Summary
Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.
Introduction
Las caspasas son proteasas de cisteína que median la muerte celular por apoptosis mediante la escisión de muchas proteínas intracelulares después de residuos de aspartato clave. Por ejemplo, caspasas iniciadoras activan las caspasas efectoras, nucleasas de ADN derepress, componentes del citoesqueleto escinden y alteran la composición de lípidos de las membranas celulares para desmantelar rápidamente las células y estimular su reconocimiento y la inmersión por las células que disponen de los cadáveres célula vecina. 1-4 Se estima que miles de millones de células mueren por día en el cuerpo humano, y la apoptosis es un mecanismo importante de la muerte de células tumorales inducida por la quimioterapia. 5 un conjunto diferente de las caspasas puede causar la muerte celular por procesos no apoptóticas distintas para estimular la inmunidad innata. 6 por lo tanto, mayoría de las investigaciones sobre las caspasas se ha centrado en sus funciones a favor de la muerte.
Curiosamente, las primeras pruebas en el campo reveló que los mismos caspasas responsables de promover la muerte de las células también tienen no la muerte funciones. Estudios pioneros han demostrado que las caspasas están implicadas en diversas funciones celulares en las células sanas, incluyendo la regulación de la proliferación celular y la migración durante la embriogénesis. 7-9 se requieren caspasas para la individualización spermatid en Drosophila 10,11, para el bloqueo de una vía de la muerte celular necroptotic alternativa en ratones 12,13, y para el procesamiento de microARN en C. . elegans 14,15 En quizás los más longevos células, las neuronas, las caspasas y otra maquinaria apoptótica están implicados en la regulación de la actividad neuronal mediante la poda de terminaciones sinápticas, un proceso que se cree que es esencial para el fortalecimiento de otras sinapsis para el aprendizaje y la memoria 16-. 18 es posible que las caspasas facilitar la poda sináptica por un tipo de mini-apoptosis de las proyecciones neuronales diminutas sin muerte de células enteras. 19 sin embargo, las caspasas pueden tener funciones alternativas no relacionadas con eventos de apoptosis similares. 20,21 papel Duals en la vida y la muerte no son exclusivos de las caspasas; BCL-2 y proteínas de la familia del citocromo c tienen papeles en la energética celular en las células sanas, pero también son parte de la ruta apoptótica núcleo que se activa por muchos tipos de estrés celular. 22-25 Aunque no está comprobado, parece lógico que la evolución ha vinculado día -Jobs hasta la muerte, puestos de trabajo en las mismas moléculas para asegurar la eliminación oportuna de las células no aptas o no deseables.
En la actualidad, los mecanismos moleculares de la actividad de caspasa no apoptótico no se entienden, y el grado de actividad de la caspasa no apoptótico durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos también no se conoce. Un reto importante es la dificultad de distinguir día-trabajos desde death-puestos de trabajo de las caspasas. En contraste con la apoptosis y pyroptosis, cuando la actividad de caspasa se amplifica por una cascada proteolítica, se espera que los trabajos diurnos de las caspasas se produzca a niveles mucho más bajos de actividad enzimática, probablemente por debajo de la detección por muchos tecn disponiblesgías.
Antes del trabajo presentado aquí, otros desarrollaron una variedad de biosensores de caspasa para diferentes propósitos. Los biosensores de SCAT (por ejemplo, ECFP-DEVD-Venus) detectar rápidamente la actividad de caspasa en tiempo real en células cultivadas y tejidos animales utilizando FRET. 26,27 Tras la escisión de la caspasa, la fracción GFP dirigido al núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sufre relocalización subcelular dentro de minutos cuando su membrana de sujeción plasma es escindido por las caspasas. 28 del mismo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocaliza desde el citosol al núcleo tras la escisión de la caspasa. 29,30 Más recientemente, el cromóforo en iCasper fue diseñado inteligentemente a emitir fluorescencia cuando se escinde por caspasas, lo que permite la detección de la actividad de biosensor en tiempo real en las neuronas de embriones de Drosophila, pero principalmente en asociación con la muerte celular de desarrollo. muerte 31 dependiente de caspasa de las neuronas olfativas durante el envejecimiento estaba demonstclasificado por inmuno-detección de la forma de la caspasa-escindido de biosensores CPV (por ejemplo, mCD8-PARP-Venus). 32,33 Es importante destacar que, se detectó la forma activada de la caspasa-3 en ausencia de muerte celular por inmunotinción sensible en espinas de neuronas cultivadas, y en el soma usando la fluorescencia dependiente de caspasa del colorante indicador CellEvent nuclear, pero se encontraron dificultades debido a la foto-toxicidad, aunque la muerte celular se retrasa hasta después de la eliminación columna vertebral. 19 por lo tanto, se necesitan nuevos biosensores caspasas para detectar y realizar un seguimiento de las células con actividad de caspasa basal in vivo.
Para superar estas dificultades, hemos generado un nuevo biosensor de color caspasa doble, designado CaspaseTracker. Esta estrategia combina una versión modificada del biosensor Apoliner Drosophila caspasa-sensible 28 con el sistema FRT recombinasa Drosophila G-TRACE 34 para etiquetar y rastrear células en vivo de forma permanente. <sup> 35 El sistema G-TRACE activado-Gal4 permite que los niveles muy bajos de caspasas para activar CaspaseTracker, lo que resulta en la expresión de RFP en el citoplasma y la expresión de GFP dirigido al núcleo permanente en cualquier célula que nunca ha experimentado la actividad de caspasa. 35 Este sistema puede etiquetar las células durante toda la vida en animales enteros utilizando Drosophila melanogaster, un sistema modelo tratable y ampliamente utilizado para el estudio de las caspasas y la muerte celular. 36-38
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Protocol
1. Preparación de las moscas CaspaseTracker
- Para preparar CaspaseTracker (DQVD) vuela de experimentos, realice esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Stop> GFP-nls), mediante la transferencia de 7-10 hembra virgen (o macho) las moscas que lleva el sustrato de la caspasa-biosensor mCD8 DIAP1-Gal4 impulsada por el promotor de ubiquitina 35 junto con el mismo número de hombres (o mujeres) moscas G-TRACE, que tienen el segundo cromosoma equilibrador CyO para evitar la letalidad de la combinación homocigótica del G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, y Ubi> Stop> GFP-nls) 34. Lugar vuela en un vial de alimentos frescos con pasta de levadura fresca como fuente de proteínas.
- Incubar los archivos a 18 ° C durante 5 a 7 días (máximo 2 semanas) y luego retire el padre vuela desde el vial para evitar el hacinamiento con la nueva progenie, y la creación de nuevos viales de cría.
- Continuar la incubación a 18 ° C hasta que la progenie vuela eclose. Seleccione la no CyO [no-cURLy ala] progenie del genotipo correcto de CaspaseTracker, que son transgénicos para los elementos CaspaseTracker y G-35 TRACE.
- Al mismo tiempo, generar control parental W118 moscas no transgénicas y la caspasa-insensibles (DQVA) vuela en paralelo para verificar RFP CaspaseTracker específica y la fluorescencia de GFP.
- Realizar el genotipado por PCR para confirmar los archivos con CaspaseTracker utilizando los cebadores: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producir un producto de 3897 pb. Para la genotipificación los loci G-Trace, utilice los siguientes cebadores para GFP (474 pb), 5'-GAC CAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GAG GCC GAT AGT C; para la solicitud de propuestas (258 pb), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG AAG GTG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC GTC CAG CTT GGA CAC GTA GTA GTA GC; y para Flpase (655 pb), 5'-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-CCG TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C. Para la genotipificación de Gal4 en el vector pUWR (554 pb), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC TCG CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.
2. Preparación del tejido, tinción y montaje
- Para las disecciones de moscas, evitar que los tejidos disecados se peguen a las puntas de pipeta de plástico y tubos de centrífuga, puntas de la capa y tubos con albúmina de suero bovino al 1% (BSA) disueltos en agua.
- Dissect vuela sobre un cojín de silicona con fórceps.
- Para evitar daños en la punta de pinzas sobre una superficie dura cuando se realiza la disección del tejido, realice la disección en una superficie de silicio. Para la fabricación de placas de disección de silicona, fundir el silicio en el kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lista de Materiales). Después de fundir la silicona, añadir de 3 a 4 ml a una placa de cultivo tisular de diámetro 60 mm. platos de silicio pueden ser reutilizados.
- Anestesiar a una mosca con CO 2, y la transfiere a una placa de silicona con 1 ml de PBS frío. Introducir el CO 2 a un vial que contiene la marcha usando una pistola de aire, y luego transferir la mosca t anestesiadasOA cojín que tiene un suministro de CO2.
- Use un par de pinzas para sujetar la cabeza de la mosca, y un segundo par de pinzas para tirar del tórax en la dirección opuesta para desconectar la cabeza mosca del cuerpo que cubre sin dañar la conexión entre la cabeza y el intestino anterior.
- Use 2 pares de pinzas para quitar las alas y las patas del tórax.
- Use un par de pinzas para sostener el tórax, y otro par de pinzas para tirar del abdomen para separarlo del tórax de nuevo sin dañar la conexión entre el intestino anterior y del intestino medio.
- Diseccionar los órganos internos, incluyendo cerebro, intestino, tubos de Malpighi y los ovarios como se ha demostrado anteriormente. 39-41
- Retire todas las piezas de la cutícula y los cuerpos grasos con unas pinzas, ya que estos tejidos producen fuertes autofluorescencia. La paciencia y la práctica se requieren para preparar un sistema de órgano completo, como se muestra.
- Transferir los tejidos disecados a 1,5 mL tubos de centrífuga, y fijar tejidos wiTH 0,5 ml de paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) a TA durante 20 a 30 minutos con rotación en la oscuridad para evitar RFP blanqueo y GFP en los tejidos. Evitar la fijación prolongada que puede comprometer los resultados de tinción posteriores.
- Retire el paraformaldehído por pipeteo suave y lavar 3 veces con 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) a TA.
- Permeabilizar los tejidos con 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante la noche con agitación suave. incubaciones cortas pueden causar permeabilización y el compromiso de tinción resultados incompletos.
- Si es necesario para reducir la tinción de fondo, considere la incubación de los tejidos en 0,5 ml de PBST con 1% de BSA, en lugar de PBS.
- Lavar los tejidos 3 veces con 0,5 ml de PBST.
- Para la tinción de los núcleos y la actina filamentosa (F-actina), aplicar 0,5 ml de PBST con 10 mg / ml de Hoechst 33342 tinte nuclear azul y 0,3 M Alexa Fluor mancha 633 faloidina F-actina y se incuba de forma simultánea con los tejidos durante 1 h a TA wITH rotación suave en la oscuridad. Evitar las manchas prolongado ya que esto aumentará el fondo.
- Para la inmunotinción, incubar fija y permeabilizadas tejidos con 0,1% Triton X-100 en 0,5 ml de PBS durante la noche a 4 ° C, tinción con dilución 1: 100 de anticuerpo anti-ELAV o con dilución 1: 200 de anti-caspasa-3 durante la noche a 4 ° C (300 l). Siga por el correspondiente anticuerpo secundario diluido 1: 100 y se incuba durante 1-3 h a TA. Ver Lista de Materiales para obtener información anticuerpo específico.
- Lavar los tejidos 3 veces, cada una durante 5 minutos en 0,5 ml de PBST con rotación suave.
- Con una pipeta, retire todo el PBST, y luego añadir 200 l anti-blanqueador de un medio de montaje (ver materiales) para cubrir completamente los tejidos durante 1-3 horas a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la noche. tejidos óptimas que han absorbido plenamente el agente de montaje se hundirá hasta el fondo del tubo.
- Pre-limpiar el portaobjetos de vidrio con agua o etanol al 70% y transferir los tejidos con el agente de montaje a los glass de diapositivas.
- Con cuidado, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre los tejidos. Aplique vaselina en el portaobjetos de vidrio y la hoja de la cubierta para evitar la destrucción del tejido por compresión excesiva. Eliminar los agentes de montaje adicional con papel de seda.
- Sellar la hoja de la cubierta mediante la aplicación de esmalte de uñas a lo largo de los bordes de la hoja de la cubierta para evitar la fuga de agentes de montaje de los tejidos.
3. Microscopía Confocal
- Utilizar un microscopio de epi-fluorescencia confocal invertido. Sin embargo, microscopios arriba-derecha también se pueden utilizar. Para tejidos de imagen utilizando suelo de baldosas, mantener estable a temperatura ambiente para evitar la deriva de enfoque y el desplazamiento de plano xy debido a la expansión y contracción térmica de los componentes. sistemas de control ambiental y sistemas de compensación de deriva enfoque ayudan a evitar este problema debido a la pérdida de termo-equilibrio del sistema de microscopio.
- Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. Tome algunas imágenes de prueba usando baja resolución (125 x 125 píxeles) de unad determinar el número adecuado de azulejos necesarios para cubrir toda la región de interés (ROI).
- Establecer el sistema de barrido microscopio para capturar imágenes con una resolución de escaneo tales como 500 x 500 píxeles. Seleccione el objetivo tales como 20X NA 0,8 o un 1,4 NA objetivo 63X Plan-Apocromático para el análisis de tejidos a través de cubreobjetos de vidrio, de manera que cada una de las imágenes (azulejos) se solapa en un 20% en todos los lados.
- Establecer la secuencia de imágenes de largo al más corto longitudes de onda de excitación, como la luz de longitud de onda larga provoca menor de foto-blanqueo. La secuencia del más largo al más corto de longitud de onda de excitación es de: (i) 633 nm para faloidina F-actina y para el anticuerpo a caspasas activadas, (ii) 561 nm para RFP, (iii) 488 nm para GFP, y (iv) 405 nm para Hoechst tinción nuclear.
- Durante estas pruebas, minimizar la exposición de las células a excitación láser fluorescente durante el proceso de obtención de imágenes para evitar la foto-blanqueo mediante la reducción de la intensidad del láser para obtener imágenes de alta calidad de los tejidos.
- Despues de que yomagos se recogen, fusionar las imágenes utilizando el software de microscopio.
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Representative Results
Existen dos componentes clave que permiten CaspaseTracker para detectar la actividad de la caspasa en las células sanas normales (Figura 1A). El primero de ellos es un polipéptido de la caspasa-escindible 146 amino ácido el modelo de la caspasa biosensor Apoliner (Figura 1b). 28 Este polipéptido se deriva de DIAP1 (inhibidor de Drosophila de apoptosis) que contiene un único sitio de la caspasa natural que se escinde durante la apoptosis normalmente por la caspasa Drice. 42,43 Drice es equivalente a la caspasa-3 en mamíferos y escinde los sustratos celulares más conocidos. 4,32 característico de las caspasas, DIAP1 y su polipéptido derivado se escinden luego de un ácido aspártico específica, Asp20 encuentran dentro del reconocimiento de caspasa secuencia de 17 DQVD-20, y la mutación del residuo Asp20 obligatoria a Ala (DQVA) suprime la escisión. 42,43 similares a Apoliner 28 de este fragmento es DIAP1 anchoroja en el citoplasma a la membrana plasmática a través del ratón CD8 (aminoácidos de cadena alfa 1-220), una herramienta que se utiliza comúnmente en Drosophila. El anclaje a la membrana CD8 evita cualquier carga tethered que lleva una secuencia de translocación nuclear (nucGFP en el caso de Apoliner) a partir de la translocación al núcleo en ausencia de la actividad de caspasa. 28 El segundo componente clave de CaspaseTracker es el sistema de G-TRACE Drosophila en la que el factor de transcripción de levadura Gal4 induce la expresión de la recombinasa flipasa (FLP) (y al mismo tiempo induce RFP). 34 flipasa escinde un codón de parada que conduce a la expresión permanente de nucGFP. Para hacer G-TRACE sensible a la actividad de caspasa, se combina con el sistema de Apoliner por inmovilización de Gal4, que se requiere para activar G-TRACE, al fragmento de DIAP1 caspasa-escindible anclada a la membrana plasmática de Apoliner (Figura 1a). 35
Hicimos modif adicionalmedica- al componente Apoliner de CaspaseTracker para mejorar la utilidad. Lo más importante, es fundamental que el propio biosensor caspasa no inhibe las caspasas, lo que podría preservar las células que de otro modo morirían. Aunque el transgén Apoliner no causó fenotipos obvios en Drosophila 28, como sería de esperar de un inhibidor de caspasa potente, incluso la preservación ocasional de células sería contrario al propósito de la identificación de las células normales con la actividad de caspasa. Sin embargo, el fragmento de DIAP1 en Apoliner contiene un motivo (135-DICG-138) que se muestra posteriormente para inhibir potentemente Drice, el mismo caspasa que escinde DIAP1 en Asp20. 43 El mecanismo de la inhibición de la caspasa fue revelado por una estructura cristalina en la que DIAP1 Asp135 se une en el sitio activo Drice como un mimético de sustrato de caspasa (pero no se escinde). 43 el análisis bioquímico ha demostrado que una sustitución de Arg en Asp135 suprime la función Drice-inhibidor. 43 por lo tanto, CaspaseTracker fue diseñado con la misma mutación D135R para evitar la inhibición de caspasas (Figura 1b). 35 De manera similar a Apoliner, la de origen natural secuencia DIAP1 Asn-Asn en la de novo N-terminal después de la escisión en Asp20 se cambió a Gly-Val en CaspaseTracker para evitar la degradación de Gal4 por la regla del N-terminal tras la escisión de la caspasa (Figura 1b). 28 Además, fusionamos un myc-tag a la C-terminal de Gal4 para la detección inmediata de expresión CaspaseTracker. 35 por necesidad, propia RFP Apoliner y casetes nucGFP se han eliminado para que sea compatible con el G-TRACE, que también contiene RFP y nucGFP. 28,35
Debido a Gal4 lleva su propia señal de localización nuclear y potentemente activa la transcripción a través de su elemento de respuesta de ADN diana (UAS) cuando se fusionan con otros transgenes en Drosophila, presumiblemente sólo unas pocas moléculas de rel Gal4aliviado por caspasas citoplasmáticos son suficientes para activar la expresión RFP dentro de unas pocas horas (estimado ≤12 h). Dado que la actividad requiere biosensor de novo transcripción y traducción de RFP, no informa de la actividad enzimática en tiempo real. Aunque CaspaseTracker RFP se degradará significativamente probable dentro de un día después de la actividad de la caspasa cesa, nucGFP será expresado por el promotor de ubiquitina para la vida de la célula y su progenie.
Para demostrar en primer lugar que CaspaseTracker es sensible a la activación de caspasas en vivo, moscas adultas biosensores CaspaseTracker fueron expuestos a los teléfonos estímulos que inducen la muerte. El ovario de Drosophila es un modelo de muerte celular bien estudiado como cámaras de huevos se someten a la muerte celular programada cuando están estresados animales, probablemente un mecanismo de igualar las condiciones ambientales a la progenie de producción. 37,44,45 Para inducir la muerte celular, las moscas fueron biosensores-shock frío 1 h a -7° C (congelación de los animales), y los ovarios fueron disecados de animales vivos al día siguiente (Figura 2a). En contraste con las moscas biosensores no tratados, las cámaras de huevos después de choque de frío eran notablemente más pequeño y exhibieron robusto rojo (reciente) y la actividad biosensor verde (permanente), la verificación de la activación biosensor después de un estímulo muerte celular (Figura 2b, Merge). Se detectó actividad Biosensor en los núcleos de ambas células germinales (células de la enfermera y ovocitos) y células somáticas (células del folículo) en cámaras de huevos, pero sólo en las moscas tratadas. 35 Morfologías característica de la apoptosis también se observaron fácilmente en cámaras de huevos biosensores-positivo incluyendo fragmentación nuclear, la condensación del ADN y la degradación (pérdida de tinción de azul). actividad Biosensor se puede detectar en las mismas células con tanto la condensación nuclear (Hoechst) y caspasas activas (inmunotinción), pero la más intensa tinción para caspasas activas se produjo en áreas en las que tanto el ADN nuclear y CASPASbiosensores señales electrónicas fueron disminuidos o degradados (Figura 2b). 46,47 Los mecanismos de muerte celular que se produce después de frío-choque no están bien caracterizadas, y otros mecanismos de muerte pueden estar en juego. Sin embargo, se obtuvieron resultados similares después de la inanición de aminoácidos, que se sabe que causa apoptosis. 35
Para determinar si CaspaseTracker podría detectar la actividad de la caspasa no apoptótico, los órganos internos del saludables 1 día de edad moscas fueron meticulosamente disecados mediante la eliminación de la cutícula autofluorescent y grasa. Los tejidos de una sola mosca representante se fijaron, montada, se tiñeron con Hoechst para marcar los núcleos y con faloidina mancha de F-actina para detectar las células musculares. En contraste con cámaras de huevos sanos, que carecen de activación biosensor, las células musculares F-actina-manchado entre cámaras de huevos tenían biosensor-actividad tanto rojo y verde (Figura 3A, inserción). Sin embargo, es posible que el bioseNsor también etiqueta otras células. Muchos otros tejidos y órganos del criados de manera óptima 1 día de edad moscas sanos mostraron prominente actividad caspasa biosensor presumiblemente refleja la función de la caspasa no apoptótico basal (Figura 3a). Células Biosensor-positivo aparecieron morfológicamente normal y se produjeron en patrones organizados en los tejidos sugiere que los subconjuntos específicos de células activan las caspasas, por ejemplo las rayas de células biosensores-positivo de envolver el intestino posterior (Figura 3A, inserción).
La mejor evidencia de que CaspaseTracker es un reportero específico de las caspasas es la falta de señal en las moscas que expresan el biosensor control, que es idéntica a CaspaseTracker excepción de una sola Asp a Ala mutación de aminoácidos en el sitio de escisión de la caspasa obligatoria, cambiando DQVD a DQVA ( Figura 1b y 3b). A excepción de una célula excepcionalmente raros (Figura 3b, flecha verde), la única señal de observed en las moscas de biosensores de control DQVA son estructuras autofluorescentes, como partes de la boca (Figura 3b) y de los alimentos ingeridos en el cultivo y en otros lugares (Figura 3b y 4), que también se observan en las moscas de los padres no transgénicas que carecen de la biosensor caspasa. 35 las células marcadas con CaspaseTracker se producen a intervalos regulares a lo largo de los túbulos (riñón) Malpighi y a menudo presentan tanto reciente (rojo) y pasado (verde) la activación de caspasas de forma simultánea, mientras que muchas células en el cerebro, lóbulos ópticos, cardias, recortar, intestino medio y oviducto son o rojas o verdes (Figuras 4 y 5a).
Para la evidencia de que las células de larga vida pueden sobrevivir a la actividad de caspasa, el lóbulo óptico se immunostained para la ELAV marcador pan-neuronal (embrionaria visión anormal letal). 48 Los núcleos de muchas neuronas fueron doblemente marcadas con GFP dirigido al núcleo de CaspaseTracker y ELAV, en consonancia con el CE de larga vidaLLS utilizando las caspasas para funciones no de muerte (Figura 5b). Además, si el biosensor se apaga durante 10 días (utilizando Gal80ts), las células de biosensores-positivos persisten durante la duración en el intestino (Figura 6a y b), el cerebro y en otros lugares (no mostrados). Uso de la caspasa CaspaseTracker biosensor, proporcionamos la primera visión general de la actividad de caspasa basal en animales enteros.
Figura 1: Sistema biosensor CaspaseTracker para la detección de la actividad de caspasa no apoptótica. (a) Los componentes del biosensor caspasa Drosophila. (b) La parte de la caspasa-escindible de sistema de biosensor CaspaseTracker se compone de un anclaje a la membrana plasmática (mCD8), un fragmento de DIAP1 contiene un sitio natural caspasa-escisión Asp20 fusionado a la transcripción Gal4 factor de 3x con una etiqueta-myc C-terminal y se expresa a través de la pro ubiquitinapromotor. caspasa división resulta en la translocación de Gal4 al núcleo para inducir el sistema G-TRACE. En un biosensor control, el residuo Asp20 requerida en el sitio de escisión de la caspasa ácido 4-amino (DQVD) se cambia a Ala (DQVA) para abolir la escisión de la caspasa. Transgénico CaspaseTracker moscas contienen 4 transgenes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: CaspaseTracker se activa por caspasas durante la muerte celular. (a) Esquema de Drosophila ovario y diagrama de flujo para la muerte celular inducida por choque frío. Drosophila imagen (por Darren Obbard) Drosophila ovario dibujo (por Polan Santos) y se usan con permiso. (b) cámaras óvulo del ovario de 6- día femenina CaspaseTracker moscas alimentadas w ITH alimentos mosca normales durante 6 días (sin tratar) o 1 día después de choque térmico (-7 ° C, 1 h, seguido de 25 ° C durante 24 h) para inducir la activación de caspasas en cámaras de huevos. Ampliaciones de ovario tratadas con frío (marcos de abajo a la derecha) muestran tres cámaras de huevos en un desarrollo ovariola cadena (centrada aproximadamente en vertical) con evidencia de condensación nuclear (cámara de huevos superior), la fragmentación nuclear (cámara de huevos medio y inserciones) y la degradación (huevo menor cámara) basado en Hoechst tinción de ADN (azul). caspasas activos (anti-caspasa-3, magenta) se detectan en las cámaras de huevo medio e inferior. actividad RFP y GFP biosensor (rojo, verde y amarillo flechas) se producen en las células con la condensación del ADN nuclear, que a menudo se tiñen de forma difusa con caspasas activas (inserciones). Las flechas blancas marcan núcleos que carecen tanto de actividad biosensor y immunostain caspasa activa. * Señales de autofluorescencia. Estos datos se reproducen con permiso de Tang et al., 2015 Sci Rep.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La evidencia de la actividad de caspasa fisiológica generalizada. (a) Imagen confocal de CaspaseTracker RFP (DQVD) y nucGFP Combinadas de una sola mosca recién eclosed elevada a 18 ° C, diseccionado y teñidas con H33342 para los núcleos y faloidina para F-actina (rosa), y fotografiado con DIC. Faloidina sólo se muestra en el recuadro de cámaras de huevos. (B) Las mismas condiciones de procedimiento y de imagen fueron seguidos durante CaspaseTracker de control (DQVA) vuela. * Estructuras autofluorescent. Estos datos se reproducen con permiso de Tang et al., Sci Rep 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Figura 4:. La actividad de caspasa basal en muchos tejidos mayores aumentos de la DIC y fluorescencia confocal de imágenes de GFP (pasado) y RFP actividad (reciente) CaspaseTracker (DQVD) y los núcleos Hoechst-manchadas en el cerebro, el cardias, cultivos, intestino medio, túbulos de Malpighi y oviductos de la Figura 3a. * Estructuras autofluorescent. Estos datos se reproducen con permiso de Tang et al., Sci Rep 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: actividad de la caspasa no apoptótica en neuronas de la Drosophila lóbulo óptico. (a) y DIC confocal de imágenes con la actividad GFP (pasado) CaspaseTracker (DQVD) RFP (reciente) y los núcleos teñidos y-Hoechst en el cerebro. RFP + GFP células doblemente marcadas (flechas amarillas). (B) NucGFP colocalizes con inmunotinción para la proteína nuclear neuronal ELAV cacerola en el lóbulo óptico de CaspaseTracker (DQVD) cerebro de la mosca. Las neuronas con señales co-localizada de NucGFP y ELAV se muestran (flechas blancas). Tenga en cuenta, las neuronas RFP marcado no están presentes en este campo en particular. Estos datos se reproducen con permiso de Tang et al., Sci Rep 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A continuación se ilustra la construcción y el funcionamiento interno de CaspaseTracker que facilitan la detección de la actividad de caspasa basal generalizada en los tejidos sanos. Los pasos críticos para la detección de la actividad de caspasa no apoptótica in vivo son: 1) la generación de moscas con el transgén biosensor, 2) verificar la función reportero-caspasa específico con controles apropiados, 3) la práctica de técnicas de disección para observar todos los sistemas de órganos internos de adulto Drosophila, y 4) la actividad biosensor distintiva de los artefactos autofluorescent.
El polipéptido de la caspasa-escindible natural que sirve como el sensor de la caspasa-específica fue modificado para evitar cualquier actividad de la caspasa-inhibitoria por el biosensor. Se hicieron modificaciones adicionales para evitar la rápida degradación del factor de transcripción Gal4, y la inserción de un epítopo etiqueta. También describimos todo el cuerpo de órganos disección de moscas, inmunotinción, el montaje y la microscopía confocal de tejido moscas para detectar la actividad de la caspasa no apoptótica.
Mientras CaspaseTracker es ideal para la detección de células que sobreviven con bajos niveles de actividad de la caspasa, no es un reportero de la actividad enzimática en tiempo real, ya que se requieren varias horas para encender el biosensor. Sin embargo, no hemos determinado el tiempo mínimo de detección, que es probablemente mucho más corto que el necesario para las aplicaciones descritas aquí. En contraste con CaspaseTracker, la principal limitación de otros biosensores caspasa es su incapacidad para detectar niveles bajos de actividad caspasa, ya que están diseñados principalmente para estudiar la muerte celular. La actividad de caspasa se amplifica después de un estímulo muerte de las células, causando la demolición masiva de células en menos de 30 min. 49 Por lo tanto, la detección de la activación de caspasas a menudo se supone que es un marcador de cierta muerte celular. 50,51 Sin embargo, la creciente evidencia indica que las caspasas tienen no apoptótico, incluso funciones no degradativas en las células sanas. 7-21 El presulos bajos niveles de actividad enzimática de medicina espacial y temporalmente limitado de caspasas que llevan a cabo sus trabajos diurnos son probablemente por debajo de la detección por las tecnologías disponibles. Este problema se supera por CaspaseTracker, que probablemente requiere pocos eventos de escisión de caspasa para generar señales robustas, y no requiere de la actividad de caspasa enzimática en curso para etiquetar de forma permanente estas células in vivo.
La evidencia presentada indica que CaspaseTracker es específico para las caspasas, aunque no podemos excluir la posibilidad de que otras proteasas Asp-específicos identificados podrían activar CaspaseTracker. Sin embargo, la alimentación vuela con un cóctel de inhibidores de la caspasa-péptidos bloquea la actividad CaspaseTracker (no publicado). También hacemos hincapié en la importancia de evitar que los biosensores mismos inhiben las caspasas, y la importancia de los biosensores de control y las moscas no transgénicas para evitar conclusiones erróneas debido a la autofluorescencia inherente a la cutícula del insecto, depo grasa internase sienta, se ingieren alimentos u otros factores de confusión.
Otro reto es distinguir las funciones pro-muerte y no a la muerte de las caspasas. funciones pro-muerte y no de muerte podrían estar relacionados evolutivamente con el fin de la transición células entre un estado fisiológico normal a una muerte apropiadamente temporizada, por ejemplo, la expansión de las células inmunes para combatir la infección y la posterior eliminación de estas células para prevenir el cáncer. Por lo tanto, no podemos eliminar la posibilidad de que parte de la actividad de la caspasa basal observado en los órganos internos es en cambio un intento de promover la muerte celular, aparentemente coherente con las decenas estimados de miles de millones de muertes celulares que ocurren diariamente en el cuerpo humano. 52 Sin embargo, la morfología saludable de células que expresan el biosensor indica fuertemente que CaspaseTracker es capaz de detectar la actividad de caspasa destinado a día-trabajos normales de caspasas.
Las caspasas se sugiere tener papeles no de muerte, tales como célulasproliferación. Esto es consistente con los intentos anteriores para generar líneas celulares de mamífero que expresan de manera estable las proteínas virales que se unen y directamente inhibir caspasas celulares (por ejemplo, crmA). Mientras cientos de colonias de células surgieron durante la selección del fármaco con el vector de control vacío, inesperadamente cero colonias formadas en cultivos paralelos transfectadas con los inhibidores de caspasa vector que expresa (no publicados). Por lo tanto, las caspasas es probable que tengan funciones generalizadas en las células normales que se valoran suficientemente la actualidad. Esto se ve apoyado por el hallazgo de que la actividad basal del biosensor en la mosca CaspaseTracker se detecta en muchos tipos de células en la mayoría de los sistemas de órganos, incluyendo las neuronas, en las moscas normales y sanos. la actividad de caspasa saludable en las neuronas puede desmantelar las terminaciones sinápticas para promover la función normal del cerebro mediante la escisión de los mismos sustratos como durante la apoptosis, o de sus funciones en el trabajo diario puede ser completamente distinta de las actividades de la apoptosis similares. Mientras baja en comparación con los altos niveles enzimáticos de activoscaspasas pueden ser una distinción fundamental entre el día-puestos de trabajo y la muerte celular, hay pocos knockin animales mutantes con sustratos específicos de caspasa-uncleavable que apoyan esta posibilidad. 17,53 Sin embargo, el progreso reciente indica que la caspasa-8 inhibe necroptosis posiblemente mediante la escisión RIPK, 54 la depresión sináptica y la endocitosis del receptor AMPA pueden ser reguladas por la caspasa división de GAP43, 55 y procesamiento de microARN puede estar regulada por la caspasa división de Dicer. 14,15,56
Hay muchas aplicaciones adicionales de este biosensor. Para determinar si las caspasas se activan en momentos específicos o en tejidos específicos, la expresión del biosensor se puede regular fácilmente temporalmente (por ejemplo, usando Gal80ts) y en tipos de células específicas (por ejemplo, conductores de olfato-específicos Gal4). Usando Gal80ts para suprimir la expresión biosensor hasta la emergencia del adulto todavía vuela como resultado de la actividad biosensor generalizada, lo que indica que CASPASES pueden ser activadas en las fases adultas (figura 6C y D). 35 Al sustituir el fragmento de DIAP1 con otros sustratos de caspasa, otras aplicaciones pueden incluir biosensores específicos para diferentes caspasas y para detectar la escisión de sustratos específicos. El biosensor CaspaseTracker mejorará nuestra comprensión del papel de las actividades de caspasa no apoptóticas.
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Acknowledgments
Agradecemos a Polan Santos y Darren Obbard para las ilustraciones de Drosophila en la Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para el uso del insectario JHMRI. Este trabajo fue apoyado por la beca de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida (HLT), Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AOE / B-07/99 (MCF), y el NIH subvenciones NS096677, NS037402 y NS083373 (JMH). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci miembro de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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