Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

Introduction

Caspases הם פרוטאזות ציסטאין אשר מתווכים מוות של תאים אפופטוטיים ידי ביקוע חלבונים תאיים רבים אחרי שאריות aspartate מפתח. לדוגמה, caspases יוזם להפעיל caspases מפעיל, nucleases DNA derepress, רכיבים cytoskeletal תדבק ולשנות את הרכב השומנים של קרום התא לפרק תאי במהירות לעורר הכרה היבלעות על ידי תאים שכנים אשר לסלק את הגוויות התא. 1-4 ההערכה היא כי מיליארדי תאים מתים ליום בגוף האדם, אפופטוזיס הוא מנגנון חשוב של מוות של תאים סרטניים הנגרמת כימותרפיה. 5 סט של caspases שונה יכול לגרום מוות של תאים על ידי תהליכים שאינם אפופטוטיים ברורים כדי לעורר חסינות מולדת. 6 לפיכך, עיקר מחקר על caspases התמקד פונקציות פרו-מותם.

מעניין לציין, כי עדויות ראשוניות בתחום גילו כי באותה caspases האחראי למותו תא קידום יש גם f שאינו מוותמשיחה. המחקרים החלוציים הוכיחו כי caspases מעורבים תפקודים תאיים מגוונים בתאים בריאים, ובכלל זה הסדרת תא התפשטות והגירה במהלך embryogenesis. 7-9 caspases נדרשים עבור אינדיבידואליזציה spermatid תסיסנית 10,11, עבור חסימת מסלול מוות של תאים necroptotic חלופי בעכברים 12,13, ו לעיבוד microRNA ב C. elegans. 14,15 בשנת אולי התאים-מי שמאריך ימים ביותר, נוירונים, caspases ומכונות אפופטוטיים אחרים מעורבים בוויסות הפעילות העצבית על ידי גיזום סופים הסינפטי, תהליך האמין להיות חיוני כדי לחזק סינפסות אחרות על למידה וזיכרון. 16 18 יתכן כי caspases להקל גיזום סינפטי על ידי סוג של מיני-אפופטוזיס של תחזיות עצביות זעירות ללא מות תא כולו. 19 עם זאת, caspases יכול להיות פונקציות חלופיות שאינן קשורות לאירועים כמו אפופטוזיס. 20,21 תפקיד כפולs בחיים ומוות אינם ייחודיים caspases; BCL-2 חלבונים המשפחה ציטוכרום C יש תפקידים אנרגטיקה הסלולר בתאים בריאים אבל הם גם חלק של מסלול אפופטוטיים הליבה כי הוא מופעל על ידי סוגים רבים של מתח התא. 22-25 אמנם לא הוכח, זה נראה הגיוני שהאבולוציה מקושר יום -משרות אל משרות מוות בתוך אותו למולקולות כדי להבטיח חיסול בזמן של תאים מתאימים או לא רצויים.

נכון לעכשיו, את המנגנונים המולקולריים של פעילות caspase הלא אפופטוטיים אינם מובנים, ואת היקף פעילות caspase הלא אפופטוטיים במהלך התפתחות עוברית ברקמות למבוגרות גם אינו ידוע. אחד האתגרים הגדולים הוא הקושי להבחין-עבודות היום ממוות-עבודות של caspases. בניגוד אפופטוזיס pyroptosis, כאשר פעילות caspase מוגברת על ידי מפל פרוטאוליטים, היום-העבודות של caspases צפויות להתרחש בשעה נמוכה בהרבה רמות של פעילות אנזימטית, סביר מתחת זיהוי על ידי techn רב הזמיןologies.

לפני העבודה המוצגת כאן, ואחרים פיתחו מגוון של חיישנים ביולוגיים caspase למטרות שונות. את biosensors SCAT (למשל, ECFP-DEVD-ונוס) במהירות לזהות פעילות caspase בזמן אמת בתאים בתרבית ורקמות החיה באמצעות סריג. 26,27 עם מחשוף caspase, מחצית GFP במיקוד הגרעין של Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) עובר relocalization subcellular בתוך דקות כאשר-לקשור קרום הפלזמה שלה הוא ביקע ידי caspases. 28 בדומה לכך, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes מן cytosol לגרעין על מחשוף caspase. 29,30 נוסף לאחרונה, chromophore ב iCasper תוכנן בחוכמה כדי לזרוח כאשר בקע ידי caspases, המתיר גילוי של פעילות biosensor בזמן אמת בנוירונים של עבר תסיסנית, אבל בעיקר בשיתוף עם מוות של תאים התפתחותי. 31 מות caspase-תלוי של נוירונים חוש הריח במהלך הזדקנות הייתה demonstעל פי דירוג של איתור חיסוני של הטופס בקע-caspase של חיישנים ביולוגיים CPV (למשל, mCD8-PARP-ונוס). 32,33 חשוב לציין, בצורה המופעלת של caspase-3 זוהתה בהעדר המוות של תאים על ידי immunostain הרגיש קוצים של נוירונים בתרבית, ובשנת סומה באמצעות הקרינה תלויה caspase של צבע כתב CellEvent הגרעיני, אך קשיים נתקלו בשל צילום רעיל, למרות מות תאים התעכב עד לאחר חיסול עמוד שדרה. 19 לפיכך, חיישנים הביולוגיים caspase חדשים יש צורך לזהות ולעקוב אחר תאים עם פעילות caspase הבזליים in vivo.

כדי להתגבר על קשיים אלה, שעוררנו biosensor caspase צבע כפול רומן, מיועד CaspaseTracker. אסטרטגיה זו משלבת גרסה שונה של biosensor Apoliner caspase-רגיש תסיסנית 28 עם מערכת תסיסנית G-TRACE FRT recombinase 34 לתייג לצמיתות ולעקוב אחר תאים in vivo. <sup> 35 המערכת G-TRACE Gal4 המופעל מאפשר רמות נמוכות מאוד של caspases להפעיל CaspaseTracker, וכתוצאה מכך ביטוי RFP בציטופלסמה וביטוי GFP גרעינית במיקוד קבוע בכל תא שאי פעם חוותה פעילות caspase. 35 מערכת זו יכולה לתייג תאים לאורך כל החיים בחיות כולו באמצעות תסיסנית, מערכת מודל ממושמע בשימוש נרחב לחקר caspases תהליכי המוות התאי. 36-38

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת זבובים CaspaseTracker

  1. כדי להכין CaspaseTracker (DQVD) זבובים לניסויים, לבצע הצלב הזה: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (כטב"מ-RFP; כטב"מ-FLP; Ubi>> עצירה GFP-NLS), על ידי העברת נקבה בתולה 7-10 (או זכר) זבובים נושאת את המצע biosensor caspase mCD8-DIAP1-Gal4 מונע על ידי האמרגן היוביקוויטין 35 יחד עם מספר זהה של גברים (או נשים) זבובים G-TRACE, אשר יש איזון כרומוזום ארגון הנוער הקתולי השנייה, כדי למנוע הקטלניות של שילוב הומוזיגוטים של G- TRACE (כטב"מ-RFP, כטב"מ-FLP, ו Ubi>> עצירה GFP-NLS) 34. מקום טס בקבוקון מזון טרי עם רסק שמרים טריים כמקור חלבון.
  2. דגירת קבצים על 18 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 7 ימים (מקסימום 2 שבועות) ולאחר מכן הסר את ההורה עף מהבקבוקון להימנע צפיפות עם צאצאים חדשים, וכדי להגדיר בקבוקוני רבייה חדשים.
  3. המשך דגירה על 18 מעלות צלזיוס עד צאצאי זבובי eclose. בחר את ארגון הנוער הקתולי הלא [-ג ללאצאצאי urlY כנף] של גנוטיפ הנכונה של CaspaseTracker, שהן מהונדסות עבור אלמנטי CaspaseTracker ו- G-TRACE 35.
  4. במקביל, ליצור שליטה הלא מהונדס הורית זבובי w118 ו caspase-רגישות (DQVA) זבובים במקביל לאמת RFP CaspaseTracker הספציפי GFP קרינה.
  5. בצע genotyping PCR כדי לאשר קבצים עם CaspaseTracker באמצעות פריימרים: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, ייצור מוצר 3897 נ"ב. עבור genotyping לוקוסים G-Trace, השתמש פריימרים הבאים GFP (474 ​​נ"ב), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT גת C; עבור RFP (258 נ"ב), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; ועבור Flpase (655 נ"ב), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA .ג גנוטיפ Gal4 ב וקטור pUWR (554 נ"ב), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. רקמות הכנות, מכתים שם

  1. עבור וניתוחי זבוב, למנוע רקמות גזורות יידבק טיפי פיפטה פלסטיק צינורות צנטריפוגה, טיפים מעיילים וצינורות עם אלבומין בסרום שור 1% (BSA) מומסים במים.
  2. לנתח זבובים על כרית סיליקון באמצעות מלקחיים.
    1. כדי למנוע נזק קצות מלקחיים על משטח קשה בעת ביצוע לנתיחה רקמות, לבצע דיסקציה על משטח סיליקון. להכנת לוחות לנתיחת סיליקון, להמס את סיליקון בערכה המסחרית בהתאם להוראות יצרן (רשימת חומרים). לאחר המסת סיליקון, להוסיף 3 עד 4 מ"ל לצלחת בתרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הסיליקון.
    2. להרדים זבוב עם CO 2, ולהעביר אותו לצלחת סיליקון עם 1 מ"ל של קר PBS. הצג את CO 2 בקבוקון המכיל את הזבוב באמצעות צינורית ירי, ולאחר מכן להעביר את t הזבוב הרדיםOA Pad כי יש אספקה 2 CO.
    3. השתמש זוג מלקחיים להחזיק את הראש לטוס, וזוג נוסף של מלקחיים למשוך את החזה בכיוון ההפוך כדי לנתק את הראש לטוס מהגוף המכסה מבלי לפגוע בקשר בין הראש במעי הקדמי.
    4. שימוש 2 זוגות מלקחיים כדי להסיר את הכנפיים והרגליים מהחזה.
    5. השתמש זוג מלקחיים להחזיק את החזה, ועוד זוג מלקחיים למשוך את הבטן על מנת להפריד בינו לבין בית החזה שוב מבלי לפגוע בקשר בין במעי הקדמי ו midgut.
    6. לנתח האיברים הפנימיים כולל המוח, הבטן, tubules malpighian והשחלות כפי שהוכח בעבר. 39-41
    7. הסר את כל החלקים של לציפורן וגופי השומן עם מלקחיים כמו רקמות אלה לייצר autofluorescence החזק. סבלנות ותרגול נדרשים להכין מערכת איבר שלם כפי שמוצג.
  3. העבר רקמות גזורות 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, ולתקן wi רקמותה 0.5 מ"ל של paraformaldehyde 4% PBS (שנאגרו מלוחים פוספט) ב RT במשך 20 עד 30 דקות עם סיבוב בחושך כדי למנוע RFP הלבנת GFP ברקמות. הימנע קיבוע ממושך שיכול להתפשר תוצאות מכתימות שלאחר מכן.
  4. הסר את paraformaldehyde ידי pipetting עדין ולשטוף 3 פעמים עם 0.5 מ"ל PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) ב RT.
  5. Permeabilize הרקמות עם 0.5 מ"ל PBST על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רעד עדין. incubations שורטר עלול לגרום לתוצאות permeabilization ופשרת מכתים שלמות.
    1. אם יש צורך להפחית מכתים רקע, שקול דוגרים הרקמות 0.5 מ"ל PBST עם 1% BSA, במקום PBS.
  6. שטפו את רקמות 3 פעמים עם 0.5 מ"ל PBST.
  7. כדי להכתים גרעינים אקטין פילמנטיות (F- אקטין), להחיל 0.5 מ"ל PBST עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Hoechst 33342 צבע כחול גרעיני 0.3 מיקרומטר אלקסה פלואוריד 633 Phalloidin F- אקטין כתם דגירה זמנית עם רקמות של 1 ש 'ב RT wהסיבוב העדין ה- i בחושך. הימנע מכתים ממושך כמו זה יגדיל את הרקע.
    1. עבור immunostaining, דגירה קבועים permeabilized רקמות עם 0.1% Triton X-100 ב 0.5 מ"ל PBS לילה ב 4 ° C, הכתם עם 1: 100 דילול של נוגדן anti-ELAV או עם 1: 200 דילול של caspase אנטי 3 לילה בשעה 4 ° C (300 μL). עקוב על ידי נוגדנים משני המתאים מדולל 1: 100 ו דגירה במשך 1 עד 3 שעות ב RT. ראה חומרי רשימה למידע נוגדן ספציפי.
  8. שטפו את רקמות 3 פעמים, כל 5 דקות ב 0.5 מ"ל PBST עם סיבוב עדין.
  9. עם pipet, להסיר את כל PBST, ולאחר מכן להוסיף 200 μL אנטי-אקונומיקה סוכן הרכבה (ראה חומרים) כדי לכסות רקמות לחלוטין עבור 1-3 שעות ב RT, או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. רקמות אופטימליות אשר קלטו סוכן ההרכבה מלא תשקענה לתחתית הצינור.
  10. טרום לנקות את שקופית הזכוכית עם אתנול מים או 70% ולהעביר את הרקמות עם הרכבת סוכן אל גלאסשקופיות של.
  11. בזהירות במקום להחליק כיסוי זכוכית מעל לרקמות. החל וזלין לשקופית הזכוכית ואת הכיסוי להחליק להימנע להרוס את הרקמה על ידי overcompression. הסר סוכן הרכבה נוסף בנייר טישו.
  12. חותם את התלוש לכסות באמצעות החלת לק לאורך כל הקצוות של להחליק את המכסה כדי למנוע דליפה של הרכבת סוכנים מן הרקמות.

3. מיקרוסקופי Confocal

  1. שימוש במיקרוסקופ עלית קרינת confocal הפוך. עם זאת, עד-תקין מיקרוסקופים יכול לשמש גם. לרקמות התמונה באמצעות ריצוף, לשמור על טמפרטורת חדר יציבה כדי למנוע סחיפה של מיקוד משמרת של המטוס xy בשל התרחבות והתכווצות תרמית של רכיבים. מערכות בקרת הסביבה ומערכות פיצוי להיסחף מוקד לעזור להימנע מבעיה זו בשל אובדן שיווי משקל תרמי של מערכת מיקרוסקופ.
  2. מניחים את השקף על הבמה של המיקרוסקופ. קח כמה תמונות בדיקה באמצעות ברזולוציה נמוכה (125 x 125 פיקסלים)d לקבוע את המספר המתאים של אריחי הדרוש כדי לכסות את האזור כולו של (ROI) ריבית.
  3. הגדר את מערכת הסריקה במיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות עם רזולוציית סריקה כגון 500 x 500 פיקסלים. בחר את המטרה כגון 20X NA 0.8 או מטרה 63X NA 1.4 Plan-Apochromat לניתוח רקמות באמצעות coverslips זכוכית, כך שכל התמונות (אריחים) חופף ב -20% על כל הצדדים.
  4. הגדר את התמונה ברצף מ ארוך ביותר עד קצרות אורכי גל עירור, כמו האור באורכי הגל ארוך יותר גורם צילום הלבנה נמוכה. רצף מ הארוך ביותר עד הקצר גל עירור הוא: (i) 633 ננומטר עבור Phalloidin F אקטין עבור נוגדנים caspases מופעל, (ii) 561 ננומטר עבור RFP, (iii) 488 ננומטר עבור GFP, וכן (iv) 405 ננומטר עבור גרעיני כתם Hoechst.
  5. במהלך הדמיה, לצמצם את החשיפה של תאים כדי עירור הלייזר פלורסנט במהלך ההדמיה תהליך להימנע צילום הלבנה על ידי הקטנת עוצמת הלייזר כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של הרקמות.
  6. אחרי שאניהמגים נאספים, למזג את התמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ישנם שני מרכיבים מרכזיים המאפשרים CaspaseTracker כדי לזהות פעילות caspase בתאים הבריאים (איור 1 א). הראשון שבהם הוא חומצת אמינו 146 פוליפפטיד caspase-cleavable במתכונת (איור 1b) caspase biosensor Apoliner. 28 פוליפפטיד זה נגזר DIAP1 (דרוזופילה מעכב אפופטוזיס) המכיל אתר caspase יחיד טבעי כי הוא ביקע במהלך אפופטוזיס בדרך כלל DrICE ידי caspase. 42,43 DrICE שווה caspase-3 מצעים הסלולר הידועים ביותר היונקים והדבקים. 4,32 מאפיין של caspases, DIAP1 ו פוליפפטיד הנגזרות שלה הם בקעו אחרי חומצה אספרטית ספציפית, Asp20 ממוקם בתוך הכרת caspase רצף 17-DQVD-20, ו מוטציה של שאריות Asp20 חובה עלא (DQVA) מבטל מחשוף. 42,43 בדומה Apoliner, 28 זה שבר DIAP1 הוא אנצ'ואדום בציטופלסמה על קרום הפלזמה באמצעות העכבר CD8 (שרשרת חומצות אמינו אלפא 1-220), כלי נפוץ תסיסנית. עוגן קרום CD8 מונע כל מטען קשור נושאת רצף טרנסלוקציה גרעיני (nucGFP במקרה של Apoliner) מ translocating לגרעין בהעדר פעילות caspase. 28 המרכיב העיקרי השני של CaspaseTracker הוא מערכת תסיסנית G-TRACE שבו גורם שמרים שעתוק Gal4 גורם הביטוי של flippase (FLP) recombinase (ובמקביל גורם RFP). 34 Flippase בלו עצירה קודון המוביל הבעה קבועה של nucGFP. כדי להפוך G-TRACE מגיבים פעילות caspase, זה היה בשילוב עם מערכת Apoliner ידי קשירה Gal4, אשר נדרש כדי להפעיל G-TRACE, כדי לרכוש את הרסיס DIAP1 מעוגני קרום הפלזמה cleavable-caspase של Apoliner (איור 1 א). 35

עשינו modif נוסףications לרכיב Apoliner של CaspaseTracker לשפר שירות. החשוב ביותר, זה קריטי, כי biosensor caspase עצמו לא לעכב caspases, פוטנציאל שימור התאים ימותו אחרת. למרות transgene Apoliner לא לגרום פנוטיפים ברורים תסיסנית 28, כפי שניתן היה לצפות של מעכב caspase חזק, אפילו לשימור המזדמן של תאים יביס לצורך זיהוי תאים נורמלים עם פעילות caspase. עם זאת, שבר DIAP1 ב Apoliner מכיל מוטיב (135-DICG-138) אשר הוצגה לאחר מכן על מנת לעכב potently DrICE, באותו caspase המסלקת DIAP1 ב Asp20. 43 מנגנון עיכוב caspase התגלה על ידי המבנה הגבישי שבו DIAP1 Asp135 מאוגד לתוך אתר DrICE הפעיל כמו חקיין מצע caspase (אבל הוא לא בקע). 43 ניתוח ביוכימיים מדגים כי החלפת Arg ב Asp135 מבטלת פונקציה מעכבת-DrICE. 43 לכן, תוכננה CaspaseTracker עם מוטציה באותו D135R להימנע עיכוב caspase (איור 1b). 35 בדומה Apoliner, רצף DIAP1 ASN-ASN טבעי על מחשוף דה נובו N הסופית- הבאה Asp20 שונה גלאי-לוואל CaspaseTracker כדי למנוע שפלה של Gal4 ידי שלטון N-סוף על מחשוף caspase (איור 1b). 28 בנוסף, אנו התמזגנו א-תג myc לגילוי C- הסופי של Gal4 עבור מוכן ביטוי CaspaseTracker. 35 מתוך הכרח, RFP עצמו Apoliner וקלטות nucGFP נמחקו כדי לעשות את זה תואם עם G-TRACE, אשר מכיל גם RFP ו nucGFP. 28,35

בגלל Gal4 נושאת אות לוקליזציה גרעיני משלה potently מפעיל שעתוק באמצעות אלמנט בתגובה DNA היעד שלה (כטב"מ) כאשר התמזגו transgenes אחרים תסיסנית, ככל הנראה רק כמה מולקולות של rel Gal4הקלו על ידי caspases ציטופלסמית מספיקים כדי להפעיל ביטוי RFP תוך מספר שעות (h ≤12 משוער). בגלל פעילות biosensor דורש דה נובו שעתוק ותרגום של RFP, זה לא לדווח על פעילות אנזימטית בזמן אמת. למרות RFP CaspaseTracker יהיה מושפל באופן משמעותי סביר תוך יום לאחר פעילות caspase מפסיקה, nucGFP יתבטא האמרגן היוביקוויטין על החיים של התא והצאצאים שלה.

כדי להדגים הראשון CaspaseTracker מגיב הפעלת caspase in vivo, זבובי biosensor המבוגר CaspaseTracker נחשפו לתא גירויי גרימת מוות. השחלה תסיסנית היא מודל מוות של תאים למד היטב כמו תאי ביצה לעבור מות תאי מתוכנת כשבעלי חיים לחוצים, מנגנון משוער של התאמת תנאים סביבתיים צאצאי ייצור. 37,44,45 כדי לגרום מוות של תאים, זבובי biosensor היו קרים בהלם 1 שעות ב -7מעלות צלזיוס (הקפאת חיות), ושחלות נותחו מבעלי חיים למחרת (איור 2 א). בניגוד זבובי biosensor מטופל, תאי הביצה לאחר הלם קר היו קטנים במידה ניכרת והציגו אדום חזק (אחרון) וירוק פעילות biosensor (קבועה), אימות הפעלת biosensor לאחר גירוי מוות של תאים (איור 2b, למזג). פעילות biosensor זוהה הגרעינים של בתאי הנבט (תאים וביציות אחות) ו תאים סומטיים (תאים זקיק) בתאי ביצה, אבל רק הזבובים מטופלים. 35 מורפולוגיות מאפיין של אפופטוזיס גם נצפו בקלות בתאי ביצה biosensor חיובי כולל פיצול גרעיני, עיבוי דנ"א שפל (פסד של כתם הכחול). ניתן לאתר פעילות biosensor באותו תא עם שני עיבוי הגרעיני (Hoechst) ו caspases הפעיל (immunostain), אך המכתים האינטנסיבי ביותר עבור caspases הפעיל התרחש באזורים שבם הוא דנ"א caspas גרעיניתאותות דואר biosensor הופחתו או מושפל (איור 2b). 46,47 מנגנוני המוות של תאים המתרחשים לאחר הלם קר אינם מתאפיינים גם, ומנגנוני מוות אחרים עשויים להיות בבית לשחק. עם זאת, תוצאות דומות התקבלו בעקבות רעב חומצת אמינו, אשר ידוע כגורם אפופטוזיס. 35

כדי לקבוע אם CaspaseTracker יכול לזהות פעילות caspase הלא אפופטוטיים, האיברים הפנימיים של זבובים 1 יום בן בריא נותחו בקפידה על ידי הסרת לציפורן autofluorescent ושומן. רקמות זבוב נציג יחיד שתוקנו, רכוב, מוכתם Hoechst לציון גרעינים ועם כתם Phalloidin עבור אקטין F לזהות תאי השריר. בניגוד לתאי ביצה בריאים, אשר חסרים הפעלת biosensor, תאי F- יקטינו מוכתם השריר בין תאי ביצה היו שניהם-פעילות biosensor אדומה וירוקה (איור 3 א, הבלעה). עם זאת, זה אפשרי כי biosensor גם תוויות תאים אחרים. רקמות ואיברים בריאים אחרות רבות של זבובי 1 יום בן שגדלו בצורה אופטימלית הציגו פעילות biosensor caspase בולטת ככל הנראה המשקף פונקצית caspase הלא אפופטוטיים הבזליים (איור 3 א). תאי biosensor החיובי הופיעו מורפולוגית נורמלי התרחשו בדפוסים מאורגנים ברקמות דבר המצביעות על כך תת-מערכות ספציפיות של תאי להפעיל caspases עבור פסי דוגמא תאי biosensor חיוב גלישה במעי האחורי (איור 3 א, ההבלעה).

הראיה הטובה ביותר כי CaspaseTracker הוא עיתונאי ספציפית של caspases היא חוסר אות בזבובים המבטאים את biosensor השליטה, שזהה CaspaseTracker למעט מוטצית חומצה יחידה ASP כדי עלא אמינו באתר המחשוף caspase החובה, שינוי DQVD כדי DQVA ( 1b ו 3 ב איור). למעט תא נדיר במיוחד (איור 3 ב, חץ ירוק), observ אות רקאד בשנת זבובי biosensor מלא DQVA הם מבני autofluorescent, כגון חלקי פה (איור 3B) ומזון לבלוע יבול ובמקומות אחר (איור 3B ו -4), אשר הם נצפו גם אצל זבובי הורים הלא מהונדס כי עדר biosensor caspase. 35 התאים שכותרתו CaspaseTracker להתרחש במרווחי זמן קבועים לאורך tubules malpighian (כליות) ולעיתים קרובות מפגינים את שתי האחרונות (אדום) ועל פני הפעלת caspase (ירוק) בו זמנית, בעוד תאים רבים במוח, האונות אופטיים, הקיבה, יבול, midgut ו oviduct הם או אדומים או ירוקים (איורים 4 ו 5 א).

לקבלת ראיות שתאי חיים ארוכים יכולים לשרוד פעילות caspase, האונה האופטית הייתה immunostained עבור ELAV הסמן הפאן העצבי (החזון נורמלי קטלני עוברי). 48 הגרעינים של נוירונים רבים תויגו כפול עם GFP הגרעינית במיקוד מ CaspaseTracker ו ELAV, בקנה אחד עם לסה"נ חיים ארוכהLLS caspases משתמש עבור פונקציות שאינם מוות (איור 5 ב). יתר על כן, אם biosensor כבוי למשך 10 ימים (באמצעות Gal80ts), תאים חיוביים-biosensor להתמיד למשך במעיים (איור 6 א ו-ב), המוח ובמקומות אחרים (לא מוצג). שימוש CaspaseTracker biosensor caspase, אנו מספקים סקירה כללית הפעילות הראשונה caspase הבזליים בחיות כולה.

איור 1
איור 1: מערכת biosensor CaspaseTracker לאיתור פעילות caspase הלא אפופטוטיים. (א) רכיבים של biosensor caspase תסיסנית. (ב) החלק cleavable-caspase של מערכת biosensor CaspaseTracker מורכב עוגן קרום התא (mCD8), שבר DIAP1 המכיל אתר caspase-מחשוף טבעי Asp20 התמזגו שעתוק Gal4 גורם עם תג 3x-myc בטרמינל C-והביע דרך פרו היוביקוויטיןmoter. מחשוף caspase התוצאה טרנסלוקציה של Gal4 לגרעין לנצל את השפעתה על מערכת G-TRACE. בעוד biosensor מלא, שאריות Asp20 הנדרשות באתר 4-אמינו חומצת caspase המחשוף (DQVD) משתנות עלא (DQVA) לבטל מחשוף caspase. זבובים המהונדסים CaspaseTracker מכילים 4 transgenes. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: CaspaseTracker מופעל על ידי caspases במהלך מוות של תאים. (א) סכמטי של שחלה תסיסנית ותרשים זרימה עבור מוות תאי מושרה הלם קר. שחלה תסיסנית ציור (על ידי Polan סנטוס) ותמונת תסיסנית (על ידי דארן Obbard) ונמצאים בשימוש באישורו. (ב) תאי ביצית מן השחלה של 6- נקבת יום CaspaseTracker זבובים הפד w אוכל לטוס נורמלי ה- i במשך 6 ימים (ללא טיפול) או 1 יום אחרי הלם קר (-7 ° C, H 1, ואחריו 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות) כדי לגרום הפעלת caspase בתאי ביצה. גדלות של השחלה קרה שטופל (מסגרות ימנית תחתונה) מראות שלושה תאי ביצה באחד בפיתוח ovariole שרשרת (מרוכז כ אנכי) עם ראיות של עיבוי גרעיני (תא ביצה העליון), קיטוע גרעיני (תא ביצה באמצע ריבועים) ושפלה (ביצה נמוכה קאמרי) מבוסס על כתם DNA Hoechst (כחול). caspases Active (אנטי-caspase-3, מגנט) מזוהה בתאי הביצה האמצעיים ותחתונים. RFP ופעילות biosensor GFP (אדום, חיצים ירוקים וצהובים) המתרחשת בתאים עם עיבוי דנ"א גרעיני כי לעתים קרובות להכתים מתפזרים עם caspases הפעיל (ריבועים). חיצים לבנים לסמן גרעינים החסרים הוא פעילות biosensor ו immunostain caspase הפעיל. * אותות autofluorescence. נתונים אלה הם לשכפל באישור טאנג et al., Sci נציג 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: עדויות לפעילות caspase פיזיולוגית נפוצה. (א) מוזגה תמונה confocal של CaspaseTracker (DQVD) RFP ו nucGFP מ זבוב החדש eclosed יחיד העלה על 18 מעלות צלזיוס, גזור ומוכתמת עם H33342 עבור הגרעינים ואת Phalloidin עבור F- אקטין (ורוד), צילמו עם דסק"ש. Phalloidin מוצגת רק ההבלעה עבור תאי ביצה. (ב) תנאי ההליך והדמיה אותו היו במעקב במשך CaspaseTracker המלא (DQVA) זבובים. * מבני autofluorescent. נתונים אלה הם לשכפל באישור טאנג et al., Sci נציג 2015. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלנתון זה.

איור 4
איור 4:. פעילות caspase בסל ברקמות רבות בהגדלות גדולות של דסק"ש ותמונות קרינת confocal של GFP (בעבר) RFP (האחרונה) CaspaseTracker (DQVD) פעילות Hoechst מוכתמים גרעינים במוח, הקיבה, היבול, midgut, tubules Malpighian ו oviducts מ איור 3 א. * מבני autofluorescent. נתונים אלה הם לשכפל באישור טאנג et al., Sci נציג 2015. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: פעילות caspase ללא אפופטוטיים בנוירונים של תסיסנית באונה אופטית. (א) דסק"ש תמונות confocal עם RFP (האחרון) ו- GFP (בעבר) CaspaseTracker (DQVD) פעילות וגרעינים מוכתמים Hoechst במוח. RFP + GFP תאים כפולים שכותרתו (חיצים צהובים). (ב) NucGFP colocalizes עם immunostain לחלבון ELAV הגרעיני עצבי פאן באונה האופטית של CaspaseTracker (DQVD) לטוס מוח. נוירונים עם אותות שותף מקומי של NucGFP ו ELAV מוצגים (חצים לבנים). הערה, נוירונים שכותרתו RFP אינם נוכחים בתחום המסוים הזה. נתונים אלה הם לשכפל באישור טאנג et al., Sci נציג 2015. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מדגימים את פעולתו הבנייה הפנימית של CaspaseTracker המאפשר זיהוי של פעילות caspase בסיס נרחבת ברקמות בריאות. השלבים הקריטיים לאיתור פעילות caspase הלא אפופטוטיים in vivo הם: 1) יצירת זבובים עם transgene biosensor, 2) אימות פונקצית כתב ספציפי caspase עם בקרה נאותה, 3) תרגול טכניקות לנתיחה כדי לשמור על כל מערכות האיברים הפנימיות של תסיסנית המבוגרת, ו -4) פעילות biosensor מבדיל בין חפצי autofluorescent.

פוליפפטיד הטבעי cleavable-caspase המשמש חיישן caspase הספציפי שונה כדי להימנע מכל פעילות מעכבת-caspase ידי biosensor. שינויים נוספים נעשו כדי למנוע השפלה המהירה של גורם שעתוק Gal4, ואת הכניסה של תג epitope. כמו כן, אנו מתארים לנתיחת איבר גוף של זבובים, immunostaining לתלייה מיקרוסקופית confocal של רקמות זבובים כדי לזהות פעילות caspase הלא אפופטוטיים.

בעוד CaspaseTracker אידיאלי לאיתור תאים לשרוד עם רמות נמוכות של פעילות caspase, זה לא עיתונאי של פעילות האנזים בזמן אמת, כמו כמה שעות נדרשים להפעיל את biosensor. עם זאת, אנחנו לא קבעו את הזמן המינימלי כדי גילוי, אשר צפוי קצר בהרבה מהדרוש עבור יישומים המתואר כאן. בניגוד CaspaseTracker, המגבלה העיקרית של חיישנים ביולוגיים caspase אחרים היא חוסר היכולת שלהם לזהות רמות נמוכות של פעילות caspase, כפי שהם נועדו בעיקר כדי ללמוד מוות של תאים. פעילות caspase מוגברת בעקבות גירוי מוות של תאים, גרימת הריסת תא מסיבית תוך פחות מ -30 דקות. 49 לכן, זיהוי של הפעלת caspase יש המניחים להיות סמן של מוות של תאים מסוימים. 50,51 עם זאת, גובר ראיות עולה כי caspases יש הלא אפופטוטיים, פונקציות שאינן degradative אפילו בתאים בריאים. 7-21 presuרמות נמוכות med של הפעילות האנזימטית מוגבל מרחבית וזמנית של caspases המבצעות-יום עבודתם צפויים בהמשך זיהוי על ידי הטכנולוגיות הזמינות. בעיה זו היא להתגבר על ידי CaspaseTracker, המחייב אירועים מחשוף caspase כמה צפוי ליצור אותות חזקים, ואינו דורש הפעילות האנזימטית caspase מתמשך לתייג לצמיתות תאים אלה in vivo.

על פי הראיות עולות כי CaspaseTracker הוא ספציפי עבור caspases, למרות שאנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי פרוטאזות Asp ספציפיות מזוהות אחרות יכולות להפעיל CaspaseTracker. עם זאת, האכלה טסה עם קוקטייל של בלוקים פפטידים-מעכב caspase פעילות CaspaseTracker (לא פורסם). כמו כן, אנו מדגישים את החשיבות של הימנעות biosensors כי עצמם לעכב caspases, ואת החשיבות של חיישנים ביולוגיים מלאים זבובים הלא מהונדסים כדי למנוע מסקנות שגויות עקב autofluorescence טבועה לציפורן החרקים, שומן פנימי Depoיושב, לבלוע מזון או לערפלנים אחרים.

אתגר נוסף הוא הבחנת פונקציות-מוות שאינו פרו-מוות של caspases. פרו-מוות ופונקציות שאינם מוות יכולות להיות קשורות אבולוציונית לצורך מעבר תאים בין מצב פיסיולוגי נורמלי מות מתוזמן כראוי, למשל הרחבת תאי מערכת חיסון כדי להילחם בזיהום והחיסול הבא של תאים אלה כדי למנוע סרטן. לכן, אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי חלק מפעילות caspase הבזליים שנצפו איברים פנימיים הוא במקום בניסיון לקדם מוות של תאים, לכאורה בקנה אחד עם עשרות המוערכים של מקרי מות תא מיליארדים המתרחשים יומיים בגוף האדם. 52 עם זאת, מורפולוגיה הבריאה של תאים המבטאים את biosensor מצביע כי CaspaseTracker הוא מסוגל לאתר פעילות caspase מיועדת יום-עבודות נורמליות של caspases.

Caspases מוצעת יהיו תפקידים שאינם מוות כגון תאשִׂגשׂוּג. זה עולה בקנה אחד עם ניסיונות קודמים לייצר שורות תאים יונקים להביע חלבונים נגיפיים ביציבות אשר נקלטות וישירות לעכב caspases הסלולר (למשל, CrmA). בעוד מאות מושבות תאים התעוררו במהלך בחירת תרופה עם הווקטור המלא הריק, באופן בלתי צפוי אפס מושבות נוצרו תרבויות מקבילות טרנספקציה עם מעכבי caspase להביע וקטור (לא פורסם). לפיכך, caspases יש פונקציות נפוצות סביר בתאים בריאים, כי הם מעריכים אותו מספיק כרגע. זה נתמך גם על ידי הממצא כי פעילות biosensor בסיס ב לטוס CaspaseTracker מזוהית בסוגי תאים רבים על פני רוב מערכות איברים, כוללים נוירונים, בזבובים בריאים נורמלים. פעילות caspase בריאה בנוירונים יכולה לפרק סופים הסינפטי לקדם לתפקוד תקין של מוח על ידי ביקוע אותה המצעים כמו במהלך אפופטוזיס, או הפעולות היום יום-העבודה שלהם יכולות להיות שונות לחלוטין מפעילות אפופטוזיס דמוי. בעוד נמוך לעומת רמות האנזימטית גבוהות של פעילcaspases עשוי להיות הבחנה קריטית בין עבודות ימי מוות של תאים, יש כמה חי מוטנטים Knockin עם מצעי caspase-uncleavable ספציפיים התומכים באפשרות זו. 17,53 עם זאת, ההתקדמות האחרונה עולה כי caspase-8 מעכב necroptosis ואולי על ידי ביקוע RIPK, 54 דיכאון הסינפטי אנדוציטוזה קולטן AMPA עשוי להיות מוסדר על ידי מחשוף caspase של Gap43, 55 ועיבוד microRNA עשוי להיות מוסדר על ידי מחשוף caspase של דייסר. 14,15,56

ישנם יישומים רבים נוספים של biosensor זה. כדי לקבוע אם caspases מופעלים בזמנים מסוימים או ברקמות ספציפיות, ביטוי של biosensor ניתן לווסת בקלות ובזמן (למשל, באמצעות Gal80ts) וב סוגי תאים מסוימים (למשל, חוש ריח ספציפי נהגי Gal4). שימוש Gal80ts לדכא ביטוי biosensor עד הופעתה של מבוגר עדיין זבובים הביא פעילות biosensor נפוצה, המציין כי caspases ניתן להפעיל בשלבי בוגרים (איור 6 ג ו-ד). 35 על ידי החלפת שבר DIAP1 עם מצעי caspase אחרים, יישומים אחרים עשויים לכלול חיישנים ביולוגיים ספציפיים עבור caspases שונה לאיתור מחשוף של מצעים ספציפיים. Biosensor CaspaseTracker ישפר את הבנתנו את התפקיד של פעילויות caspase הלא אפופטוטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים Polan סנטוס דארן Obbard לאיורים תסיסנית באיור. 2a, מרסלו ג'ייקובס-לורנה לשימוש של insectary JHMRI. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת קרן המחקר מדעי החיים (HLT), ועדת המענקים אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF), ו- NIH מעניקה NS096677, NS037402 ו NS083373 (JMH). הו לם טאנג הוא עמית קרן Shurl וקיי קורצ'י של קרן המחקר למדעי החיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 117 caspase biosensor, אפופטוזיס הלא אפופטוטיים מוח תאי עצב CaspaseTracker
<em>In vivo</em> biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות <em>תסיסנית</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter