redskab i Drosophila. CD8 membran-anker forhindrer enhver tøjret last bærer en nuklear translokation sekvens (nucGFP i sagen Apoliner) fra translokere til kernen i fravær af caspaseaktivitet. 28 Den anden nøglekomponent i CaspaseTracker er Drosophila G-TRACE system, hvor gærtransskriptionsfaktor Gal4 inducerer ekspressionen af flippase (FLP) rekombinase (og samtidig inducerer RFP). 34 flippase udskærer en stopkodon fører til permanent ekspression af nucGFP. For at gøre G-TRACE reagerer på caspaseaktivitet, blev det kombineret med Apoliner systemet ved tethering Gal4, som kræves for at aktivere G-TRACE, til plasmamembranen-forankrede caspase-spaltelig DIAP1 fragment af Apoliner (figur 1a). 35

Vi gjorde yderligere modifaf tekniske data til Apoliner komponent CaspaseTracker at forbedre nytte. Mest vigtigt er det kritisk, at caspase biosensor selv ikke hæmmer caspaser, potentielt bevare celler, som ellers ville dø. Selvom Apoliner transgen ikke forårsagede åbenlyse fænotyper i Drosophila 28, som man ville forvente af en potent caspaseinhibitor, ville endda lejlighedsvis konservering af celler besejre det formål at identificere normale celler med caspase aktivitet. Men DIAP1 fragmentet i Apoliner indeholder et motiv (135-DICG-138), som efterfølgende viste sig at kraftigt inhiberer DrICE, den samme caspase der spalter DIAP1 på Asp20. 43 Mekanismen for caspase hæmning blev afsløret af en krystalstruktur, hvor DIAP1 Asp135 er bundet ind i DrICE aktive sted som et caspase substrat mimic (men er ikke spaltes). 43 Biokemisk analyse har vist, at en Arg substitution ved Asp135 afskaffer DrICE-inhiberende funktion. 43 Derfor, CaspaseTracker blev bygget med den samme D135R mutation at undgå caspase inhibering (figur 1b). 35 Svarende til Apoliner, blev det naturligt forekommende DIAP1 Asn-Asn sekvens i de novo N-terminus efter spaltning ved Asp20 ændret til Gly-Val i CaspaseTracker for at forhindre nedbrydning af Gal4 af N-ende-reglen ved caspase spaltning (figur 1b). 28 Desuden har vi fusioneret en myc-tag til den C-terminale ende af Gal4 til let påvisning af CaspaseTracker ekspression. 35 af nødvendighed Apoliner egen RFP og nucGFP kassetter blev slettet for at gøre den forenelig med G-TRACE, som også indeholder RFP og nucGFP. 28,35

Fordi Gal4 bærer sin egen kernelokaliseringssignal og kraftigt aktiverer transskription via sin mål-DNA respons element (UAS), når fusioneret til andre transgener i Drosophila, formentlig kun få molekyler i Gal4 rellettes ved cytoplasmatiske caspaser er tilstrækkelige til at tænde RFP ekspression inden for få timer (anslåede ≤12 h). Fordi biosensor aktivitet kræver de novo-transkription og translation af RFP, betyder det ikke rapporterer realtid enzymatisk aktivitet. Selvom CaspaseTracker RFP vil blive væsentligt forringet sandsynligt inden for en dag efter caspase aktivitet ophører, vil nucGFP udtrykkes ved ubiquitinpromotoren for livet af cellen og dens afkom.

At først vise, at CaspaseTracker er lydhøre over for caspaseaktivering in vivo blev voksen CaspaseTracker biosensor fluer udsat til celledød-fremkaldende stimuli. Den Drosophila æggestokken er en velundersøgte celledød model som æg kamre gennemgår programmeret celledød, når dyrene er stressede, en formodet mekanisme matchende miljøforhold til afkom produktionen. 37,44,45 at inducere celledød, biosensor fluer var koldt-chokeret 1 time ved -7° C (frysning af dyrene), og ovarier blev dissekeret fra levende dyr næste dag (figur 2a). I modsætning til ubehandlede biosensor fluer, æg kamre efter kuldechok var mærkbart mindre og udstillet robust rød (seneste) og grøn (permanent) biosensor aktivitet, kontrol biosensor aktivering efter en celledød stimulus (figur 2b, flette). Biosensor-aktivitet blev detekteret i kernerne i begge kimceller (sygeplejerske-celler og oocytter) og somatiske celler (follikelceller) i æg kamre, men kun i de behandlede fluer. 35 morfologier karakteristisk for apoptose, blev også let iagttaget i biosensor-positive æg kamre herunder nuklear fragmentering, DNA kondens og nedbrydning (tab af blåsplint). Biosensor aktivitet kan påvises i de samme celler med både cellekernekondensation (Hoechst) og aktive caspaser (immunofarvningsprocedure), men den mest intens farvning for aktive caspaser forekom i områder, hvor både nuklear DNA og caspase biosensor signaler blev mindsket eller nedbrudt (figur 2b). 46,47 celledød mekanismer opstår efter kold-stød er ikke godt karakteriseret, og andre død mekanismer kan være på spil. Imidlertid blev lignende resultater opnået følgende aminosyresekvens sult, som er kendt for at forårsage apoptose. 35

For at bestemme om CaspaseTracker kunne detektere ikke-apoptotisk caspaseaktivitet, blev de indre organer af raske 1 dag gamle fluer omhyggeligt dissekeret ved at fjerne autofluorescerende kutikula og fedt. Væv fra en enkelt repræsentant flue blev fastsat, monteret, farvet med Hoechst for at markere kerner og med Phalloidin pletten for F-actin til at opdage muskelceller. I modsætning til sunde æg kamre, som mangler biosensor aktivering, de F-actin-farvede muskelceller mellem æg kamre havde både rød og grøn biosensor-aktivitet (figur 3a, indsat). Det er imidlertid muligt, at biosensor mærker også andre celler. Mange andre sunde væv og organer i optimalt opdrættes 1 dag gamle fluer udviste fremtrædende caspase biosensor aktivitet formentlig afspejler basal ikke-apoptotisk caspase funktion (figur 3a). Biosensor-positive celler optrådte morfologisk normale og forekom i organiserede mønstre i væv tyder på, at bestemte delmængder af celler aktiverer caspaser, f.eks striber af biosensor-positive celler indpakning stortarmen (figur 3a, indsat).

Det bedste bevis for, at CaspaseTracker er en specifik reporter af caspaser er manglen på signal i fluer udtrykkende kontrollen biosensor, der er identisk med CaspaseTracker bortset fra en enkelt Asp til Ala aminosyre mutation ved den obligatoriske caspasespaltningssted, skiftende DQVD til DQVA ( Figur 1b og 3b). Bortset en usædvanlig sjælden celle (figur 3b, grøn pil), den eneste signal observed i DQVA kontrol biosensor fluer er autofluorescerende strukturer, såsom munddele (figur 3b) og indtaget føde i afgrøden og andre steder (figur 3b og 4), som også observeret i ikke-transgene parentale fluer, der mangler caspase biosensor. 35 de CaspaseTracker-mærkede celler foretages jævnligt langs de Malpighian (nyre) tubuli og ofte udviser både nyere (rød) og tidligere (grøn) caspaseaktivering samtidigt, mens mange celler i hjernen, optiske lapper, Cardia, afgrøde, mellemtarmen og æggeleder er enten røde eller grønne (figur 4 og 5A).

For dokumentation for, at langlivede celler kan overleve caspase aktivitet, blev den optiske lap immunfarvet for pan-neuronal markør ELAV (embryonale dødbringende synsforstyrrelser). 48 kerner af mange neuroner blev dobbelt mærket med nuklear målrettet GFP fra CaspaseTracker og ELAV, overensstemmelse med langlivet ceLLS bruger caspaser for ikke-død funktioner (figur 5b). Hvis endvidere biosensor er slukket i 10 dage (ved hjælp Gal80ts), biosensor-positive celler fortsætter for varigheden i tarmen (figur 6a og b), hjerne og andre steder (ikke vist). Brug af caspase biosensor CaspaseTracker, giver vi den første overblik over basal caspase aktivitet i hele dyr.

figur 1
Figur 1: CaspaseTracker biosensor til detektering ikke-apoptotisk caspaseaktivitet. (a) Komponenter i Drosophila caspase biosensor. (b) Caspase-spaltelig del af CaspaseTracker biosensor system består af en plasmamembran anker (mCD8), et fragment af DIAP1 indeholdende en naturlig caspase-spaltningssted Asp20 fusioneret til Gal4-transskription faktor med en C-terminal 3x-myc-mærket og udtrykt via ubiquitin promoter. Caspase spaltning resulterer i translokation af Gal4 mod kernen for at inducere G-TRACE system. I en kontrolgruppe biosensor, er den nødvendige Asp20 rest i 4-aminosyre caspasespaltningssted (DQVD) ændret til Ala (DQVA) at afskaffe caspase-spaltning. Transgene CaspaseTracker fluer indeholder 4 transgener. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: CaspaseTracker aktiveres af caspaser under celledød. (a) Skematisk af Drosophila æggestok og flowdiagram for kuldechok-induceret celledød. Drosophila ovarie tegning (af Polan Santos) og Drosophila billede (af Darren Obbard) anvendes med tilladelse. (b) æg kamre fra æggestokkene af 6- dag kvindelige CaspaseTracker fluer fodret w i'te normal flue fødevarer i 6 dage (ubehandlede) eller 1 dag efter kuldechok (-7 ° C, 1 time, efterfulgt af 25 ° C i 24 timer) for at inducere caspaseaktivering i æg kamre. Udvidelser af kold-behandlet æggestok (nederst til højre rammer) viser tre æg kamre i en udvikling ovariole kæde (centreret omtrent lodret) med tegn på nukleare kondens (øverste æg kammer), nuklear fragmentering (midterste æg kammer og mellemværker) og nedbrydning (lavere æg kammer) baseret på Hoechst DNA-farve (blå). Aktive caspaser (anti-caspase-3, magenta) er påvist i de midterste og nederste æg kamre. RFP og GFP biosensor aktivitet (rød, grøn og gul pile) forekommer i celler med kerne-DNA kondensation, som ofte farves diffust med aktive caspaser (inlays). Hvide pile markerer kerner mangler både biosensor aktivitet og aktiv caspase immunofarvningsprocedure. * Autofluorescens signaler. Disse data er gengivet med tilladelse fra Tang et al., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Bevis for udbredt fysiologisk caspase aktivitet. (a) Merged konfokal billede af CaspaseTracker (DQVD) RFP og nucGFP fra en enkelt nyligt eclosed flue rejst ved 18 ° C, dissekeret og farvet med H33342 for kerner og Phalloidin for F-actin (lyserød), og afbildet med DIC. Phalloidin vises kun i det indsatte for æg kamre. (B) den samme procedure og billedbehandling betingelser blev fulgt til styring CaspaseTracker (DQVA) fluer. * Autofluorescensproteiner strukturer. Disse data er gengivet med tilladelse fra Tang et al., Sci Rep 2015. Klik her for at se en større udgave afdette tal.

Figur 4
Figur 4:. Basal caspase aktivitet i mange væv Højere forstørrelse af DIC og fluorescens konfokale billeder af GFP (tidligere) og RFP (seneste) CaspaseTracker (DQVD) aktivitet og Hoechst-farvede kerner i hjernen, mavemunden, afgrøde, midttarmen, Malpighian tubuli og æggeledere fra figur 3a. * Autofluorescensproteiner strukturer. Disse data er gengivet med tilladelse fra Tang et al., Sci Rep 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Ikke-apoptotisk caspaseaktivitet i neuroner i Drosophila optisk lap. (a) DIC og konfokal billeder med RFP (seneste) og GFP (tidligere) CaspaseTracker (DQVD) aktivitet og Hoechst-farvede kerner i hjernen. RFP + GFP dual-mærkede celler (gule pile). (B) NucGFP colocalizes med immunofarvningsprocedure for pan neuronal nukleare ELAV protein i den optiske lap af CaspaseTracker (DQVD) flyve hjernen. Neuroner med co-lokaliserede signaler NucGFP og ELAV vises (hvide pile). Bemærk, RFP-mærkede neuroner ikke er til stede på dette særlige område. Disse data er gengivet med tilladelse fra Tang et al., Sci Rep 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi bygge- og indre funktioner i CaspaseTracker der letter påvisning af udbredt basal caspase aktivitet hos raske væv. De kritiske trin til påvisning ikke-apoptotisk caspase aktivitet in vivo er: 1) at generere fluer med biosensoren transgen, 2) at kontrollere caspase-specifikke reporter funktion med passende kontroller, 3) øve dissektion teknikker til at overholde alle interne organsystemer af voksne Drosophila, og 4) skelne biosensor aktivitet fra autofluorescerende artefakter.

Den naturlige caspase-spaltelig polypeptid, der tjener som caspase-specifikke sensor blev modificeret for at undgå enhver caspase-inhiberende aktivitet af biosensoren. Yderligere modifikationer blev foretaget for at undgå hurtig nedbrydning af Gal4 transcription faktoren, og indsættelse af et epitopmærke. Vi beskriver også hele kroppen orgel dissektion af fluer, immunfarvning, montering og konfokal mikroskopi af flyve vævs at opdage ikke-apoptotisk caspase aktivitet.

Mens CaspaseTracker er ideel til at detektere celler, der overlever med lave niveauer af caspase aktivitet, er det ikke en reporter af real-time-enzymaktivitet, som adskillige timer er påkrævet for at tænde for biosensoren. Vi har imidlertid ikke bestemt den minimale tid til påvisning, som sandsynligvis meget kortere end nødvendigt for de beskrevne anvendelser her. I modsætning til CaspaseTracker, den største begrænsning af andre caspase biosensorer er deres manglende evne til at påvise lave niveauer af caspaseaktivitet, som de er designet primært til at studere celledød. Caspase aktivitet forstærkes efter en celledød stimulus, der forårsager massive celle nedrivning på mindre end 30 min. 49 Derfor er påvisning af caspaseaktivering ofte antages at være en markør for visse celledød. 50,51 Men stigende evidens for, at caspaser har ikke-apoptotiske, selv ikke-nedbrydelige funktioner i raske celler. 7-21 Den presuwith lave niveauer af rumligt og midlertidigt begrænset enzymatiske aktivitet af caspaser, der udfører deres dag-job sandsynligvis under detektion af tilgængelige teknologier. Dette problem overvindes ved CaspaseTracker, som sandsynligvis kræver få caspase spaltningsbegivenheder at generere robuste signaler, og kræver ikke løbende caspase enzymaktivitet til permanent mærke disse celler in vivo.

Den fremlagte beviser tyder på, at CaspaseTracker er specifik for caspaser, om vi ikke kan udelukke, at andre uidentificerede Asp-specifikke proteaser kunne aktivere CaspaseTracker. Men fodring flyver med en cocktail af caspase-inhibitor peptider blokke CaspaseTracker aktivitet (ikke publiceret). Vi understreger også betydningen af ​​at undgå biosensorer, som selv hæmmer caspaser, og betydningen af ​​kontrol biosensorer og ikke-transgene fluer for at undgå fejlagtige konklusioner på grund af autofluorescens uløseligt forbundet med insekt neglebånd, intern fedt deposidder, indtaget føde eller andre confoundere.

En anden udfordring er at skelne pro-død og ikke-død funktioner caspaser. Pro-døds og ikke-døds-funktioner kan forbindes evolutionært med henblik på overgangen celler mellem en normal fysiologisk tilstand til en passende timede død, fx udvidelse af immunceller til at bekæmpe infektion og efterfølgende eliminering af disse celler til at forebygge kræft. Således kan vi ikke udelukke muligheden for, at nogle af de observerede basal caspaseaktivitet i indre organer er i stedet et forsøg på at fremme celledød, tilsyneladende i overensstemmelse med de anslåede mange milliarder celledød forekommer dagligt i menneskekroppen. 52 imidlertid den sunde morfologi af celler, der udtrykker biosensor kraftigt indikerer, at CaspaseTracker er i stand til at detektere caspaseaktivitet beregnet til normale dag-job af caspaser.

Caspaser er foreslået for at have ikke-død roller som celleproliferation. Dette stemmer overens med tidligere forsøg på at generere mammale cellelinier, der stabilt udtrykker virale proteiner, der binder og gælder inhiberer cellulære caspaser (f.eks CrmA). Mens hundredvis af cellekolonier opstod under lægemiddel-selektion med den tomme vektor kontrol, uventet nul kolonier dannet i parallelle kulturer transficeret med vektoren udtrykker caspaseinhibitorer (ikke offentliggjorte). Således caspaser sandsynligvis have udbredte funktioner i normale celler, der i øjeblikket undervurderet. Dette understøttes yderligere af konstateringen af, at basale biosensor aktivitet i CaspaseTracker fluen påvises i mange celletyper i de fleste organsystemer, herunder neuroner, i normale sunde fluer. Sund caspase aktivitet i neuroner kan afmontere synaptiske endelser at fremme normal hjernefunktion ved at spalte de samme substrater som under apoptose, eller deres dag-jobfunktioner kan være helt forskellig fra apoptose-lignende aktiviteter. Mens lav versus høje enzymatiske niveauer af aktivcaspaser kan være en kritisk skelnen mellem dag-job og celledød, der er få Knockin mutant dyr med specifikke caspase-uncleavable substrater, der understøtter denne mulighed. 17,53 seneste fremskridt indikerer imidlertid, at caspase-8 hæmmer necroptosis muligvis ved at spalte RIPK, 54 synaptiske depression og AMPA receptor endocytose kan reguleres ved caspase spaltning af Gap43, 55 og microRNA behandling kan reguleres ved caspase spaltning af Dicer. 14,15,56

Der er mange ekstra anvendelser af denne biosensor. For at bestemme om caspaser aktiveres på bestemte tidspunkter eller i specifikke væv, ekspression af biosensoren kan let reguleres tidsmæssigt (fx under anvendelse Gal80ts) og i specifikke celletyper (f.eks olfaktorisk-specifikke Gal4 drivere). Brug Gal80ts at undertrykke biosensor udtryk indtil fremkomsten af ​​voksne fluer stadig resulteret i udbredt biosensor aktivitet, hvilket indikerer, at caspases kan aktiveres ved voksne stadier (figur 6C og D). 35 Ved at erstatte DIAP1 fragmentet med andre caspase substrater, andre programmer kan omfatte biosensorer specifikke for forskellige caspaser og til detektering spaltning af specifikke substrater. Den CaspaseTracker biosensor vil øge vores forståelse af den rolle, ikke-apoptotiske caspase aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Polan Santos og Darren Obbard for Drosophila illustrationer i fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena for brug af JHMRI insektbetingelser. Dette arbejde blev støttet af Life Science Research Foundation fællesskab (HLT), University Grants udvalg af Hong Kong AOE / B-07/99 (MCF), og NIH giver NS096677, NS037402 og NS083373 (JMH). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow af Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Tags

Molekylærbiologi Caspase biosensor, apoptose ikke-apoptotiske hjerne neuroner CaspaseTracker
<em>In vivo</em> Biosensor Tracks Ikke-apoptotisk Caspase aktivitet i <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter