Summary
Pour détecter les cellules saines chez des animaux entiers qui contiennent de faibles niveaux d'activité de la caspase, le biocapteur très sensible désigné CaspaseTracker a été générée pour la drosophile. Biocapteur activité caspase-dépendante est détectée dans les cellules saines longue durée de vie à travers les organes internes des animaux adultes élevés dans des conditions optimisées en l'absence de stimuli de mort.
Introduction
Les caspases sont des protéases cystéines qui médient la mort cellulaire par apoptose par clivage de nombreuses protéines intracellulaires après les résidus aspartate clés. Par exemple, les caspases initiatrices activent les caspases effectrices, des nucléases d'ADN déréprimer, les composants du cytosquelette cliver et modifient la composition lipidique des membranes cellulaires à démonter rapidement les cellules et stimuler leur reconnaissance et phagocytose par les cellules qui se débarrassent des corps cellulaires voisins. 1-4 On estime que des milliards de cellules meurent par jour dans le corps humain, et l' apoptose est un mécanisme important de la mort des cellules tumorales induite par la chimiothérapie. 5 un ensemble différent de caspases peut provoquer la mort cellulaire par des procédés non-apoptotiques distincts pour stimuler l' immunité innée. 6 par conséquent, la plupart des recherches sur les caspases a mis l'accent sur leurs fonctions pro-mort.
Fait intéressant, la preuve précoce dans le domaine a révélé que les mêmes caspases responsables de la promotion de la mort cellulaire ont aussi non-mort fonctions. Des études pionnières ont démontré que les caspases sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires dans les cellules saines, y compris la régulation de la prolifération cellulaire et la migration au cours de l' embryogenèse. 7-9 caspases sont nécessaires pour individualiser spermatid chez la drosophile 10,11, pour bloquer une voie de mort cellulaire nécroptose alternatif chez les souris 12,13, et pour le traitement des microARN en C. . elegans 14,15 Dans peut-être les plus longue durée de vie des cellules, les neurones, les caspases et d' autres machines apoptotique sont impliqués dans la régulation de l' activité neuronale par la taille des terminaisons synaptiques, un processus considéré comme essentiel pour renforcer d' autres synapses pour l' apprentissage et la mémoire 16-. 18 Il est possible que les caspases faciliter l' élagage synaptique par un type de mini-apoptose neuronale de petites saillies , sans mort cellulaire entier. 19 Cependant, les caspases peuvent avoir d' autres fonctions sans rapport avec les événements de l' apoptose analogue. 20,21 double rôles dans la vie et la mort ne sont pas uniques à caspases; BCL-2 protéines de la famille et du cytochrome c ont des rôles en energetique cellulaires dans les cellules saines , mais font également partie de la voie apoptotique de base qui est activé par de nombreux types de stress cellulaire. 22-25 Bien que pas prouvé, il semble logique que l' évolution a lié jour -jobs à mort-emplois dans les mêmes molécules pour assurer l'élimination rapide des cellules impropres ou indésirables.
À l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires de l'activité de la caspase non apoptotiques ne sont pas comprises, et le degré d'activité de la caspase non apoptotique pendant le développement embryonnaire et dans les tissus adultes sont également inconnus. Un défi majeur est la difficulté de distinguer jour-emploi de mort-emploi de caspases. Contrairement à l'apoptose et pyroptosis, lorsque l'activité de la caspase est amplifié par une cascade protéolytique, le jour-emploi de caspases devraient se produire beaucoup plus faibles niveaux d'activité enzymatique, probablement ci-dessous la détection par beaucoup techn disponibleslogies.
Avant le travail présenté ici, d'autres ont développé une variété de biocapteurs de caspases à des fins différentes. Les biocapteurs SCAT (par exemple, ECFP-DEVD-Vénus) détectent rapidement l' activité de la caspase en temps réel dans des cellules cultivées et les tissus animaux en utilisant FRET. 26,27 Sur caspase clivage, la GFP fraction nucléaire ciblée de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subit une re - localisation subcellulaire quelques minutes lorsque sa membrane plasmique attache est clivée par les caspases. 28 de même, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-SLN) relocalise du cytosol vers le noyau lors de la caspase clivage. 29,30 Plus récemment, le chromophore dans iCasper est habilement conçu pour émettre une fluorescence lorsqu'il est clivé par des caspases, ce qui permet la détection de l' activité de biodétecteur en temps réel dans les neurones d'embryons de Drosophila, mais surtout en association avec la mort cellulaire développementale. mort 31 caspase-dépendante des neurones olfactifs au cours du vieillissement était demonstévalué par immuno-détection de la forme de biocapteurs CPV (par exemple, mCD8-PARP-Vénus) caspase-clivée. 32,33 Surtout, la forme activée de la caspase-3 a été détectée en l'absence de mort cellulaire par immunocoloration sensible dans les épines de neurones en culture, et dans le soma en utilisant la fluorescence de la caspase-dépendante du nucléaire colorant CellEvent rapporteur, mais des difficultés ont été rencontrées en raison de photo-toxicité, bien que la mort cellulaire a été retardée jusqu'à ce que la colonne vertébrale élimination. 19 Ainsi, de nouveaux biocapteurs de caspases sont nécessaires pour détecter et de suivre les cellules ayant une activité caspase basale in vivo.
Pour surmonter ces difficultés, nous avons généré un roman à double biocapteur couleur de caspase, désigné CaspaseTracker. Cette stratégie combine une version modifiée de la drosophile sensible à la caspase Apoliner biocapteur 28 avec la drosophile G-TRACE système de recombinase 34 FRT pour marquer de manière permanente et le suivi des cellules in vivo. <sup> 35 Le système G-TRACE Gal4 activé permet de très faibles niveaux de caspases pour activer CaspaseTracker, résultant dans l' expression de la DP dans le cytoplasme et l' expression permanente de la GFP nucléaire ciblée dans une cellule qui a jamais connu l' activité de la caspase 35 Ce système peut étiqueter. cellules tout au long de la vie chez les animaux entiers à l' aide de Drosophila melanogaster, un système modèle traitable et largement utilisé pour l'étude des caspases et la mort cellulaire. 36-38
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Protocol
1. Préparation des mouches CaspaseTracker
- Pour préparer CaspaseTracker (DQVD) mouches pour des expériences, effectuer cette croix: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-DP; UAS-FLP; UBI> Stop> GFP-NLS), en transférant 7-10 femelle vierge (ou masculin) les mouches portant le substrat de caspase biocapteur mCD8-DIAP1-Gal4 dirigé par le promoteur de l' ubiquitine 35 avec le même nombre de mâle (ou femelle) G-TRACE mouches, qui ont le deuxième équilibreur chromosome CYO pour éviter la létalité de la combinaison homozygote G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP et UBI> Stop> GFP-NLS) 34. Placer les mouches dans un flacon de nourriture fraîche avec de la pâte de levure fraîche comme une source de protéines.
- Incuber fichiers à 18 ° C pendant 5 à 7 jours (maximum 2 semaines) puis retirez le parent vole du flacon pour éviter la surpopulation avec une nouvelle progéniture, et de mettre en place de nouveaux flacons d'élevage.
- Continuer l'incubation à 18 ° C jusqu'à ce que la progéniture mouches éclosent. Sélectionnez le non-CYO [non-cURLy aile] progéniture du génotype correct de CaspaseTracker, qui sont transgéniques pour CaspaseTracker et G-TRACE éléments 35.
- En même temps, générer contrôle parental mouches W118 non transgéniques et caspase-insensible (DQVA) vole en parallèle pour vérifier RFP CaspaseTracker spécifique et fluorescence de la GFP.
- Effectuer le génotypage par PCR pour confirmer les fichiers avec CaspaseTracker en utilisant les amorces: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produisant un produit 3.897 pb. Pour le génotypage du locus G-Trace, utilisez les amorces suivantes pour la GFP (474 pb), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; pour RFP (258 pb), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; et Flpase (655 pb), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Pour génotypage Gal4 dans le vecteur pUWR (554 pb), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CCG, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.
2. Préparation des tissus, Coloration et montage
- Pour les dissections de mouches, de prévenir les tissus disséqués de coller aux pointes de pipette en plastique et des tubes de centrifugation, des conseils de manteau et des tubes avec de l'albumine 1% de sérum bovin (BSA) dissous dans l'eau.
- Disséquer vole sur un coussin de silicone en utilisant une pince.
- Pour éviter d'endommager les pointes des pinces sur une surface dure lors de l'exécution de la dissection des tissus, effectuer la dissection sur une surface de silicium. Pour la fabrication de plaques de silicone de dissection, faire fondre le silicium dans le kit commercial selon les instructions du fabricant (Liste des matériaux). Après la fonte de la silicone, ajouter 3 à 4 ml d'une boîte de culture tissulaire de 60 mm de diamètre. plats de silicium peuvent être réutilisés.
- Anesthésier une mouche avec du CO 2, et le transférer sur une plaque de silicone avec 1 ml de PBS froid. Introduire le CO 2 à un flacon contenant la volée en utilisant une sarbacane, puis transférer la mouche anesthésiés toa Pad qui a une alimentation de CO 2.
- Utilisez une paire de pinces pour tenir la tête de mouche, et une seconde paire de pinces pour tirer le thorax dans la direction opposée à déconnecter la tête de la mouche du corps couvrant sans endommager la connexion entre la tête et foregut.
- Utiliser 2 paires de pinces pour enlever les ailes et les pattes du thorax.
- Utilisez une paire de pinces pour tenir le thorax, et une autre paire de pinces pour tirer l'abdomen pour le séparer du thorax à nouveau sans endommager la connexion entre l'intestin antérieur et l'intestin moyen.
- Disséquer organes internes y compris le cerveau, l' intestin, les tubules de Malpighi et des ovaires comme démontré précédemment. 39-41
- Retirez tous les morceaux de la cuticule et les corps gras avec une pince que ces tissus produisent une forte autofluorescence. La patience et la pratique sont nécessaires pour préparer un système d'organe complet comme indiqué.
- Transfert des tissus disséqués à 1,5 tubes à centrifuger ml, et fixer les tissus wie 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) à température ambiante pendant 20 à 30 minutes avec rotation dans l'obscurité pour éviter le blanchiment DP et GFP dans les tissus. Éviter la fixation prolongée qui peut compromettre les résultats de coloration ultérieures.
- Retirez le paraformaldéhyde par pipetage doux et laver 3 fois avec 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à la température ambiante.
- Perméabiliser les tissus avec 0,5 ml de PBST à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce. incubations plus courts peuvent provoquer perméabilisation et de compromis coloration des résultats incomplets.
- Si cela est nécessaire pour réduire la coloration de fond, envisager l'incubation de tissus dans 0,5 ml de PBST contenant 1% de BSA, au lieu de PBS.
- Laver les tissus 3 fois avec 0,5 ml de PBST.
- Pour colorer les noyaux et l'actine filamenteuse (F-actine), appliquer 0,5 mL PBST avec 10 pg / ml de colorant Hoechst 33342 nucléaire bleu et 0,3 uM Alexa Fluor tache 633 phalloïdine F-actine et incuber simultanément avec les tissus pendant 1 h à température ambiante wvec une légère rotation dans l'obscurité. Évitez coloration prolongée car cela va augmenter l'arrière-plan.
- Pour une immunocoloration, incuber fixées et perméabilisées tissus avec 0,1% de Triton X-100 dans 0,5 ml de PBS pendant une nuit à 4 ° C, la tache avec dilution 1: 100 d'anticorps anti-ELAV ou dilution 1: 200 d'anticorps anti-caspase-3 pendant une nuit à 4 ° C (300 pi). Suivi par l'anticorps secondaire correspondant dilué à 1: 100 et on incube pendant 1 à 3 h à température ambiante. Voir la liste des matériaux d'information anticorps spécifique.
- Laver les tissus 3 fois, chacune pendant 5 min dans 0,5 ml PBST avec une légère rotation.
- Avec une pipette, enlever tous les PBST, puis ajouter 200 ul anti-eau de Javel agent de montage (voir matériaux) pour couvrir complètement les tissus pour les 1-3 h à température ambiante, ou 4 ° C pendant la nuit. tissus optimales qui ont entièrement absorbé l'agent de montage va couler au fond du tube.
- Pré-nettoyer la lame de verre avec de l'eau ou de 70% d'éthanol et de transférer les tissus avec un agent de fixation aux glass diapositive.
- Placez délicatement une lamelle de verre sur les tissus. Appliquer de la vaseline sur la lame de verre et la lamelle pour éviter de détruire le tissu par surcompression. Retirer l'agent de montage supplémentaire avec du papier de soie.
- Sceller la lamelle en appliquant le vernis à ongles tout le long des bords de la lamelle pour éviter les fuites d'agents de fixation des tissus.
3. Microscopie confocale
- Utilisez un confocal épi-fluorescence microscope inversé. Cependant, les microscopes en haut à droite peuvent être également utilisés. Pour les tissus d'image en utilisant le carrelage, de maintenir stable la température ambiante pour éviter toute dérive de focalisation et le déplacement du plan xy en raison de l'expansion et la contraction thermique des composants. systèmes de contrôle de l'environnement et des systèmes de compensation de la dérive de mise au point permettent d'éviter ce problème en raison de la perte de thermo-équilibre du système de microscope.
- Placer la lame sur la platine du microscope. Prenez quelques images de test en utilisant une faible résolution (125 x 125 pixels) d'uned déterminer le nombre approprié de tuiles nécessaires pour couvrir l'ensemble de la région d'intérêt (ROI).
- Régler le système de balayage du microscope pour capturer des images avec une résolution telle que 500 x 500 pixels à balayage. Sélectionnez l'objectif tel qu'un 20X NA 0,8 ou un objectif 63X NA 1.4 Plan-Apochromat pour analyser les tissus grâce à des lamelles de verre, de sorte que chacune des images (tuiles) recouvre de 20% sur tous les côtés.
- Mettre en place la séquence d'images de la plus longue à la plus courte longueur d'onde d'excitation, comme la lumière de longue longueur d'onde provoque inférieure photo-blanchiment. La séquence du plus long au plus court d'onde d'excitation est la suivante: (i) 633 nm pour la phalloïdine F-actine et des anticorps dirigés contre les caspases activées, (ii) 561 nm pour DP, (iii) 488 nm pour la GFP, et (iv) 405 nm pour Hoechst tache nucléaire.
- Au cours de l'imagerie, de minimiser l'exposition des cellules à fluorescence excitation laser au cours du processus d'imagerie afin d'éviter la photo-blanchiment en réduisant l'intensité du laser pour obtenir des images de haute qualité des tissus.
- Après jemages sont collectées, fusionner les images en utilisant le logiciel de microscope.
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Representative Results
Il y a deux éléments clés qui permettent CaspaseTracker de détecter l' activité des caspases dans les cellules saines normales (Figure 1a). Le premier d' entre eux est un polypeptide de la caspase-clivable 146 acides aminés calquée sur la caspase biocapteur Apoliner (figure 1b) 28 Ce polypeptide est dérivé d'DIAP1 (inhibiteur de Drosophila de l' apoptose) contenant un seul site de la caspase d' origine naturelle qui est clivé pendant l' apoptose typiquement. par la caspase Drice. 42,43 Drice équivaut à caspase-3 chez les mammifères et clive substrats cellulaires les plus connus. 4,32 Caractéristique de caspases, DIAP1 et son polypeptide dérivé sont clivés après un acide aspartique spécifique, Asp20 situés dans la reconnaissance de caspase séquence 17-DQVD-20, et la mutation du résidu Asp20 obligatoire Ala (DQVA) abolissent clivage. 42,43 similaire à Apoliner, 28 ce fragment de DIAP1 est anchorouge dans le cytoplasme à la membrane plasmique par souris CD8 (chaîne alpha acides aminés 1-220), un outil communément utilisé chez la drosophile. L'ancrage de la membrane CD8 empêche toute cargaison attaché portant une séquence de translocation nucléaire (nucGFP dans le cas de Apoliner) à partir de la translocation vers le noyau en l'absence d'activité de la caspase. 28 Le deuxième élément essentiel de CaspaseTracker est le système G-TRACE Drosophila , dans lequel le levure facteur de transcription Gal4 induit l'expression de flippase (FLP) recombinase (et induit simultanément RFP). 34 flippase excise un codon stop conduisant à l' expression permanente de nucGFP. Faire G-TRACE sensible à l' activité de la caspase, il a été combiné avec le système Apoliner en attachant Gal4, qui est nécessaire pour activer le G-TRACE au plasma membrane ancrée caspase-clivable DIAP1 fragment de Apoliner (figure 1a) 35.
Nous avons fait modif supplémentairesications à la composante Apoliner de CaspaseTracker pour améliorer l'utilité. Plus important encore, il est essentiel que la caspase biocapteur lui-même ne pas inhiber les caspases, les cellules qui seraient autrement susceptibles de mourir de conservation. Bien que le transgène Apoliner n'a pas causé de phénotypes évidentes chez la drosophile 28, comme on pouvait s'y attendre d'un inhibiteur de caspase puissant, même la préservation occasionnelle de cellules irait à l' encontre du but d'identifier les cellules normales avec l' activité de la caspase. Cependant, le fragment DIAP1 dans Apoliner contient un motif (135 DICG-138) qui a ensuite été montré inhiber puissamment Drice, le même caspase qui clive DIAP1 à Asp20. 43 Le mécanisme d'inhibition de la caspase a été révélée par une structure cristalline dans laquelle DIAP1 Asp135 est lié dans le site actif de Drice en tant que mimétique de substrat de caspase (mais n'a pas été coupé). 43 l' analyse biochimique a démontré qu'une substitution Arg à Asp135 abolit la fonction Drice inhibiteur. 43 par conséquent ,, CaspaseTracker a été conçu avec la même mutation D135R pour éviter l' inhibition de la caspase (figure 1b). 35 Comme pour Apoliner, la séquence DIAP1 Asn Asn se produisant naturellement à l'novo extrémité N-terminale après le clivage à Asp20 a été changé en Gly-Val en CaspaseTracker pour empêcher la dégradation de Gal4 par la règle N-terminale sur caspase clivage (figure 1b). 28 En outre, nous avons fusionné un myc-tag à l'extrémité C-terminale de Gal4 pour la détection prête d'expression CaspaseTracker. 35 nécessité, propre RFP Apoliner et cassettes nucGFP ont été supprimées pour le rendre compatible avec le G-TRACE, qui contient également DP et nucGFP. 28,35
Parce que Gal4 porte son propre signal de localisation nucléaire et active la transcription par l' intermédiaire de sa puissante élément de réponse d'ADN cible (UAS) lorsqu'ils sont fusionnés à d' autres transgènes chez la drosophile, probablement seulement quelques molécules de Gal4 relfacilité par caspases cytoplasmiques sont suffisantes pour activer l'expression de DP en quelques heures (environ ≤12 h). Parce que l' activité de biocapteurs nécessite de novo transcription et la traduction de la DP, il ne signale pas l' activité enzymatique en temps réel. Bien que CaspaseTracker DP sera considérablement dégradé probablement moins d'un jour après la cessation de l'activité de la caspase, nucGFP sera exprimé par le promoteur de l'ubiquitine pour la vie de la cellule et sa descendance.
D'abord démontrer que CaspaseTracker est sensible à l' activation des caspases in vivo, CaspaseTracker adulte biocapteur mouches ont été exposés à des stimuli cellulaires induisant la mort. L'ovaire drosophile est un modèle de mort cellulaire bien étudiée en tant que chambres d'oeufs subissent la mort cellulaire programmée lorsque les animaux sont stressés, un mécanisme présumé de correspondant à des conditions environnementales à la descendance production. 37,44,45 Pour induire la mort cellulaire, biocapteurs mouches étaient froid choqué 1 h à -7° C (gel des animaux), et les ovaires ont été prélevés sur des animaux vivants le lendemain (figure 2a). Contrairement aux non traités mouches de biocapteurs, les chambres d'œufs après un choc à froid étaient sensiblement plus petits et présentaient rouge robuste (récente) et vert activité (permanent) biocapteur, vérifier l' activation du biocapteur après une mort cellulaire stimulus (Figure 2b, fusion). L' activité de biocapteur a été détecté dans les noyaux des deux cellules germinales (cellules nourricières et d' ovocytes) et des cellules somatiques (cellules de follicules) dans les chambres d'oeuf, mais seulement dans les mouches traitées. 35 Les morphologies caractéristiques de l' apoptose a également été facilement observés dans les chambres d'oeuf biocapteur positif y compris la fragmentation nucléaire, la condensation de l'ADN et de la dégradation (perte de coloration bleue). Biocapteur activité peut être détectée dans les mêmes cellules à la fois la condensation nucléaire (Hoechst) et les caspases actives (immunocoloration), mais la coloration plus intense pour les caspases actives produits dans des zones où à la fois l'ADN nucléaire et CASPASsignaux de biocapteurs e ont été diminuées ou dégradées (Figure 2b). 46,47 Les mécanismes de mort cellulaire survenant après un choc à froid ne sont pas bien caractérisées, et d' autres mécanismes de mort peuvent être en jeu. Cependant, des résultats similaires ont été obtenus suite à la privation d'acide aminé qui est connu pour provoquer l' apoptose 35.
Pour déterminer si CaspaseTracker peut détecter l'activité de caspase non apoptotiques, les organes internes de santé 1 jours d'âge ont été méticuleusement disséqués vol en enlevant la cuticule et la graisse autofluorescente. Tissues à partir d'une seule mouche représentative ont été fixés, montés, colorées avec Hoechst pour marquer les noyaux et avec phalloïdine tache F-actine pour détecter les cellules musculaires. Par contraste avec les chambres d'oeufs sains, qui manquent de l' activation du capteur biologique, les cellules musculaires actine F taché entre les chambres d'œufs avaient biocapteur activité à la fois rouge et vert (Figure 3a, encart). Cependant, il est possible que la bioseRNDS marque également d'autres cellules. De nombreux autres tissus et organes de façon optimale élevés 1 jours d'âge des mouches sains ont montré une activité de biodétecteur caspase importante qui reflète probablement fonction de la caspase non-apoptotique de base (figure 3a). Cellules Biocapteur positif semblaient morphologiquement normaux et se sont produits dans les modèles organisés dans les tissus suggérant que des sous - ensembles spécifiques de cellules activent les caspases, par exemple des bandes de cellules de biocapteurs positif enveloppant l'intestin postérieur (Figure 3a, encart).
La meilleure preuve que CaspaseTracker est un journaliste spécifique de caspases est le manque de signal dans les mouches exprimant le biocapteur de contrôle, qui est identique à CaspaseTracker sauf pour une mutation d'acide aminé unique Asp Ala sur le site de clivage de la caspase obligatoire, changer DQVD à DQVA ( Figure 1b et 3b). Sauf pour une cellule exceptionnellement rare (Figure 3b, flèche verte), le seul observ signaled dans le biocapteur contrôle de DQVA mouches sont des structures auto - fluorescentes, telles que des pièces buccales (figure 3B) et des aliments ingérés dans la culture et ailleurs (figure 3b et 4), qui sont également observés chez les mouches parentales non transgéniques qui manquent biocapteur caspase. 35 les cellules CaspaseTracker marquées se produisent à intervalles réguliers le long des (reins) tubules malpighiens et souvent présentent à la fois récente (rouge) et passé (vert) l' activation des caspases simultanément, tandis que de nombreuses cellules dans le cerveau, les lobes optiques, cardia, culture, mésentéron et oviducte sont soit rouges ou verts (figures 4 et 5a).
Pour preuve que les cellules longue durée de vie peuvent survivre activité caspase, le lobe optique a été immunocolorée pour le ELAV marqueur pan-neuronal (vision anormale létale embryonnaire) 48. Les noyaux de nombreux neurones ont été doublement marquées à la GFP nucléaire ciblée de CaspaseTracker et ELAV, en accord avec la CE à long termells utilisant caspases pour les fonctions non-mort (Figure 5b). En outre, si le biocapteur est mis hors tension pendant 10 jours ( en utilisant Gal80ts), des cellules positives biocapteur persistent pendant toute la durée de l'intestin (figure 6a, b), le cerveau et ailleurs (non représentés). Utilisation de la CaspaseTracker caspase biocapteur, nous fournissons le premier aperçu de l'activité de la caspase basale chez les animaux entiers.
Figure 1: CaspaseTracker Système de biocapteur pour détecter l' activité de caspase non apoptotique. (a) Les composants de la caspase biocapteur drosophile. (b) La partie de la caspase-clivable de CaspaseTracker système biocapteur est constitué d'un ancrage à la membrane plasmique (mCD8), un fragment de DIAP1 contenant un site de la caspase-clivage naturel Asp20 fusionné à la transcription Gal4 facteur avec une étiquette de 3x-myc C-terminal et exprimé par le pro de l'ubiquitinemoter. Caspase clivage aboutit à la translocation de Gal4 au noyau pour induire le système G-TRACE. Dans un biocapteur de contrôle, le résidu Asp20 requise dans le caspase site de clivage de l'acide 4-amino (DQVD) est changé en Ala (DQVA) pour abolir caspase clivage. Transgenic CaspaseTracker mouches contiennent 4 transgènes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: CaspaseTracker est activé par les caspases lors de la mort cellulaire. (a) Schéma de Drosophila ovaire et organigramme de la mort cellulaire induite par un choc à froid. Drosophila l' image Drosophila (par Darren Obbard) dessin (par Polan Santos) ovaire et sont utilisés avec la permission. (b) des chambres d'oeufs de l'ovaire de 6- jour femelle CaspaseTracker mouches nourris w ith nourriture mouche normale pendant 6 jours (non traitées) ou 1 jour après le choc à froid (-7 ° C, 1 h, puis 25 ° C pendant 24 h) pour induire l'activation des caspases dans les chambres d'oeufs. Agrandissements de l'ovaire à froid traité (cadres en bas à droite) montrent trois chambres d'œufs dans un développement ovariole chaîne (centrée à peu près verticalement) avec des preuves de condensation nucléaire (chambre d'œuf en haut), la fragmentation nucléaire (chambre d'oeuf milieu et empiècements) et de la dégradation (œuf inférieure chambre) sur la base de Hoechst ADN tache (bleu). caspases actives (anti-caspase-3, le magenta) sont détectées dans les chambres d'oeuf moyen et inférieur. activité de DP et GFP biocapteur (rouge, flèches vertes et jaunes) se produisent dans les cellules avec la condensation de l'ADN nucléaire qui tachent souvent diffuse avec caspases actives (encarts). Les flèches blanches marquent les noyaux manquant à la fois l'activité de biocapteurs et de la caspase immunocoloration active. * Les signaux de autofluorescence. Ces données sont reproduites avec la permission de Tang et al., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Preuve de l' activité de la caspase physiologique généralisée. (a) image confocale de CaspaseTracker (DQVD) RFP et nucGFP Fusionné à partir d' une seule mouche nouvellement éclos relevée à 18 ° C, disséqués et colorés avec H33342 pour les noyaux et phalloïdine pour F-actine (rose), et imagé avec DIC. Phalloïdine est affiché uniquement dans l'encart pour les chambres d'oeufs. (B) La même procédure et d' imagerie conditions ont été suivies pour le contrôle CaspaseTracker (DQVA) vole. * Structures autofluorescents. Ces données sont reproduites avec la permission de Tang et al., Sci Rep 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandecette figure.
Figure 4:. Activité caspase Basal dans de nombreux tissus grossissements plus élevés de DIC et fluorescence images confocales de GFP (passé) et RFP (récente) CaspaseTracker (DQVD) activité et noyaux Hoechst-colorés dans le cerveau, cardia, culture, mésentéron, tubules de Malpighi et des oviductes de la figure 3a. * Structures autofluorescents. Ces données sont reproduites avec la permission de Tang et al., Sci Rep 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Activité de caspase non-apoptotique dans les neurones de la drosophile lobe optique. (a) DIC et images confocales avec RFP (récente) et la GFP (passé) CaspaseTracker (DQVD) activité et noyaux Hoechst colorés dans le cerveau. DP + GFP cellules doublement marquées (flèches jaunes). (B) NucGFP colocalisée avec immunocoloration pour pan neuronal protéine ELAV nucléaire dans le lobe optique de CaspaseTracker (DQVD) cerveau voler. Neurones avec des signaux de co-localisé de NucGFP et ELAV sont représentés (flèches blanches). Remarque, les neurones de la DP marqué ne sont pas présents dans ce domaine particulier. Ces données sont reproduites avec la permission de Tang et al., Sci Rep 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous illustrons la construction et le fonctionnement interne de CaspaseTracker qui facilitent la détection de l'activité de la caspase base largement répandue dans les tissus sains. Les étapes essentielles pour détecter l' activité de la caspase non-apoptotique in vivo sont: 1) la génération de mouches avec le transgène biocapteur, 2) la vérification de la fonction de rapporteur spécifique-caspase avec des contrôles appropriés, 3) la pratique des techniques de dissection pour observer tous les systèmes d'organes internes de la drosophile adulte, et 4) l'activité de biocapteur distinctif d'artefacts autofluorescents.
Le polypeptide de la caspase-clivable naturel qui sert de capteur spécifique à la caspase a été modifié afin d'éviter toute activité caspase-inhibition par le biocapteur. D'autres modifications ont été faites pour éviter la dégradation rapide du facteur de transcription Gal4 et l'insertion d'un marqueur d'épitope. Nous décrivons également toute la dissection du corps d'organe de mouches, immunomarquage, le montage et la microscopie confocale de tissu mouches pour détecter l'activité de caspase non apoptotique.
Alors CaspaseTracker est idéal pour la détection de cellules qui survivent avec de faibles niveaux d'activité de la caspase, il est un journaliste de l'activité enzymatique en temps réel, plusieurs heures sont nécessaires pour allumer le biocapteur. Cependant, on n'a pas déterminé le temps minimum à la détection, ce qui est probablement beaucoup plus courte que nécessaire pour les applications décrites ici. Contrairement à CaspaseTracker, la principale limitation de biocapteurs autres caspases est leur incapacité à détecter de faibles niveaux d'activité de la caspase, car ils sont conçus principalement pour étudier la mort cellulaire. L' activité de la caspase est amplifiée suite à un stimulus de la mort cellulaire, provoquant la démolition cellulaire massive en moins de 30 min. 49 Par conséquent, la détection de l' activation des caspases est souvent considérée comme un marqueur de la mort certaine de la cellule. 50,51 Cependant, les données de montage indique que les caspases ont non-apoptotique, même les fonctions non-dégradation dans les cellules saines. 7-21 Le Presude faibles niveaux d'activité enzymatique spatialement et temporairement restreint de caspases qui effectuent leur jour-emploi med sont probablement en deçà de la détection par les technologies disponibles. Ce problème est résolu par CaspaseTracker, ce qui nécessite probablement peu d' événements de clivage de la caspase pour générer des signaux robustes et ne nécessite pas l' activité de la caspase enzymatique continue pour marquer en permanence ces cellules in vivo.
La preuve présentée indique que CaspaseTracker est spécifique pour caspases, bien que nous ne pouvons pas exclure la possibilité que d'autres protéases Asp spécifiques non identifiés pourraient activer CaspaseTracker. Cependant, l'alimentation vole avec un cocktail de caspase-peptides inhibiteurs bloque l'activité CaspaseTracker (non publié). Nous soulignons également l'importance d'éviter les biocapteurs qui s'inhibent caspases, et l'importance de biocapteurs de contrôle et les mouches non-transgéniques pour éviter des conclusions erronées en raison de l'autofluorescence inhérente à la cuticule des insectes, la graisse interne depoassis, ingéré de la nourriture ou d'autres facteurs de confusion.
Un autre défi est de distinguer les fonctions pro-mort et non la mort de caspases. fonctions Pro-mort et non la mort pourrait être liée évolutionnaire aux fins de la transition des cellules entre un état physiologique normal à une mort chronométré de manière appropriée, par exemple l'expansion des cellules immunitaires pour combattre l'infection et l'élimination subséquente de ces cellules pour prévenir le cancer. Ainsi, nous ne pouvons pas éliminer la possibilité que certains de l'activité de la caspase basale observée dans les organes internes est plutôt une tentative de promouvoir la mort cellulaire, apparemment compatible avec les dizaines estimés de milliards de morts cellulaires survenant quotidiennement dans le corps humain. 52 Cependant, la morphologie saine des cellules exprimant le biocapteur indique fortement que CaspaseTracker est capable de détecter l'activité de caspase-jour destinée à un emploi normal des caspases.
Les caspases sont suggéré d'avoir des rôles non-mort tels que la celluleprolifération. Ceci est cohérent avec les tentatives antérieures pour générer des lignées de cellules de mammifère exprimant de manière stable les protéines virales qui se lient et inhibent directement les caspases cellulaires (par exemple, CRMA). Alors que des centaines de colonies de cellules ont été soulevées lors de la sélection des médicaments avec le contrôle vecteur vide, de façon inattendue zéro colonies formées dans des cultures parallèles transfectées avec les inhibiteurs de caspases de vecteur exprimant (non publiées). Ainsi, les caspases ont probablement des fonctions généralisées dans les cellules normales qui sont actuellement sous-estimés. Cela est en outre soutenu par la constatation que l'activité de biocapteur basale dans la mouche de CaspaseTracker est détecté dans de nombreux types de cellules dans la plupart des systèmes d'organes, y compris les neurones, chez les mouches normales et saines. activité caspase saine dans les neurones peut démanteler les terminaisons synaptiques pour promouvoir la fonction normale du cerveau en clivant les mêmes substrats que pendant l'apoptose, ou leurs fonctions au jour le travail peut être tout à fait distincts des activités de l'apoptose-like. Bien que faible par rapport aux niveaux élevés de enzymatiques actifscaspases peuvent être une distinction essentielle entre jour-emploi et la mort cellulaire, il y a quelques Knockin animaux mutants avec des substrats de caspase-clivable spécifiques qui prennent en charge cette possibilité. 17,53 Cependant, les progrès récents indique que la caspase-8 inhibe nécroptose éventuellement en clivant RIPK, 54 la dépression synaptique et récepteurs AMPA endocytose peuvent être réglementés par la caspase clivage de GAP43, 55 et le traitement des microARN peut être régulée par la caspase clivage de Dicer. 14,15,56
Il existe de nombreuses applications supplémentaires de ce biocapteur. Pour déterminer si les caspases sont activés à des moments précis ou dans des tissus spécifiques, l' expression du biocapteur peut être facilement régulée temporellement (par exemple, en utilisant Gal80ts) et dans des types cellulaires spécifiques (par exemple, les pilotes Gal4 olfactive spécifiques). Utilisation de Gal80ts pour supprimer l'expression de biocapteur jusqu'à apparition de mouches adultes encore donné lieu à une activité de biocapteur généralisée, indiquant que CASPASes peuvent être activés à des stades adultes (figure 6c et d). 35 En remplaçant le fragment DIAP1 avec d' autres substrats de caspases, d' autres applications peuvent inclure des biocapteurs spécifiques pour différentes caspases et pour détecter le clivage de substrats spécifiques. Le biocapteur CaspaseTracker permettra d'améliorer notre compréhension du rôle des activités de caspase non-apoptotiques.
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Acknowledgments
Nous remercions Polan Santos et Darren Obbard pour les illustrations de drosophile en Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena pour l'utilisation de l'insectarium JHMRI. Ce travail a été soutenu par la bourse de la Fondation Life Science Research (HLT), Comité des bourses universitaires de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) et NIH accorde NS096677, NS037402 et NS083373 (JMH). Ho Lam Tang est une fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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