Summary
For å detektere friske celler i hele dyr som inneholder lave nivåer av kaspase-aktivitet, ble den meget følsomme biosensor betegnet CaspaseTracker generert for Drosophila. Caspase-avhengig biosensor-aktivitet er detektert i langlivede friske celler gjennom de indre organer hos voksne dyr oppdrettet i henhold optimaliserte betingelser i fravær av døds stimuli.
Introduction
Caspases er cystein proteaser som medierer apoptotisk celledød ved å spalte mange intracellulære proteiner etter nøkkel aspartat rester. For eksempel, initiativtaker caspases aktivere effektor caspases, derepress DNA nukleaser, hold fast cytoskeletal komponenter og endre lipid sammensetningen av cellemembraner for å raskt demontere celler og stimulere deres anerkjennelse og engulfment av naboceller som avhende celle lik. 1-4 Det er anslått at milliarder av celler dør per dag i menneskekroppen, og apoptose er en viktig mekanisme av kjemoterapi-indusert tumor celledød. 5 et annet sett av caspaser kan føre til celledød ved distinkte ikke-apoptotiske prosesser for å stimulere medfødt immunitet. 6 Derfor det meste av forskningen på caspases har fokusert på sine pro-døden funksjoner.
Interessant, tidlig bevis i feltet viste at de samme caspases ansvarlig for å fremme celledød har også ikke-døden functions. Banebrytende studier har vist at caspaser er involvert i forskjellige cellulære funksjoner i friske celler, inkludert regulering av celleproliferasjon og migrering under embryogenese. 7-9 Kaspaser er nødvendig for individualisering spermatid i Drosophila 10,11, for blokkering av en alternativ reaksjonsvei necroptotic celledød i mus 12,13, og for mikroRNA behandling i C. elegans. 14,15 i kanskje den lengste levetid celler, nerveceller, caspases og andre apoptotisk maskiner er involvert i reguleringen av neuronal aktivitet ved beskjæring synaptiske avslutninger, en prosess antas å være avgjørende for å styrke andre synapser for læring og hukommelse. 16- 18 Det er mulig at caspases lette synaptiske beskjæring av en type mini-apoptose av ørsmå nevrale projeksjoner uten hele celledød. 19 Men caspases kan ha alternative funksjoner som ikke er relatert til apoptose-lignende hendelser. 20,21 Dual rolles i liv og død er ikke unikt for caspases; BCL-2 familie proteiner og cytokrom c har roller i mobilnettet energetikk i friske celler, men er også en del av kjernen apoptotiske sti som aktiveres av mange typer stress i cellene. 22-25 Selv om det ikke bevist, virker det logisk at evolusjon har koblet dag -jobs til døds jobber innenfor de samme molekylene å sikre rettidig eliminering av uegnede eller uønskede celler.
I dag er de molekylære mekanismene for ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet ikke er forstått, og graden av ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet under embryonal utvikling og i voksent vev er heller ikke kjent. En stor utfordring er vanskeligheten med å skille dagsjobber fra døds jobber av kaspaser. I motsetning til apoptose og pyroptosis, når caspase aktivitet forsterkes av et proteolytisk kaskade, er de dag jobber av caspases forventes å skje på mye lavere nivå av enzymatisk aktivitet, trolig under påvisning av mange tilgjengelige technologies.
Før arbeidet som presenteres her, andre utviklet en rekke caspase biosensorer for ulike formål. SCAT biosensorer (f.eks ECFP-DEVD-Venus) raskt oppdage sanntid caspase aktivitet i dyrkede celler og animalsk vev ved hjelp av gnage. 26,27 Ved caspase cleavage, den atom målrettet GFP-delen av Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) gjennomgår subcellulære relocalization i løpet av minutter når sin plasmamembran-tjore spaltes av kaspaser. 28 Tilsvarende ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes fra cytosol til kjernen på caspase cleavage. 29,30 Mer nylig, kromoforen i iCasper ble ekspedert konstruert til å fluorescere når spaltet av kaspaser, som tillater deteksjon av biosensor aktivitet i sanntid i neuroner i Drosophila embryo, men først og fremst i forbindelse med utviklings celledød. 31 Caspase-avhengig død av olfactory neuroner i løpet av aldring var demonstrerer atvurdert ved immun-påvisning av caspase-spaltet form av CPV biosensorer (f.eks mCD8-PARP-Venus). 32,33 Viktigere, ble den aktiverte formen av caspase-3 detekteres i fravær av celledød ved sensitive immunfarging i ryggrader av dyrkede nerveceller, og i soma med caspase-avhengig fluorescens av atom CellEvent reporter fargestoff, men noe var vanskelig på grunn av foto-toksisitet, selv om celledød ble utsatt til etter ryggraden eliminering. 19 Dermed nye caspase biosensorer for å oppdage og spor celler med basal kaspase-aktivitet in vivo.
For å overvinne disse vanskelighetene, genererte vi en ny tofarget caspase biosensor, betegnet CaspaseTracker. Denne strategien kombinerer en modifisert versjon av Drosophila caspase-sensitive Apoliner biosensor 28 med Drosophila G-TRACE FRT rekombinase system 34 for permanent å merke og spore-celler in vivo. <sup> 35 GAL4-aktivert G-TRACE system tillater meget lave nivåer av caspaser å aktivere CaspaseTracker, noe som resulterer i RFP ekspresjon i cytoplasma og faste kjerne målrettet GFP-ekspresjon i en hvilken som helst celle som noensinne har opplevd kaspase-aktivitet. 35 Dette systemet kan merke celler i hele livet i hele dyr ved hjelp av Drosophila melanogaster, en medgjørlig og mye brukt modellsystem for studier av kaspaser og celledød. 36-38
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av CaspaseTracker Fluer
- For å forberede CaspaseTracker (DQVD) flyr for eksperimenter, utfører dette korset: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, Ubi> Stopp> GFP-NLS), ved å overføre 7-10 jomfru kvinne (eller mann) fluer bærer caspase biosensor underlaget mCD8-DIAP1-Gal4 drevet av ubiquitin promoter 35 sammen med like mange menn (eller kvinne) G-TRACE fluer, som har andre kromosomet cYO balancer for å unngå dødelighet av homozygot kombinasjon av G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, og Ubi> Stopp> GFP-NLS) 34. Place fluer i en fersk mat hetteglass med fersk gjær lim som proteinkilde.
- Inkuber filer ved 18 ° C i 5 til 7 dager (maks 2 uker) og deretter fjerne den overordnede flyr fra hetteglasset for å unngå overbefolkning med nye avkom, og for å sette opp nye hekke ampuller.
- Fortsett inkubasjon ved 18 ° C til avkom flyr Eclose. Velg den ikke-CYO [non-curlY fløyen] avkom av riktig genotype av CaspaseTracker, som er transgene for CaspaseTracker og G-sporstoffer 35.
- Samtidig genererer kontrollforeldre ikke-transgene w118 fluer og caspase-insensitive (DQVA) flyr parallelt for å verifisere bestemt CaspaseTracker RFP og GFP fluorescens.
- Utfør PCR genotyping for å bekrefte filer med CaspaseTracker ved hjelp av primere: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produsere en 3897 bp produkt. For genotyping G-Trace loci, kan du bruke følgende primere for GFP (474 bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; for RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; og for Flpase (655 bp), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. For genotyping Gal4 i pUWR vektor (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.
2. Tissue Forberedelse, Farging og Montering
- For flue disseksjoner, forhindre dissekert vev fester seg til plastpipettespisser og sentrifugerør, frakk tips og rør med 1% bovint serumalbumin (BSA) oppløst i vann.
- Dissekere flyr på en silikonpute ved hjelp av tang.
- For å unngå å skade tuppen av tang på et hardt underlag når du utfører vevet disseksjon, utføre disseksjon på en silisium overflate. For å gjøre silikon disseksjon plater, smelte silisium i det kommersielle kit i henhold til produsentens instruksjoner (Materials List). Etter smelting silikon, tilsett 3 til 4 ml til en 60 mm diameter vev kultur parabolen. Silicon retter kan gjenbrukes.
- Anesthetize en flue med CO 2, og overføre den til en silikonplate med 1 ml kald PBS. Introduser CO 2 til et hetteglass med fly ved hjelp av en Blåserør, og deretter overføre bedøvet fly toa Pad som har et CO 2 forsyning.
- Bruke en pinsett for å holde fly hode, og et andre par av tang for å trekke thorax i motsatt retning for å koble fra fly hodet fra kroppen som dekker uten å ødelegge forbindelsen mellom hodet og forutgående.
- Bruk 2 par pinsett til å fjerne vingene og bena fra thorax.
- Bruke en pinsett for å holde brystkassen, og et annet par av tang for å trekke magen for å skille den fra thorax på nytt uten å skade forbindelsen mellom den forutgående og midttarmen.
- Dissekere indre organer, inkludert hjernen, gut, malpighian tubuli og eggstokker som tidligere demonstrert. 39-41
- Fjern alle biter av skjellaget og fett organer med tang som disse vev produserer sterk autofluorescence. Tålmodighet og praksis er pålagt å utarbeide en fullstendig organ system som vist.
- Overfør dissekert vev til 1,5 ml sentrifugerør, og fikse vev with 0,5 ml 4% paraformaldehyd i PBS (fosfatbufret saltvann) ved romtemperatur i 20 til 30 minutter med rotasjon i mørke for å unngå bleking RFP og GFP i vev. Unngå langvarig fiksering som kan kompromittere påfølgende flekker resultater.
- Fjern det paraformaldehyd ved forsiktig pipettering, og vaskes 3 ganger med 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) ved romtemperatur.
- Permeabilize vevet med 0,5 ml PBST ved 4 ° C over natten med forsiktig risting. Kortere inkubasjoner kan føre til ufullstendige permeabilization og kompromiss flekker resultater.
- Dersom det er nødvendig å redusere bakgrunnsfarging, vurdere inkubere vevene i 0,5 ml PBST med 1% BSA, i stedet for PBS.
- Vask vev 3 ganger med 0,5 ml PBST.
- For å farge kjerner og trådformede aktin (F-aktin), anvende 0,5 ml PBST med 10 ug / ml av Hoechst 33342 blå kjerne fargestoff og 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-aktin flekken og inkuber samtidig med vevene i 1 time ved RT with milde rotasjon i mørket. Unngå langvarig flekker da dette vil øke bakgrunnen.
- For farging, inkuber faste og permeabilisert vev med 0,1% Triton X-100 i 0,5 ml PBS over natten ved 4 ° C, flekken med 1: 100 fortynning av anti-ELAV antistoff eller med 1: 200 fortynning av anti-kaspase-3 natten ved 4 ° C (300 ul). Følge av den tilsvarende sekundære antistoff fortynnet 1: 100 og inkuberes i 1 til 3 timer ved RT. Se Materialer List for spesifikt antistoff informasjon.
- Vask vev 3 ganger, hver gang i 5 minutter i 0,5 ml PBST med forsiktig rotasjon.
- Med en pipette, fjern all PBST, og deretter legge til 200 mL anti-blekemiddel monteringsmiddel (se materialer) til å dekke vev for 1-3 timer ved romtemperatur, eller 4 ° C over natten. Optimale vev som har fullt absorbert festemiddel vil synke til bunnen av røret.
- Forhånds rengjøre glass lysbilde med vann eller 70% etanol og overføre vev med monteringsmiddel til glass lysbilde.
- Plasser forsiktig et glass dekkglass over vev. Påfør vaselin på glass-slide og dekkglass for å unngå å ødelegge vev ved overcompression. Fjern ekstra monteringsmiddel med silkepapir.
- Forsegle dekkglass ved anvendelse av neglelakk langs kantene av dekkglass for å unngå lekkasje av festemidler fra vevene.
3. konfokalmikroskopi
- Bruk en omvendt confocal epi-fluorescens mikroskop. Imidlertid kan opp-rett mikroskop kan også anvendes. Til bilde vev ved hjelp flislegging, opprettholde stabil romtemperatur for å unngå drift av fokus og skift av xy-planet på grunn av termisk ekspansjon og sammentrekning av komponentene. Omgivelseskontroll og fokus drift kompensasjon systemer bidra til å unngå dette problemet på grunn av tap av termo likevekt av mikroskopet system.
- Plasser lysbildet på scenen av mikroskopet. Ta et par prøvebilder med lav oppløsning (125 x 125 piksler) end bestemme riktig antall brikker for å dekke hele regionen av interesse (ROI).
- Sett mikroskop skanning system for å ta bilder med skanneoppløsning slik som 500 x 500 piksler. Velg målet som en 20X NA 0,8 eller en 63X NA 1.4 Plan-Apochromat mål for å analysere vev gjennom dekkglass, slik at hver av bilder (fliser) overlapper med 20% på alle sider.
- Sett opp bildesekvensen fra lengst til korteste eksitasjonsbølgelengdene, som lys på lang bølgelengde forårsaker lavere foto-bleking. Sekvensen fra lengst til korteste eksitasjonsbølgelengde er: (i) 633 nm for Phalloidin F-aktin og for antistoff til aktiverte kaspaser, (ii) 561 nm for RFP, (iii) 488 nm for GFP, og (iv) 405 nm for Hoechst atom flekken.
- Under bildebehandling, minimere eksponering av celler til fluorescerende laser eksitasjon under bildebehandling prosess for å unngå fotobleking ved å redusere laser intensitet for å oppnå kvalitet bilder av vev høye.
- Etter jegMages er samlet, flette bildene ved hjelp mikroskop programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er to viktige komponenter som gjør at CaspaseTracker å oppdage caspase aktivitet i normale friske celler (Figur 1a). Den første av disse er et 146 aminosyre caspase-spaltbare polypeptid modellert etter caspase biosensor Apoliner (figur 1b). 28 Dette polypeptid er avledet fra DIAP1 (Drosophila inhibitor av apoptose) inneholdende et enkelt naturlig forekommende kaspase område som blir spaltet i løpet av apoptose typisk av caspase DrICE. 42,43 DrICE er ekvivalent med caspase-3 i pattedyr og spalter de fleste kjente cellulære substrater. 4,32 Karakteristisk for kaspaser, DIAP1 og dens avledede polypeptid spaltes etter en bestemt asparaginsyre, Asp20 ligger innenfor caspase anerkjennelse sekvens 17-DQVD-20, og mutasjon av den obligatoriske Asp20 rest til Ala (DQVA) opphever cleavage. 42,43 likhet med Apoliner, 28 dette DIAP1 fragment er bisterrød i cytoplasma på plasmamembranen via mus CD8 (alfa-kjede aminosyrer 1-220), et vanlig verktøy i Drosophila. CD8 membrananker hindrer enhver tjoret last som bærer en kjernetrans sekvens (nucGFP i tilfelle av Apoliner) fra translocating til kjernen i fravær av kaspase-aktivitet. 28 Den andre nøkkelkomponent CaspaseTracker er Drosophila G-TRACE system i hvilket gjær transkripsjonsfaktor Gal4 induserer uttrykk for flippase (FLP) recombinase (og samtidig induserer RFP). 34 flippase excises et stoppkodon som fører til varig uttrykk for nucGFP. For å gjøre G-TRACE som reagerer på kaspase-aktivitet, ble den kombinert med Apoliner systemet ved å forankre Gal4, som er nødvendig for å aktivere G-TRACE, til plasmamembranen-forankret caspase-spaltbar DIAP1 fragment av Apoliner (figur 1a). 35
Vi gjorde flere modifications til Apoliner komponent av CaspaseTracker å forbedre verktøyet. Viktigst, er det avgjørende at caspase biosensor i seg selv ikke hemmer kaspaser, som potensielt kan bevare celler som ellers ville dø. Selv om Apoliner transgenet ikke føre åpen fenotyper i Drosophila 28, som vil bli forventet av en potent caspase-hemmer, ville selv sporadisk bevaring av celler beseire den hensikt å identifisere normale celler med caspase aktivitet. Imidlertid DIAP1 fragmentet i Apoliner inneholder et motiv (135-DICG-138) som senere ble påvist å potente hemmere DrICE, den samme caspase som spalter DIAP1 til Asp20. 43 Mekanismen for caspase inhibering ble avslørt ved en krystallstruktur hvori DIAP1 Asp135 er bundet inn i DrICE aktive sted som en caspase substrat etterligner (men er ikke spaltes). 43 Biokjemisk analyse viste at en Arg substitusjon ved Asp135 opphever DrICE-inhiberende funksjon. 43 Derfor, CaspaseTracker ble konstruert med samme D135R mutasjon for å unngå caspase hemning (figur 1b). 35 På samme måte som Apoliner, ble den naturlig forekommende DIAP1 Asn-Asn-sekvensen ved de novo-N-terminus følgende spaltning ved Asp20 endret til Gly-Val in CaspaseTracker for å hindre nedbrytning av Gal4 ved N-enden regel på caspase cleavage (Figur 1b). 28 i tillegg har vi smeltet en myc-tag til C-terminalen av Gal4 for klar påvisning av CaspaseTracker uttrykk. 35 av nødvendighet, Apoliner egen RFP og nucGFP kassetter ble slettet for å gjøre den kompatibel med G-TRACE, som også inneholder RFP og nucGFP. 28,35
Fordi Gal4 bærer sin egen nukleære lokaliseringssignal og potent aktiverer transkripsjon via dens target DNA-responselement (UAS) når kondensert til andre transgener i Drosophila, antagelig bare noen få molekyler av GAL4 rellindres ved cytoplasmatiske caspases er tilstrekkelig til å slå på RFP uttrykk i løpet av få timer (anslått ≤12 h). Fordi biosensor aktivitet krever de novo transkripsjon og oversettelse av RFP, betyr det ikke rapportere sanntid enzymatisk aktivitet. Selv om CaspaseTracker RFP vil bli betydelig degradert sannsynlig innen en dag etter at caspase aktiviteten opphører, vil nucGFP uttrykkes ved ubikvitin promoter for levetiden av cellen og dens avkom.
Hvis du først vise at CaspaseTracker er lydhør overfor caspaseaktivering in vivo, ble voksen CaspaseTracker biosensor fluer utsatt for celledød fremkallende stimuli. Den Drosophila eggstokk er et godt studert celledød modell som egg kamre gjennomgå programmert celledød når dyr blir stresset, en antatt mekanisme med matchende miljøforhold til avkom produksjon. 37,44,45 å indusere celledød, biosensor fluer var kald-sjokkert 1 time ved -7° C (fryse dyr), og eggstokkene ble dissekert fra levende dyr neste dag (Figur 2a). I motsetning til ubehandlede biosensor fluer, egg kamre etter kuldesjokk var merkbart mindre og utstilt robust rød (nyere) og grønt (permanent) biosensor aktivitet, verifisere biosensor aktivering etter en celledød stimulus (figur 2b, slå sammen). Biosensor-aktivitet ble påvist i kjernen av begge kjønnsceller (sykepleier celler og oocytter) og somatiske celler (hårsekkceller) i egg kamre, men bare i de behandlede fluene. 35 morfologier karakteristisk for apoptose ble også lett observeres på biosensor-positive egg kamre inkludert atom fragmentering, DNA kondens og nedbrytning (tap av blåved). Biosensor aktivitet kan påvises i de samme celler med både nukleær kondensasjon (Hoechst) og aktive caspaser (immunfarging), men den mest intense farging for aktive caspaser forekommet i områder hvor både kjerne-DNA og caspase biosensor signaler ble redusert eller forringet (figur 2b). 46,47 celledød mekanismene som oppstår etter kald-sjokk er ikke godt karakterisert, og andre døds mekanismer kan være på spill. Imidlertid, ble lignende resultater oppnådd etter aminosyre sult, som er kjent for å forårsake apoptose. 35
For å avgjøre om CaspaseTracker kunne oppdage ikke-apoptotiske caspase aktivitet, ble de indre organer sunne 1 dager gamle fluer omhyggelig dissekert ved å fjerne autofluorescent skjellaget og fett. Vev fra en enkelt representant flue var fikset, montert, farget med Hoechst å markere kjerner og med Phalloidin flekken for F-aktin å påvise muskelceller. I motsetning til friske egg kamre, som mangler biosensor-aktivering, F-aktin-farget muskelceller mellom egg kamre hadde både rød og grønn biosensor-aktivitet (figur 3a, innfelt). Det er imidlertid mulig at biosensor etiketter også andre celler. Mange andre sunne vev og organer optimalt oppdratt en-dag-gamle fluer utstilt fremtredende caspase biosensor aktivitet antagelig reflekterer basal ikke-apoptotiske caspase-funksjon (figur 3a). Biosensor-positive celler dukket morfologisk normale og oppstod i organiserte mønstre i vev som tyder på at bestemte undergrupper av celler aktivere caspases, for eksempel striper av biosensor-positive celler innpakning hindgut (figur 3a, innfelt).
Det beste bevis på at CaspaseTracker er en spesifikk rapportør av kaspaser er den manglende signal i fluer som uttrykker kontroll biosensoren, som er identisk med CaspaseTracker med unntak av en enkelt Asp Ala aminosyre mutasjon ved det obligatoriske caspase-spaltningssete, endre DQVD til DQVA ( Figur 1b og 3b). Med unntak av en usedvanlig sjelden celle (figur 3b, grønn pil), det eneste signal observed i DQVA kontroll biosensor fluer er autofluorescent strukturer, slik som munnpartiet (figur 3b) og inntatt mat i avling og andre steder (figur 3b og 4), som også er observert i ikke-transgene foreldre fluer som mangler caspase biosensor. 35 de CaspaseTracker-merkede celler oppstår med jevne mellomrom langs malpighian (nyre) tubuli og viser ofte både nyere (rød) og forbi (grønn) caspaseaktivering samtidig, mens mange celler i hjernen, optiske lapper, Cardia, beskjære, midgut og oviduct er enten røde eller grønne (figur 4 og 5a).
For bevis for at langlivede celler kan overleve caspase aktivitet, ble syns lapp immunostained for pan-nevronale markør ELAV (embryonale dødelig unormalt syn). 48 kjerner av mange nevroner var dobbelt merket med kjernefysisk målrettet GFP fra CaspaseTracker og ELAV, i overensstemmelse med lang levetid cells bruker caspases for ikke-døden funksjoner (figur 5b). Videre, hvis biosensor er slått av i 10 dager (ved hjelp av Gal80ts), biosensor-positive celler vedvarer så lenge i tarmen (figur 6a og b), hjerne og andre steder (ikke vist). Bruk av caspase biosensor CaspaseTracker, gir vi den første oversikt over basal caspase aktivitet i hele dyr.
Figur 1: CaspaseTracker biosensor system for å detektere ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet. (a) Komponenter i Drosophila caspase biosensor. (b) caspase-spaltbar del av CaspaseTracker biosensor systemet består av et plasmamembrananker (mCD8), et fragment av DIAP1 inneholdende en naturlig caspase-spaltningssete Asp20 sammensmeltet til Gal4 transkripsjon faktor med en C-terminal 3x-myc tag og uttrykt via ubiquitin promoter. Caspase spalting resulterer i translokasjon av Gal4 til kjernen for å indusere G-TRACE system. I et kontroll biosensor, blir den nødvendige Asp20 rest i 4-amino-syre caspase-spaltningssete (DQVD) endret til Ala (DQVA) for å avskaffe caspase spaltning. Transgene CaspaseTracker fluer inneholde 4 transgener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CaspaseTracker aktiveres av kaspaser i løpet av celledød. (a) Skjematisk av Drosophila eggstokk og flytdiagram for kuldesjokk-indusert celledød. Drosophila eggstokk tegning (etter Polan Santos) og Drosophila bildet (fra Darren Obbard) er brukt med tillatelse. (b) Egg kamre fra eggstokken av 6- dag kvinnelig CaspaseTracker fluer matet w ith normal flue mat for 6 dager (ubehandlet) eller en dag etter kuldesjokk (-7 ° C, 1 time, etterfulgt av 25- ° C i 24 timer) for å indusere caspaseaktivering i egge kamre. Utvidelser av kulde-behandlet eggstokk (nederst til høyre rammer) viser tre egg kamre i en utvikling ovariole kjede (sentrert omtrent loddrett) med bevis for atom kondens (øverst egg kammer), kjerne fragmentering (midten egg kammer og innfellinger) og nedbrytning (lavere egg kammer) basert på Hoechst DNA flekk (blå). Aktive caspases (anti-caspase-3, magenta) er påvist i de midtre og nedre egg kamre. RFP og GFP biosensor aktivitet (rød, grønn og gule piler) forekommer i celler med kjerne-DNA kondens som ofte flekken diffust med aktive caspases (innfellinger). Hvite piler markere kjerner mangler både biosensor aktivitet og aktiv caspase immunfarging. * Autofluorescence signaler. Disse dataene er gjengitt med tillatelse fra Tang et al., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bevis for utbredt fysiologisk caspase aktivitet. (a) Fusjonert confocal bilde av CaspaseTracker (DQVD) RFP og nucGFP fra en enkelt nylig eclosed fly hevet ved 18 ° C, dissekert og farget med H33342 for kjerner og Phalloidin for F-aktin (rosa), og avbildes med DIC. Phalloidin vises bare i innfelt for egg kamre. (B) samme prosedyre og bildeforhold ble fulgt for kontroll CaspaseTracker (DQVA) flyr. * Autofluorescent strukturer. Disse dataene er gjengitt med tillatelse fra Tang et al., Sci Rep 2015. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
Figur 4:. Basal caspase aktivitet i mange vev Høyere forstørrelse av DIC og fluorescens confocal bilder av GFP (siste) og RFP (nyere) CaspaseTracker (DQVD) aktivitet og Hoechst-farget kjerner i hjernen, Cardia, beskjære, midgut, Malpighian tubuli og egglederne fra figur 3a. * Autofluorescent strukturer. Disse dataene er gjengitt med tillatelse fra Tang et al., Sci Rep 2015. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Ikke-apoptotiske caspase aktivitet i nevroner av Drosophila optisk lapp. (a) DIC og confocal bilder med RFP (nyere) og GFP (siste) CaspaseTracker (DQVD) aktivitet og Hoechst-farget kjerner i hjernen. RFP + GFP dual-merkede celler (gule piler). (B) NucGFP colocalizes med immunfarging for pan neuronal atom ELAV protein i den optiske flik av CaspaseTracker (DQVD) fly hjernen. Nerveceller med samlokalisert signaler om NucGFP og ELAV vises (hvite piler). Merk, RFP-merket nevroner ikke er til stede i dette feltet. Disse dataene er gjengitt med tillatelse fra Tang et al., Sci Rep 2015. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi bygg- og driften av CaspaseTracker som letter påvisningen av utbredt basal caspase aktivitet i friskt vev. De kritiske trinn for å detektere ikke-apoptotiske kaspase-aktivitet in vivo, er: 1) generering av fluer med biosensoren transgenet, 2) verifisering av caspase-spesifikk rapportørfunksjon med hensiktsmessige kontroller, 3) å praktisere disseksjon teknikker for å observere alle interne systemer av voksen Drosophila organ, og 4) skille biosensor aktivitet fra autofluorescent gjenstander.
Den naturlige caspase-spaltbare polypeptid som tjener som caspase-spesifikk sensor ble modifisert for å unngå enhver kaspase-hemmende aktivitet av biosensoren. Ytterligere modifikasjoner ble gjort for å unngå for rask nedbrytning av Gal4 transkripsjonsfaktor, og innsetting av en epitop tag. Vi beskriver også hele kroppen organ disseksjon av fluer, farging, montering og konfokal mikroskopi av fly vevs å oppdage ikke-apoptotisk caspase aktivitet.
Mens CaspaseTracker er ideell for å påvise celler som overlever med lave nivåer av kaspase-aktivitet, er det ikke en reporter av sanntids-enzymaktivitet, som flere timer er nødvendig for å slå på biosensor. Vi har imidlertid ikke bestemt minimum tid til deteksjon, som sannsynligvis er mye kortere enn nødvendig for programmene som er beskrevet her. I motsetning til CaspaseTracker, er det vesentlig begrensning av andre kaspase biosensorer deres manglende evne til å påvise lave nivåer av kaspase-aktivitet, som de er utviklet primært for å studere celledød. Kaspase-aktivitet forsterkes etter en celledød stimulus, forårsaket massiv celle riving i mindre enn 30 min. 49 Det er derfor påvisning av kaspase-aktivering ofte antatt å være en markør for celledød bestemt. 50,51 Imidlertid montering bevis indikerer at kaspasene ha ikke-apoptotiske, selv ikke-nedbrytende funksjoner i friske celler. 7-21 The presuSpesialisering med lave nivåer av romlig og midlertidig begrenset enzymatisk aktivitet av caspases som utfører sine dag-jobbene er sannsynlig under deteksjons av tilgjengelige teknologier. Dette problemet er overvunnet av CaspaseTracker, noe som trolig krever noen caspase cleavage hendelser for å generere robuste signaler, og krever ikke pågående caspase enzymatisk aktivitet til permanent merke disse cellene in vivo.
Bevisene presenteres indikerer at CaspaseTracker er spesifikk for caspases, selv om vi ikke kan utelukke at andre uidentifiserte Asp-spesifikke proteaser kan aktivere CaspaseTracker. Men flyr fôring med en cocktail av caspase-hemmer peptider blokker CaspaseTracker aktivitet (upublisert). Vi understreker også viktigheten av å unngå biosensorer som selv hemmer caspases, og viktigheten av kontroll biosensorer og ikke-transgene fluer for å unngå feilaktige konklusjoner på grunn av autofluorescence iboende til insekt skjellaget, intern fett depositter, inntatt mat eller andre confoundere.
En annen utfordring er å skille pro-død og ikke-død funksjoner av kaspaser. Pro-død og ikke-døds funksjoner kan være knyttet evolusjonært i den hensikt å overgangen celler mellom en normal fysiologisk tilstand til en hensiktsmessig tidsbestemt død, for eksempel utvidelse av immunceller for å bekjempe infeksjoner og påfølgende eliminering av disse cellene for å forebygge kreft. Vi kan derfor ikke eliminere muligheten for at noen av de observerte basal kaspase-aktivitet i indre organer er i stedet et forsøk på å fremme celledød, tilsynelatende i overensstemmelse med de beregnede titalls milliarder celle dødsfall forekommer daglig i menneskekroppen. 52 imidlertid sunne morfologi av celler som uttrykker biosensor sterkt indikerer at CaspaseTracker er i stand til å oppdage caspase aktivitet beregnet for normal dag-jobber av kaspaser.
Caspases er foreslått å ha ikke-døden roller som cellenspredning. Dette er i overensstemmelse med tidligere forsøk på å generere pattedyrcellelinjer som stabilt uttrykker virale proteiner som binder og direkte hemmer cellulære kaspaser (f.eks CrmA). Mens hundrevis av cellekolonier oppsto under legemiddelvalg med den tomme kontroll vektor, uventet null kolonier dannet i parallelle kulturer transfektert med vektoren uttrykker kaspaseinhibitorer (upubliserte). Dermed caspases sannsynlig har omfattende funksjoner i normale celler som nå underappreciated. Dette er videre støttet av funn som basal biosensor aktivitet i CaspaseTracker fly er oppdaget i mange celletyper i de fleste organsystemer, inkludert nevroner, i normale, friske fluer. Sunn caspase aktivitet i nevroner kan demontere synaptiske avslutninger å fremme normal hjernefunksjon ved å spalte de samme underlag som under apoptose, eller deres dag-jobbfunksjoner kan være helt forskjellig fra apoptose-lignende aktiviteter. Mens lav versus høy enzymatiske nivåer av aktivecaspases kan være en avgjørende forskjell mellom dag-jobber og celledød, er det få Knockin muterte dyr med spesifikke caspase-uncleavable underlag som støtter denne muligheten. 17,53 Imidlertid indikerer siste fremskritt at caspase-8 hemmer necroptosis muligens ved å spalte RIPK, 54 synaptiske depresjon og AMPA-reseptor endocytose kan reguleres ved caspase spalting av Gap43, 55 og mikroRNA behandling kan reguleres ved caspase spaltning av dicer. 14,15,56
Det er mange flere anvendelser av denne biosensor. For å avgjøre om caspases aktiveres på bestemte tider eller i bestemte vev, uttrykk for biosensor kan lett reguleres midlertidig (for eksempel ved hjelp av Gal80ts) og i bestemte celletyper (f.eks lukte-spesifikke GAL4 drivere). Bruke Gal80ts å undertrykke biosensor uttrykk inntil veksten av voksen flyr fortsatt resultert i utbredt biosensor aktivitet, noe som indikerer at caspases kan aktiveres ved voksne stadier (figur 6c og d). 35 Ved å erstatte DIAP1 fragment med andre caspase underlag, andre programmer kan omfatte biosensorer spesifikke for ulike caspases og for å påvise spalting av spesifikke substrater. Den CaspaseTracker biosensor vil forbedre vår forståelse av rollen til ikke-apoptotiske caspase aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Polan Santos og Darren Obbard for Drosophila illustrasjoner i fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena for bruk av JHMRI insectary. Dette arbeidet ble støttet av Life Science Research Foundation fellesskap (HLT), Universitetet Grants Committee of Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), og NIH gir NS096677, NS037402 og NS083373 (JMH). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow av Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
References
- Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
- Hay, B. A., Guo, M.
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M.
- Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
- Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
- Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
- Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
- Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
- Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
- Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
- Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
- Li, Z., Sheng, M.
- Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
- Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
- Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
- Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
- Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
- To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
- Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
- Suzanne, M., Steller, H.
- Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
- Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
- Wong, L. C., Schedl, P.
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
- Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
- Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
- Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
- Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
- Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
- Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
- Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
- Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
- Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
- Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
- Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
- Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).
