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Biology

विवो बायोसेंसर पटरियों ड्रोसोफिला में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

पूरे जानवरों है कि कस्पासे गतिविधि के निम्न स्तर को रोकने में स्वस्थ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, अत्यधिक संवेदनशील नामित CaspaseTracker biosensor ड्रोसोफिला के लिए तैयार की गई थी। कस्पासे निर्भर biosensor गतिविधि मौत उत्तेजनाओं के अभाव में अनुकूलित शर्तों के तहत पाला वयस्क जानवरों के आंतरिक अंगों के दौरान लंबे समय रहते स्वस्थ कोशिकाओं में पाया जाता है।

Introduction

Caspases सिस्टीन proteases कि कुंजी aspartate अवशेषों के बाद कई intracellular प्रोटीन cleaving द्वारा apoptotic कोशिका मृत्यु मध्यस्थता कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, सर्जक caspases प्रेरक caspases, derepress डीएनए न्युक्लिअसिज़, फोड़ना cytoskeletal घटकों को सक्रिय करने और कोशिका झिल्ली के लिपिड संरचना में परिवर्तन तेजी से कोशिकाओं को नष्ट करने और पड़ोसी कोशिकाओं है कि सेल लाशों के निपटान के द्वारा अपनी पहचान और घिराव प्रोत्साहित करने के लिए। 1-4 यह अनुमान है मानव शरीर में प्रति दिन कोशिकाओं के अरबों मर जाते हैं कि, और apoptosis कीमोथेरेपी प्रेरित ट्यूमर कोशिका मृत्यु का एक महत्वपूर्ण तंत्र है। 5 caspases का एक अलग सेट इसलिए सहज प्रतिरक्षा को प्रोत्साहित करने के लिए अलग-अलग गैर apoptotic प्रक्रियाओं द्वारा कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है। 6, caspases पर सबसे अधिक शोध उनके समर्थक मौत कार्यों पर ध्यान केंद्रित किया है।

दिलचस्प है, इस क्षेत्र में प्रारंभिक सबूत से पता चला एक ही caspases को बढ़ावा देने कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार भी गैर-मौत च हैunctions। अग्रणी अध्ययन दिखा दिया है कि caspases स्वस्थ कोशिकाओं में विविध सेलुलर कार्यों, embryogenesis दौरान सेल प्रसार और प्रवास के नियमन सहित में शामिल हैं। 7-9 caspases, ड्रोसोफिला 10,11 में spermatid वैयक्तिकरण के लिए आवश्यक हैं एक वैकल्पिक necroptotic कोशिका मृत्यु मार्ग अवरुद्ध करने के लिए चूहों 12,13 में, और सी में microRNA प्रसंस्करण के लिए एलिगेंस। 14,15 शायद में सबसे लंबे समय तक रहते थे कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, caspases और अन्य apoptotic मशीनरी neuronal गतिविधि के नियमन में synaptic अंत छंटाई से फंसा रहे हैं, एक प्रक्रिया माना जाता है कि सीखने और स्मृति के लिए अन्य synapses को मजबूत करने के लिए आवश्यक हो सकता है। 16- 18 यह है कि caspases पूरे कोशिका मृत्यु के बिना छोटे न्यूरोनल अनुमानों के मिनी apoptosis की एक प्रकार से synaptic छंटाई की सुविधा के लिए संभव है। 19 हालांकि, caspases apoptosis-तरह की घटनाओं के लिए असंबंधित विकल्प कार्यों हो सकता है। 20,21 दोहरी भूमिकाजीवन और मृत्यु में caspases के लिए अद्वितीय नहीं कर रहे हैं; बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन और साइटोक्रोम ग स्वस्थ कोशिकाओं में सेलुलर ऊर्जा विज्ञान में भूमिका है लेकिन यह भी कोर apoptotic मार्ग है कि सेल तनाव के कई प्रकार से सक्रिय है का हिस्सा हैं। 22-25 हालांकि साबित नहीं, यह तार्किक है कि विकास दिन से जोड़ दिया है लगती है एक ही अणुओं के भीतर मृत्यु नौकरियों के लिए अयोग्य -नौकरियां या अवांछनीय कोशिकाओं के समय पर उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए।

वर्तमान में, गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि के आणविक तंत्र समझ नहीं रहे हैं, और भ्रूण के विकास के दौरान और वयस्क ऊतकों में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि की हद तक भी ज्ञात नहीं है। एक बड़ी चुनौती caspases की मृत्यु नौकरी से दिन-नौकरियों भेद करने में कठिनाई है। apoptosis और pyroptosis, जब कस्पासे गतिविधि एक प्रोटिओलिटिक झरना से परिलक्षित होता है के विपरीत, caspases के दिन के रोजगार के अवसर उपलब्ध कई techn द्वारा की संभावना का पता लगाने के नीचे enzymatic गतिविधि के कम से काफी कम स्तर, घटित होने की उम्मीद कर रहे हैंologies।

यहाँ प्रस्तुत काम करने से पहले, दूसरों को विभिन्न प्रयोजनों के लिए कस्पासे biosensors की एक किस्म विकसित की है। गोबर biosensors (जैसे, ECFP-DEVD-शुक्र) तेजी से वास्तविक समय कस्पासे गतिविधि संवर्धित कोशिकाओं और जानवरों के ऊतकों में झल्लाहट का उपयोग कर कस्पासे दरार करने पर पता लगा। 26,27, Apoliner (mCD8-आरएफपी DQVD- की परमाणु-लक्षित GFP आधा भाग nucGFP) मिनट जब अपने प्लाज्मा झिल्ली-तार caspases द्वारा cleaved है के भीतर subcellular पुनर्स्थानीकरण आए। 28 इसी तरह, ApoAlert-pCaspase3 सेंसर (एनईएस-DEVD-YFP-एनएलएस) कस्पासे दरार पर नाभिक को cytosol से relocalizes। 29,30 अधिक हाल ही में, iCasper में क्रोमोफोर चतुराई से उम्र बढ़ने था दौरान जब caspases द्वारा cleaved, ड्रोसोफिला भ्रूण के न्यूरॉन्स में वास्तविक समय में biosensor गतिविधि का पता लगाने की अनुमति, लेकिन मुख्य रूप से विकास कोशिका मृत्यु के सहयोग से प्रतिदीप्ति करने के लिए इंजीनियर था। घ्राण न्यूरॉन्स की 31 कस्पासे निर्भर मौत demonstसीपीवी biosensors (जैसे, mCD8-PARP-शुक्र) की कस्पासे cleaved फार्म की इम्युनो-पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन किया गया। 32,33 महत्वपूर्ण बात है, कस्पासे 3 की सक्रिय रूप से कांटा में संवेदनशील immunostain द्वारा कोशिका मृत्यु के अभाव में पाया गया था सभ्य न्यूरॉन्स, और सोमा परमाणु CellEvent रिपोर्टर डाई की कस्पासे निर्भर प्रतिदीप्ति का उपयोग, लेकिन कठिनाइयों, फोटो विषाक्तता के कारण सामना करना पड़ा था, हालांकि कोशिका मृत्यु रीढ़ उन्मूलन के बाद जब तक देर हो रही थी में। 19 इस प्रकार, नए कस्पासे biosensors का पता लगाने की जरूरत है और इन विवो में बेसल कस्पासे गतिविधि के साथ कोशिकाओं को ट्रैक।

इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, हम एक उपन्यास दोहरी रंग कस्पासे biosensor, नामित CaspaseTracker उत्पन्न। इस रणनीति के ड्रोसोफिला जी ट्रेस FRT recombinase प्रणाली 34 के साथ ड्रोसोफिला कस्पासे संवेदनशील Apoliner biosensor 28 का एक संशोधित संस्करण को जोड़ती है स्थायी रूप से लेबल और इन विवो में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए। <sup> 35 Gal4 सक्रिय जी का पता लगाने प्रणाली caspases का स्तर बहुत कम CaspaseTracker सक्रिय करने के लिए, कोशिका द्रव्य और किसी भी सेल कि कभी कस्पासे गतिविधि का अनुभव है में स्थायी परमाणु-लक्षित GFP अभिव्यक्ति में आरएफपी अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप अनुमति देता है। 35 इस प्रणाली के लेबल कर सकते हैं ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, caspases और कोशिका मृत्यु के अध्ययन के लिए एक विनयशील और व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल प्रणाली का उपयोग कर पूरे पशुओं में जीवन भर कोशिकाओं। 36-38

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Protocol

1. CaspaseTracker मक्खियों की तैयारी

  1. CaspaseTracker (DQVD) तैयार करने के प्रयोगों के लिए मक्खियों, इस पार प्रदर्शन: यूबीआई-CaspaseTracker एक्स जी-ट्रेस (यूएएस आरएफपी; यूएएस FLP; यूबीआई> बंद करो> GFP-एनएलएस), 7-10 कुंवारी महिला स्थानांतरित (या महिला) मक्खियों कस्पासे biosensor सब्सट्रेट mCD8-DIAP1-Gal4 ले जाने ubiquitin प्रमोटर 35 एक साथ द्वारा संचालित पुरुष (या महिला) के एक ही नंबर के साथ जी-ट्रेस मक्खियों, जो दूसरी गुणसूत्र cyo कसरती है जी की homozygous संयोजन की मारक से बचने के लिए ट्रेस (यूएएस आरएफपी, यूएएस FLP, और यूबीआई> बंद करो> GFP-एनएलएस) 34। जगह एक प्रोटीन के स्रोत के रूप में ताजा खमीर पेस्ट के साथ एक ताजा भोजन शीशी में मक्खियों।
  2. 5 से 7 दिन (अधिकतम 2 सप्ताह) के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर फाइलों को सेते हैं और फिर हटाने के माता-पिता नई संतान के साथ भीड़भाड़ से बचने के लिए, और नए प्रजनन शीशियों स्थापित करने के लिए शीशी से मक्खियों।
  3. 18 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें जब तक संतान eclose मक्खियों। गैर-cyo का चयन करें [गैर-सीCaspaseTracker का सही जीनोटाइप, जो CaspaseTracker और जी तत्वों का पता लगाने के लिए 35 ट्रांसजेनिक हैं की urlY विंग] संतान।
  4. इसके साथ ही, विशिष्ट CaspaseTracker आरएफपी और GFP प्रतिदीप्ति सत्यापित करने के लिए नियंत्रण पैतृक गैर ट्रांसजेनिक w118 मक्खियों और कस्पासे असंवेदनशील (DQVA) उत्पन्न समानांतर में मक्खियों।
  5. प्राइमरों का उपयोग CaspaseTracker के साथ फाइल पुष्टि करने के लिए पीसीआर जीनोटाइपिंग प्रदर्शन: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, एक 3897 बीपी उत्पाद का निर्माण किया। जी ट्रेस लोकी जीनोटाइपिंग के लिए, GFP (474 ​​बीपी) के लिए निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करें, 5'-सीएसी जीएसी टीटीसी टीटीसी आग टीसीसी जीसीसी ATG सीसीसी जी, 3'-सीटीटी जीटीए कैग सीटीसी जीटीसी कैट जीसीसी भूमिकाः AGT GAT सी; आरएफपी (258 बीपी) के लिए, 5'-जीजीसी टी जी सी टीटीसी एटीसी टीएसी आग GTG आग टीटीसी एटीसी जी जी, 3'-GAT जीटीसी कैग सीटीटी GGA जीटीसी सीएसी जीटीए जीटीए जीटीए जीसी; और Flpase (655 बीपी), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, के लिए 3'-जीसीसी टीएसी TAA CGC टीटीजी TCT टीटीजी TCT CTG टीसीए सी pUWR वेक्टर में जीनोटाइपिंग Gal4 (554 बीपी), 5'-GAA जीसीए सीएसी सीटीटी CGC एटीसी GCT के लिए कैगटीसीए CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT आगा।

2. ऊतक तैयारी, धुंधला और बढ़ते

  1. मक्खी विच्छेदन के लिए, प्लास्टिक पिपेट सुझावों और अपकेंद्रित्र ट्यूब, कोट सुझाव और ट्यूबों के 1% गोजातीय सीरम albumin के साथ (बीएसए) पानी में भंग करने के लिए चिपके से विच्छेदित ऊतकों को रोकने के।
  2. काटना संदंश का उपयोग एक सिलिकॉन गद्दी पर मक्खियों।
    1. जब ऊतक विच्छेदन प्रदर्शन एक कठिन सतह पर संदंश के सुझावों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए एक सिलिकॉन की सतह पर विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं। सिलिकॉन विच्छेदन प्लेटें बनाने के लिए, निर्माता के निर्देशों (सामग्री सूची) के अनुसार वाणिज्यिक किट में सिलिकॉन पिघला। सिलिकॉन पिघलने के बाद, एक 60 मिमी व्यास टिशू कल्चर डिश के लिए 3 से 4 एमएल जोड़ने। सिलिकॉन व्यंजन पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    2. सीओ 2 के साथ एक मक्खी anesthetize, और ठंड पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक सिलिकॉन प्लेट को हस्तांतरण। एक शीशी एक blowgun का उपयोग कर मक्खी युक्त करने के लिए सीओ 2 का परिचय है, और फिर anesthetized मक्खी टी स्थानांतरणOA पैड सीओ 2 की आपूर्ति की है।
    3. विपरीत दिशा में छाती खींचने के लिए सिर और अग्रांत्र के बीच के संबंध को नुकसान पहुँचाए बिना कवर करने से शरीर से उड़ सिर काट करने के लिए संदंश मक्खी सिर पकड़ करने के लिए की एक जोड़ी, और संदंश की एक दूसरी जोड़ी का प्रयोग करें।
    4. संदंश के 2 जोड़ी का प्रयोग छाती से पंख और पैरों को दूर करने के लिए।
    5. छाती धारण करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, और संदंश की एक और जोड़ी पेट खींचने के लिए अग्रांत्र और आद्यमध्यांत्र के बीच के संबंध को नुकसान पहुँचाए बिना फिर छाती से अलग करने के लिए।
    6. मस्तिष्क, पेट, malpighian नलिकाओं और अंडाशय सहित आंतरिक अंगों को काटना के रूप में पहले प्रदर्शन किया। 39-41
    7. संदंश के साथ छल्ली के सभी टुकड़ों और वसा शरीर हटाये के रूप में इन ऊतकों मजबूत autofluorescence उत्पादन। धैर्य और अभ्यास के रूप में दिखाया एक पूरा अंग प्रणाली तैयार करने के लिए आवश्यक हैं।
  3. 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों को विच्छेदित ऊतकों स्थानांतरण, और ऊतकों को ठीक वाईवें 0.5 20 से 30 अंधेरे में रोटेशन के साथ मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में 4% paraformaldehyde एमएल (फॉस्फेट बफर खारा) विरंजन आरएफपी और ऊतकों में GFP से बचने के लिए। लंबे समय तक नियतन है कि बाद धुंधला परिणाम समझौता कर सकते हैं से बचें।
  4. कोमल pipetting द्वारा paraformaldehyde निकालें और आरटी पर 0.5 एमएल PBST (पीबीएस + 0.1% ट्राइटन X-100) के साथ 3 बार धोएं।
  5. कोमल झटकों के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 एमएल PBST के साथ ऊतकों Permeabilize। छोटे incubations अधूरा permeabilization और समझौता धुंधला परिणामों का कारण बन सकता है।
    1. यदि यह आवश्यक है पृष्ठभूमि धुंधला कम करने के लिए, ऊतकों पीबीएस के बजाय, 1% BSA के साथ 0.5 एमएल PBST में incubating पर विचार करें।
  6. ऊतकों 0.5 एमएल PBST के साथ 3 बार धोएं।
  7. नाभिक और filamentous actin (एफ actin) दाग, 10 माइक्रोग्राम / एमएल Hoechst की 33342 नीले परमाणु डाई और 0.3 माइक्रोन के एलेक्सा स्त्राव 633 Phalloidin एफ actin दाग के साथ 0.5 एमएल PBST लागू करते हैं और आरटी पर 1 घंटे w के लिए ऊतकों के साथ एक साथ सेतेअंधेरे में ith कोमल रोटेशन। लंबे समय तक धुंधला से बचने के रूप में इस पृष्ठभूमि में वृद्धि होगी।
    1. immunostaining के लिए, के साथ तय की और permeabilized सेते ऊतकों 0.1% ट्राइटन X-100 0.5 एमएल पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस, 1 के साथ दाग में रात भर: विरोधी ELAV एंटीबॉडी की या 1 से 100 कमजोर पड़ने: विरोधी कस्पासे -3 के 200 कमजोर पड़ने रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस (300 μL)। 1 पतला इसी माध्यमिक एंटीबॉडी से पालन करें: 100 और आरटी पर 1 से 3 घंटे के लिए सेते हैं। विशिष्ट एंटीबॉडी जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें।
  8. ऊतकों कोमल रोटेशन के साथ 0.5 एमएल PBST में 5 मिनट के लिए 3 बार, हर धो लें।
  9. एक pipet के साथ, सभी PBST निकालें, और फिर 200 μL विरोधी ब्लीच बढ़ते एजेंट (सामग्री देखें) जोड़ने के लिए पूरी तरह से रात भर आरटी पर 1-3 ज, या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ऊतकों को कवर करने के लिए। इष्टतम ऊतकों है कि पूरी तरह से बढ़ते एजेंट अवशोषित है ट्यूब के नीचे डूब जाएगी।
  10. प्री-साफ पानी या 70% इथेनॉल के साथ कांच स्लाइड और glas के लिए एजेंट के बढ़ते के साथ ऊतकों का स्थानांतरणस्लाइड।
  11. ध्यान से ऊतकों पर एक गिलास को कवर पर्ची जगह है। गिलास स्लाइड और कवर पर्ची overcompression द्वारा ऊतकों को नष्ट करने के लिए से बचने के लिए पेट्रोलियम जेली लागू करें। टिशू पेपर के साथ अतिरिक्त बढ़ते एजेंट निकालें।
  12. सभी कवर पर्ची के किनारों के साथ नेल पॉलिश लगाने के ऊतकों से एजेंटों के बढ़ते के रिसाव से बचने के लिए कवर पर्ची सील।

3. Confocal माइक्रोस्कोपी

  1. एक औंधा confocal महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। हालांकि, ऊपर सही माइक्रोस्कोप भी इस्तेमाल किया जा सकता है। खपरैल का छत का उपयोग कर छवि ऊतकों को, थर्मल विस्तार और घटकों के संकुचन के कारण स्थिर कमरे फोकस और xy विमान की पारी के बहाव से बचने के लिए तापमान को बनाए रखने। पर्यावरण नियंत्रण प्रणाली और ध्यान बहाव मुआवजा प्रणाली माइक्रोस्कोप प्रणाली के थर्मो-संतुलन की कमी के कारण इस समस्या से बचने के लिए मदद करते हैं।
  2. माइक्रोस्कोप के मंच पर स्लाइड रखें। कम संकल्प का उपयोग कर कुछ परीक्षण छवियों लो (125 x 125 पिक्सल) एकघ ब्याज (आरओआई) के पूरे क्षेत्र को कवर करने की जरूरत टाइल्स की उपयुक्त संख्या का निर्धारण।
  3. 500 x 500 पिक्सल के रूप में इस तरह के स्कैनिंग संकल्प के साथ छवियों पर कब्जा करने के लिए माइक्रोस्कोप स्कैनिंग सिस्टम सेट करें। इस तरह के एक 20X NA 0.8 या कांच coverslips के माध्यम से ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए एक 63X NA 1.4 योजना Apochromat उद्देश्य के रूप में उद्देश्य का चयन करें ताकि छवियों (टाइल) में से प्रत्येक के सभी पक्षों पर 20% से overlaps।
  4. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य कम से कम करने के लिए, लंबे तरंगदैर्ध्य के प्रकाश के रूप में कम तस्वीर विरंजन का कारण बनता है सबसे लंबे समय तक से छवि अनुक्रम सेट करें। अनुक्रम सबसे लंबे समय तक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य से कम से कम करने के लिए है: (i) Phalloidin एफ actin के लिए और सक्रिय caspases करने के लिए एंटीबॉडी के लिए 633 एनएम, (ii) आरएफपी के लिए 561 एनएम, (iii) GFP के लिए 488 एनएम, और (iv) 405 एनएम के लिए Hoechst परमाणु दाग।
  5. इमेजिंग के दौरान, इमेजिंग प्रक्रिया के ऊतकों की उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए लेजर तीव्रता को कम करने से तस्वीर विरंजन से बचने के लिए के दौरान फ्लोरोसेंट लेजर उत्तेजना के लिए कोशिकाओं के जोखिम को कम।
  6. मेरे बादmages एकत्र कर रहे हैं, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों विलय।

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Representative Results

वहाँ दो प्रमुख घटक है कि CaspaseTracker सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। इनमें से पहले एक 146 अमीनो एसिड कस्पासे cleavable पॉलीपेप्टाइड कस्पासे biosensor Apoliner (चित्रा 1 बी) के बाद मॉडलिंग की है। 28 यह पॉलीपेप्टाइड DIAP1 (apoptosis के ड्रोसोफिला अवरोध) एक स्वाभाविक रूप से होती कस्पासे साइट है कि आम तौर पर apoptosis के दौरान cleaved है जिसमें से ली गई है कस्पासे द्वारा DrICE। 42,43 DrICE कस्पासे 3 स्तनधारियों और cleaves सबसे अधिक जाना जाता सेलुलर substrates में करने के लिए बराबर है। caspases की 4,32 विशेषता, DIAP1 और उसके व्युत्पन्न पॉलीपेप्टाइड एक विशिष्ट aspartic एसिड के बाद चिपके रहते हैं, Asp20 कस्पासे मान्यता के भीतर स्थित अनुक्रम 17 DQVD-20, और अला (DQVA) को अनिवार्य Asp20 अवशेषों का उत्परिवर्तन समाप्त दरार। 42,43 Apoliner, 28 के लिए इसी प्रकार इस DIAP1 टुकड़ा ancho हैमाउस सीडी 8 (अल्फा श्रृंखला एमिनो एसिड 1-220), ड्रोसोफिला में आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरण के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली में कोशिका द्रव्य में लाल। सीडी 8 झिल्ली लंगर कस्पासे गतिविधि के अभाव में नाभिक को translocating से किसी भी सीमित माल असर एक परमाणु translocation अनुक्रम (Apoliner के मामले में nucGFP) को रोकता है। 28 CaspaseTracker के दूसरे प्रमुख घटक ड्रोसोफिला जी का पता लगाने प्रणाली है, जिसमें खमीर प्रतिलेखन कारक Gal4 flippase (FLP) recombinase की अभिव्यक्ति लाती है (और साथ ही साथ आरएफपी लाती है)। 34 flippase nucGFP की स्थायी अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी कोडोन एक बंद excises। जी-ट्रेस कस्पासे गतिविधि के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए, यह Gal4, जो जी-ट्रेस सक्रिय करने के लिए आवश्यक है, tethering Apoliner (चित्रा 1 ए) के प्लाज्मा झिल्ली लंगर कस्पासे cleavable DIAP1 टुकड़ा करने से Apoliner प्रणाली के साथ जोड़ दिया गया था। 35

हम अतिरिक्त modif बनायाCaspaseTracker की Apoliner घटक के लिए ications उपयोगिता में सुधार होगा। सबसे महत्वपूर्ण है, यह महत्वपूर्ण है कि कस्पासे biosensor खुद caspases को बाधित नहीं करता है, संभवतः कोशिकाओं है कि अन्यथा मर जाएगा संरक्षण है। हालांकि Apoliner ट्रांस्जीन, ड्रोसोफिला 28 में स्पष्ट phenotypes कारण नहीं था के रूप में एक शक्तिशाली कस्पासे अवरोध की उम्मीद होगी, यहां तक कि कोशिकाओं के कभार संरक्षण कस्पासे गतिविधि के साथ सामान्य कोशिकाओं की पहचान करने के उद्देश्य से हार जाएगा। हालांकि, Apoliner में DIAP1 टुकड़ा एक आकृति (135-DICG-138) है कि बाद में potently DrICE, उसी कस्पासे कि Asp20। 43 कस्पासे निषेध के तंत्र पर cleaves DIAP1 एक क्रिस्टल संरचना से पता चला था बाधित करने के लिए दिखाया गया था होता है जो DIAP1 में Asp135 इसलिए एक कस्पासे सब्सट्रेट नकल के रूप में DrICE सक्रिय साइट में ही है (लेकिन cleaved नहीं है)। 43 बायोकेमिकल विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि Asp135 पर एक Arg प्रतिस्थापन समाप्त DrICE-निरोधात्मक कार्य करते हैं। 43, CaspaseTracker ही D135R उत्परिवर्तन के साथ इंजीनियर था कस्पासे निषेध (चित्रा 1 बी)। 35 Apoliner के लिए इसी प्रकार से बचने के लिए, Asp20 में दरार के बाद नए सिरे से एन टर्मिनस पर प्राकृतिक रूप से उत्पन्न DIAP1 Asn-Asn अनुक्रम CaspaseTracker में Gly-वैल में बदल गया था कस्पासे दरार पर एन अंत शासन द्वारा Gal4 की गिरावट को रोकने के लिए (चित्रा 1 बी)। 28 अलावा, हम CaspaseTracker अभिव्यक्ति की तैयार पता लगाने के लिए Gal4 की सी टर्मिनस के लिए एक MYC-टैग जुड़े हुए। इनमें आवश्यकता है 35, Apoliner के स्वयं के आरएफपी और nucGFP कैसेट यह जी का पता लगाने, जो भी आरएफपी और nucGFP शामिल है के साथ संगत बनाने के लिए नष्ट कर दिया गया। 28,35

Gal4 अपने स्वयं के परमाणु स्थानीयकरण संकेत भालू और जब ड्रोसोफिला में अन्य ट्रांसजीन, Gal4 रिलायंस एनर्जी का शायद ही कुछ अणुओं से जुड़े हुए potently अपने लक्ष्य डीएनए प्रतिक्रिया तत्व (यूएएस) के माध्यम से प्रतिलेखन को सक्रिय करता है क्योंकिcytoplasmic caspases द्वारा ढील कुछ ही घंटों (अनुमानित ≤12 ज) के भीतर आरएफपी अभिव्यक्ति को चालू करने के लिए पर्याप्त हैं। क्योंकि biosensor गतिविधि नए सिरे से प्रतिलेखन और आरएफपी के अनुवाद की आवश्यकता है, यह वास्तविक समय enzymatic गतिविधि की रिपोर्ट नहीं है। हालांकि CaspaseTracker आरएफपी काफी एक दिन के भीतर होने की संभावना अपमानित किया जाएगा कस्पासे गतिविधि रहता है के बाद, nucGFP सेल और अपनी संतान के जीवन के लिए ubiquitin प्रमोटर द्वारा व्यक्त किया जाएगा।

पहले प्रदर्शित करने के लिए कि CaspaseTracker विवो में कस्पासे सक्रियण के लिए उत्तरदायी है, वयस्क CaspaseTracker biosensor मक्खियों मौत उत्प्रेरण उत्तेजनाओं सेल से अवगत कराया गया। ड्रोसोफिला अंडाशय एक अच्छी तरह से अध्ययन कोशिका मृत्यु मॉडल अंडा कक्षों क्रमादेशित कोशिका मृत्यु जब जानवरों जोर दिया जाता है, पर्यावरण की स्थिति मिलान उत्पादन संतान के एक प्रकल्पित तंत्र से गुजरना है। 37,44,45 कोशिका मृत्यु के लिए प्रेरित करने के लिए, biosensor मक्खियों ठंड में हैरान थे 1 घंटे में -7डिग्री सेल्सियस (जानवरों ठंड), और अंडाशय जीवित पशुओं अगले दिन (चित्रा 2A) से विच्छेदित कर रहे थे। इलाज biosensor मक्खियों के विपरीत, ठंड के झटके के बाद अंडा कक्षों काफ़ी छोटे थे और मजबूत लाल (हाल) और हरी (स्थायी) biosensor गतिविधि का प्रदर्शन किया, एक कोशिका मृत्यु के बाद प्रोत्साहन biosensor सक्रियण की पुष्टि करने के लिए (चित्रा 2 बी, विलय)। Biosensor गतिविधि दोनों रोगाणु कोशिकाओं के नाभिक (नर्स कोशिकाओं और oocytes) और अंडे कक्षों में दैहिक कोशिकाओं (कूप कोशिकाओं) में पाया गया था, लेकिन केवल इलाज किया मक्खियों में। 35 apoptosis के Morphologies विशेषता भी आसानी से biosensor पॉजिटिव अंडा कक्षों में मनाया गया परमाणु विखंडन, डीएनए संक्षेपण और गिरावट (नीला दाग की हानि) भी शामिल है। Biosensor गतिविधि दोनों परमाणु संक्षेपण (Hoechst) और सक्रिय caspases (immunostain) के साथ एक ही कोशिकाओं में पाया जा सकता है, लेकिन सक्रिय caspases के लिए सबसे तीव्र धुंधला क्षेत्रों में जहां दोनों परमाणु डीएनए और caspas में हुईई biosensor संकेतों कम हो गया है या अपमानित (चित्रा 2 बी)। 46,47 कोशिका मृत्यु ठंड के झटके के बाद होने वाली तंत्र अच्छी तरह से होती नहीं कर रहे हैं, और अन्य मौत तंत्र खेलने पर हो सकता है। हालांकि, इसी तरह के परिणाम 35 एमिनो एसिड भुखमरी, जो apoptosis कारण जाना जाता है के बाद प्राप्त किया गया।

यदि CaspaseTracker गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि का पता लगाने सकता है निर्धारित करने के लिए, स्वस्थ 1 दिन पुरानी मक्खियों के आंतरिक अंगों सावधानी autofluorescent छल्ली और वसा को हटाने के द्वारा विच्छेदित कर रहे थे। एक भी प्रतिनिधि मक्खी से ऊतकों तय किया गया, घुड़सवार, Hoechst के साथ दाग मांसपेशियों की कोशिकाओं का पता लगाने के नाभिक और एफ actin के लिए Phalloidin दाग के साथ चिह्नित करने के लिए। स्वस्थ अंडे कक्षों, जो biosensor सक्रियण की कमी के विपरीत, एफ actin से सना हुआ अंडा कक्षों के बीच मांसपेशियों की कोशिकाओं दोनों लाल और हरे रंग biosensor-गतिविधि (चित्रा 3 ए, इनसेट) था। हालांकि, यह संभव है कि biosensor भी अन्य कोशिकाओं लेबल। कई अन्य स्वस्थ ऊतकों और बेहतर पाला 1 दिन पुरानी मक्खियों के अंगों शायद बेसल गैर apoptotic कस्पासे समारोह (चित्रा 3) को दर्शाती प्रमुख कस्पासे biosensor गतिविधि का प्रदर्शन किया। Biosensor पॉजिटिव कोशिकाओं आकृति विज्ञान के सामान्य दिखाई दिया और सुझाव ऊतकों में संगठित पैटर्न में हुई है कि कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट, caspases सक्रिय biosensor पॉजिटिव hindgut (चित्रा 3 ए, इनसेट) लपेटकर कोशिकाओं के उदाहरण धारियों के लिए।

सबसे अच्छा सबूत है कि CaspaseTracker caspases की एक विशिष्ट पत्रकार है, नियंत्रण biosensor है, जो अनिवार्य कस्पासे दरार साइट पर एक एएसपी आला करने के लिए एमिनो एसिड उत्परिवर्तन के लिए छोड़कर CaspaseTracker के समान है व्यक्त मक्खियों में संकेत की कमी है DQVA को DQVD बदल रहा है ( चित्रा 1 बी और 3 बी)। एक असाधारण दुर्लभ सेल (चित्रा 3 बी, हरी तीर), केवल संकेत observ के अलावाDQVA नियंत्रण biosensor मक्खियों में एड में इस तरह के मुंह भागों (चित्रा 3 बी) और फसल में भोजन किया जाता है और कहीं और (चित्रा 3 बी और 4), जो भी गैर ट्रांसजेनिक पैतृक मक्खियों कि कस्पासे biosensor की कमी में मनाया जाता है के रूप में autofluorescent संरचनाओं, कर रहे हैं। 35 CaspaseTracker लेबल की कोशिकाओं के साथ malpighian (किडनी) नलिकाओं नियमित अंतराल पर होते हैं और अक्सर एक साथ प्रदर्शन कर दोनों हाल ही में (लाल) और अतीत (हरा) कस्पासे सक्रियण, जबकि मस्तिष्क में कई कोशिकाओं, ऑप्टिक पालियों, हृदय, फसल, आद्यमध्यांत्र और डिंबवाहिनी तो लाल या हरी (4 आंकड़े और 5 ए) कर रहे हैं।

सबूत है कि लंबे समय रहते कोशिकाओं कस्पासे गतिविधि जीवित रह सकते हैं के लिए, ऑप्टिक पालि अखिल neuronal मार्कर ELAV (भ्रूण घातक असामान्य दृष्टि) के लिए immunostained किया गया था। 48 कई न्यूरॉन्स के नाभिक डबल CaspaseTracker और ELAV से परमाणु-लक्षित GFP साथ लेबल रहे थे, लंबे समय रहते सीई के साथ संगतlls गैर मौत कार्यों के लिए caspases का उपयोग कर (चित्रा 5 ब)। इसके अलावा, अगर biosensor 10 दिन (Gal80ts का उपयोग) के लिए बंद कर दिया है, biosensor पॉजिटिव कोशिकाओं पेट में अवधि (चित्रा 6A और ख), मस्तिष्क और अन्य जगहों के लिए जारी रहती है (नहीं दिखाया गया है)। कस्पासे biosensor CaspaseTracker का उपयोग करना, हम पूरे पशुओं में बेसल कस्पासे गतिविधि के पहले अवलोकन प्रदान करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए CaspaseTracker biosensor प्रणाली। (क) ड्रोसोफिला कस्पासे biosensor के अवयव। (ख) CaspaseTracker biosensor प्रणाली के कस्पासे cleavable भाग एक प्लाज्मा झिल्ली लंगर (mCD8) से बना है, एक प्राकृतिक कस्पासे दरार साइट Asp20 युक्त DIAP1 का एक टुकड़ा Gal4 प्रतिलेखन के लिए जुड़े हुए एक सी टर्मिनल 3x-MYC टैग के साथ कारक और यूबीक्यूटिन समर्थक के माध्यम से व्यक्त कियाMoter। कस्पासे दरार नाभिक को Gal4 की translocation में यह परिणाम जी का पता लगाने प्रणाली प्रेरित करने के लिए। एक नियंत्रण biosensor में, 4-एमिनो एसिड कस्पासे दरार साइट (DQVD) में अपेक्षित Asp20 अवशेषों आला (DQVA) में बदल जाता है कस्पासे दरार को खत्म करना। ट्रांसजेनिक CaspaseTracker मक्खियों 4 ट्रांसजीन होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: CaspaseTracker कोशिका मृत्यु के दौरान caspases से सक्रिय है। (क) ड्रोसोफिला अंडाशय और ठंड के झटके प्रेरित कोशिका मृत्यु के लिए प्रवाह आरेख के योजनाबद्ध। ड्रोसोफिला अंडाशय (पोलन सैंटोस द्वारा) ड्राइंग और ड्रोसोफिला छवि (डैरेन Obbard द्वारा) 6 के अंडाशय से अनुमति के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं। (ख) अंडे कक्षों दिन महिला CaspaseTracker फेड डब्ल्यू मक्खियों 6 दिन (इलाज) या 1 दिन ठंड के झटके के बाद के लिए ith सामान्य मक्खी भोजन (-7 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे, 25 के द्वारा पीछा डिग्री सेल्सियस 24 घंटे के लिए) अंडा कक्षों में कस्पासे सक्रियण प्रेरित करने के लिए। ठंड का इलाज अंडाशय (नीचे सही फ्रेम) के enlargements एक में तीन अंडे कक्षों दिखाने परमाणु संक्षेपण (ऊपर अंडे कक्ष), परमाणु विखंडन (मध्य अंडा कक्ष और insets) और गिरावट (कम अंडे के सबूत के साथ श्रृंखला (लगभग खड़ी केंद्रित) ovariole विकासशील चैम्बर) Hoechst डीएनए दाग (नीला) पर आधारित है। सक्रिय caspases (विरोधी कस्पासे 3, मैजेंटा) मध्य और निचले अंडा कक्षों में पता चला रहे हैं। आरएफपी और GFP biosensor गतिविधि (लाल, हरे और पीले तीर) परमाणु डीएनए संक्षेपण के साथ कोशिकाओं है कि अक्सर diffusely सक्रिय caspases (insets) के साथ दाग में होते हैं। व्हाइट तीर biosensor गतिविधि और सक्रिय कस्पासे immunostain दोनों कमी नाभिक निशान। * Autofluorescence का संकेत है। इन आंकड़ों तांग एट अल।, विज्ञान निरसित 2015 से अनुमति के साथ reproduced हैं।source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: बड़े पैमाने पर शारीरिक कस्पासे गतिविधि के लिए साक्ष्य। (क) एक भी नव eclosed 18 डिग्री सेल्सियस पर उठाया मक्खी से CaspaseTracker (DQVD) आरएफपी और nucGFP की confocal छवि विलय कर दिया, विच्छेदित और नाभिक और Phalloidin एफ actin (गुलाबी) के लिए के लिए H33342 के साथ दाग, और डीआईसी के साथ imaged। Phalloidin केवल अंडा कक्षों के लिए इनसेट में दिखाया गया है। (ख) एक ही प्रक्रिया और इमेजिंग की स्थिति नियंत्रण CaspaseTracker के लिए पीछा किया गया था (DQVA) मक्खियों। * Autofluorescent संरचनाओं। इन आंकड़ों तांग एट अल से अनुमति के साथ reproduced हैं।, विज्ञान निरसित वर्ष 2015 का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

चित्रा 4
चित्रा 4:। बेसल कस्पासे गतिविधि कई ऊतकों में जिला उद्योग केंद्र के उच्च आवर्धन और GFP (अतीत) और आरएफपी (हाल) CaspaseTracker (DQVD) गतिविधि और के प्रतिदीप्ति confocal छवियों मस्तिष्क, हृदय, फसल, आद्यमध्यांत्र, Malpighian नलिकाओं में Hoechst से सना हुआ नाभिक और चित्रा 3 ए से oviducts। * Autofluorescent संरचनाओं। इन आंकड़ों तांग से अनुमति के साथ reproduced हैं एट अल।, विज्ञान निरसित वर्ष 2015 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: ड्रोसोफिला के न्यूरॉन्स में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि ऑप्टिक पालि। (क) डीआईसी और आरएफपी (हाल) और GFP (अतीत) CaspaseTracker (DQVD) गतिविधि और Hoechst से सना हुआ नाभिक मस्तिष्क में साथ confocal छवियों। आरएफपी + GFP दोहरे लेबल की कोशिकाओं (पीले तीर)। (ख) NucGFP CaspaseTracker (DQVD) के ऑप्टिक पालि में पैन न्यूरोनल परमाणु ELAV प्रोटीन के लिए immunostain साथ colocalizes उड़ मस्तिष्क। NucGFP और ELAV के सह स्थानीय संकेतों के साथ न्यूरॉन्स (सफेद तीर) दिखाए जाते हैं। ध्यान दें, आरएफपी लेबल न्यूरॉन्स इस विशेष क्षेत्र में मौजूद नहीं हैं। इन आंकड़ों तांग से अनुमति के साथ reproduced हैं एट अल।, विज्ञान निरसित वर्ष 2015 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम CaspaseTracker के निर्माण और अंदरूनी कामकाज कि स्वस्थ ऊतकों में बड़े पैमाने पर बेसल कस्पासे गतिविधि का पता लगाने की सुविधा को दर्शाते हैं। विवो में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) biosensor ट्रांस्जीन के साथ मक्खियों को पैदा करने, 2) उचित नियंत्रण के साथ कस्पासे विशेष संवाददाता समारोह की पुष्टि करने, 3) वयस्क ड्रोसोफिला के सभी आंतरिक अंग प्रणालियों का निरीक्षण करने के लिए विच्छेदन तकनीकों का अभ्यास, और 4) autofluorescent कलाकृतियों से विशिष्ठ biosensor गतिविधि।

प्राकृतिक कस्पासे cleavable पॉलीपेप्टाइड कि कस्पासे विशिष्ट संवेदक के रूप में कार्य करता है biosensor द्वारा किसी भी कस्पासे निरोधात्मक गतिविधि से बचने के लिए संशोधित किया गया था। आगे संशोधन Gal4 प्रतिलेखन कारक का तेजी से क्षरण और एक मिलान टैग की प्रविष्टि से बचने के लिए किए गए थे। हम यह भी मक्खियों के पूरे शरीर के अंग विच्छेदन, immunostaining, बढ़ते और मक्खी ऊतक के confocal माइक्रोस्कोपी का वर्णनगैर-apoptotic कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के लिए।

जबकि CaspaseTracker कोशिकाओं है कि कस्पासे गतिविधि के निम्न स्तर के साथ जीवित रहने का पता लगाने के लिए आदर्श है, यह नहीं वास्तविक समय एंजाइम गतिविधि के एक पत्रकार के रूप में कई घंटे biosensor को चालू करने के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, हम पता लगाने के लिए कम से कम समय है, जो यहाँ वर्णित अनुप्रयोगों के लिए जरूरत से बहुत कम संभावना है निर्धारित नहीं किया है। CaspaseTracker के विपरीत, अन्य कस्पासे biosensors के प्रमुख सीमा के रूप में वे मुख्य रूप से कोशिका मृत्यु का अध्ययन करने के लिए तैयार कर रहे हैं, कस्पासे गतिविधि के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए उनकी असमर्थता है। कस्पासे गतिविधि एक कोशिका मृत्यु उत्तेजना के बाद परिलक्षित होता है, कम से कम 30 मिनट में बड़े पैमाने पर सेल विध्वंस के कारण। 49 इसलिए, कस्पासे सक्रियण का पता लगाने के लिए अक्सर माना जाता है कुछ कोशिका मृत्यु के एक मार्कर होने के लिए। 50,51 हालांकि, बढ़ते सबूत इंगित करता है कि caspases गैर apoptotic, स्वस्थ कोशिकाओं में भी गैर-degradative कार्य करता है। 7-21 presucaspases कि अपने दिन के नौकरियों के लिए बाहर ले जाने के स्थानिक और अस्थायी रूप से प्रतिबंधित enzymatic गतिविधि की मेड निम्न स्तर उपलब्ध तकनीकों द्वारा पता लगाने से नीचे जाने की संभावना है। यह समस्या CaspaseTracker, जो की संभावना मजबूत संकेतों को उत्पन्न करने के लिए कुछ कस्पासे दरार की घटनाओं की आवश्यकता से दूर है, और चल रहे कस्पासे enzymatic गतिविधि की आवश्यकता नहीं है स्थायी रूप से vivo में इन कोशिकाओं लेबल।

प्रस्तुत साक्ष्य इंगित करता है कि CaspaseTracker, caspases के लिए विशिष्ट है, हालांकि हम इस संभावना है कि अन्य अज्ञात एएसपी विशिष्ट proteases CaspaseTracker सक्रिय कर सकता है बाहर नहीं कर सकते। हालांकि, खिला कस्पासे अवरोध पेप्टाइड्स ब्लॉकों CaspaseTracker गतिविधि का एक कॉकटेल (अप्रकाशित) के साथ मक्खियों। हम यह भी है कि खुद को biosensors caspases को बाधित कर से बचने के महत्व पर जोर देना, और नियंत्रण biosensors और गैर ट्रांसजेनिक मक्खियों के महत्व को कीट छल्ली के लिए निहित autofluorescence के कारण गलत निष्कर्ष से बचने के लिए, आंतरिक वसा Depoबैठता है, भोजन या अन्य confounders जाता।

एक और चुनौती caspases के समर्थक मौत और गैर-मौत कार्यों भेद है। प्रो-मृत्यु और गैर-मौत कार्यों प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विस्तार के एक उचित समय पर मौत के लिए एक सामान्य शारीरिक राज्य के बीच कोशिकाओं में संक्रमण के कैंसर को रोकने के लिए इन कोशिकाओं के संक्रमण और बाद के उन्मूलन से लड़ने के लिए उदाहरण के लिए, के प्रयोजन के लिए evolutionarily जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, हम संभावना है कि आंतरिक अंगों में मनाया बेसल कस्पासे गतिविधि के कुछ बजाय कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देने के लिए एक प्रयास है, मालूम होता अरबों सेल से होने वाली मौतों की अनुमानित दसियों मानव शरीर में होने वाली दैनिक के साथ संगत है स्वस्थ आकृति विज्ञान को खत्म नहीं कर सकते हैं। 52 हालांकि, biosensor व्यक्त कोशिकाओं की दृढ़ता से संकेत मिलता है कि CaspaseTracker कस्पासे गतिविधि caspases के सामान्य दिन के नौकरियों के लिए इरादा पता लगाने में सक्षम है।

Caspases इस तरह के सेल के रूप में गैर-मौत की भूमिका निभाने का सुझाव दिया जाता हैप्रसार। इस पहले प्रयास स्तनधारी सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक वायरल प्रोटीन है कि बाँध व्यक्त पैदा करते हैं और सीधे सेलुलर caspases को बाधित करने के लिए (जैसे, CrmA) के अनुरूप है। सेल कालोनियों के सैकड़ों खाली नियंत्रण वेक्टर के साथ दवा चयन के दौरान पैदा हुई, वहीं अप्रत्याशित रूप से शून्य कालोनियों वेक्टर व्यक्त कस्पासे अवरोधकों (अप्रकाशित) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट समानांतर संस्कृतियों में गठन किया था। इस प्रकार, caspases संभावना सामान्य कोशिकाओं में बड़े पैमाने पर कार्य करता है कि वर्तमान में underappreciated रहे हैं। यह आगे लग रहा है कि CaspaseTracker मक्खी में बेसल biosensor गतिविधि न्यूरॉन्स, सामान्य स्वस्थ मक्खियों में सहित ज्यादातर अंग प्रणालियों, भर में कई प्रकार की कोशिकाओं में पाया जाता है द्वारा समर्थित है। न्यूरॉन्स में स्वस्थ कस्पासे गतिविधि apoptosis के दौरान के रूप में ही substrates cleaving द्वारा सामान्य मस्तिष्क समारोह को बढ़ावा देने के लिए synaptic अंत को नष्ट कर सकते हैं, या अपने दिन के काम कार्यों apoptosis-तरह की गतिविधियों से पूरी तरह से अलग हो सकता है। जबकि कम सक्रिय के उच्च स्तरों एंजाइमी बनामcaspases दिन-रोजगार और कोशिका मृत्यु के बीच एक महत्वपूर्ण भेद हो सकता है, विशिष्ट कस्पासे uncleavable substrates कि इस संभावना को समर्थन के साथ कुछ Knockin उत्परिवर्ती पशुओं देखते हैं। 17,53 हालांकि, हाल ही में प्रगति का संकेत है कि कस्पासे 8 RIPK cleaving द्वारा संभवतः necroptosis रोकता है, 54 synaptic अवसाद और AMPA रिसेप्टर endocytosis Gap43, 55 और microRNA प्रसंस्करण के कस्पासे दरार द्वारा विनियमित किया जा सकता पासा खेलनेवाला की कस्पासे दरार द्वारा विनियमित किया जा सकता है। 14,15,56

इस biosensor के कई अतिरिक्त आवेदन कर रहे हैं। निर्धारित करने के लिए caspases, biosensor की अभिव्यक्ति आसानी से अस्थायी विनियमित किया जा सकता है (जैसे, Gal80ts का उपयोग) विशिष्ट समय पर या विशिष्ट ऊतकों में और विशेष प्रकार की कोशिकाओं (जैसे, घ्राण-विशिष्ट Gal4 चालक) में सक्रिय रहे हैं। biosensor अभिव्यक्ति को दबाने के लिए जब तक वयस्क के उद्भव अभी भी बड़े पैमाने biosensor गतिविधि में हुई मक्खियों Gal80ts का उपयोग करना, यह दर्शाता है कि caspasतों वयस्क चरणों (चित्रा 6C और डी) में सक्रिय हो सकते हैं। 35 अन्य कस्पासे substrates, अन्य अनुप्रयोगों के साथ DIAP1 टुकड़ा की जगह अलग caspases के लिए विशिष्ट biosensors शामिल हो सकते करके और विशिष्ट substrates की दरार का पता लगाने के लिए। CaspaseTracker biosensor गैर apoptotic कस्पासे गतिविधियों की भूमिका के बारे में हमारी समझ में वृद्धि होगी।

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Acknowledgments

हम छवि में ड्रोसोफिला चित्रों के लिए पोलन सैंटोस और डैरेन Obbard धन्यवाद। 2A, JHMRI insectary के उपयोग के लिए मार्सेलो याकूब-लोरेना। इस काम के लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन फैलोशिप (HLT) द्वारा समर्थित किया गया था, विश्वविद्यालय अनुदान समिति हांगकांग AoE / बी-07/99 (एमसीएफ), और एनआईएच अनुदान NS096677, NS037402 और NS083373 (JMH)। हो लाम तांग लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन की एक Shurl और Kay CURCI फाउंडेशन साथी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 117 कस्पासे biosensor, Apoptosis गैर apoptotic मस्तिष्क न्यूरॉन्स CaspaseTracker
<em>विवो बायोसेंसर</em> पटरियों <em>ड्रोसोफिला</em> में गैर apoptotic कस्पासे गतिविधि
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Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

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