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Biology

In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

Um gesunde Zellen in ganzen Tieren erkennen , die geringe Mengen an Caspase - Aktivität enthalten, die hochempfindliche Biosensor bezeichnet CaspaseTracker wurde für Drosophila erzeugt. Caspase-abhängigen Biosensor-Aktivität wird in langlebigen gesunden Zellen in den inneren Organen der erwachsenen Tiere aufgezogen unter optimierten Bedingungen in Abwesenheit von Tod Stimuli detektiert.

Introduction

Caspasen sind Cystein-Proteasen, die durch Spaltung von vielen intrazellulären Proteinen nach Schlüssel Aspartatresten apoptotischen Zelltod vermitteln. Zum Beispiel aktivieren Initiator Caspasen Effektorcaspasen, dereprimieren DNA Nukleasen spalten Zytoskelett - Komponenten und die Lipidzusammensetzung von Zellmembranen verändern , um schnell Zellen abzubauen und ihre Anerkennung und engulfment stimulieren durch benachbarte Zellen , die der Zelle Leichen zu entsorgen. 1-4 Es wird geschätzt, dass Milliarden Zellen pro Tag in den menschlichen Körper sterben und Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus der chemotherapieinduzierter Tumorzelltodes. 5 Eine andere Gruppe von Caspasen Zelltod durch verschiedene nicht-apoptotischen Prozesse führen können angeborene Immunität zu stimulieren. 6 Deshalb die meisten Untersuchungen auf Caspasen hat auf ihrer pro-Tod Funktionen konzentriert.

Interessanterweise ergab erste Hinweise auf dem Gebiet, dass die gleichen Caspasen verantwortlich für die Förderung der Zelltod auch nicht den Tod f habenSalbungen. Pionierstudien haben gezeigt , daß Caspasen in diverse zelluläre Funktionen in gesunden Zellen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Zellproliferation und Migration während der Embryogenese. 7-9 Caspasen erforderlich sind für spermatid Individualisierung in Drosophila 10,11, für eine alternative necroptotic Zelltod blockiert bei Mäusen 12,13 und für microRNA Verarbeitung in C. elegans. 14,15 In vielleicht die langlebigste Zellen, Neuronen, Caspasen und andere apoptotische Maschinen sind an der Regulation neuronaler Aktivität verwickelt durch synaptischen Endungen Beschneidung, ein Prozess vermutlich wesentlich sein , andere Synapsen für Lernen und Gedächtnis zu stärken. 16- 18 Es ist möglich , dass Caspasen synaptic pruning durch eine Art Mini-Apoptose von neuronalen winzigen Vorsprünge ohne ganze Zelltod erleichtern. 19 jedoch Caspasen alternative Funktionen haben in keinem Zusammenhang mit der Apoptose-ähnlichen Ereignissen. 20,21 Dual - Rolles im Leben und Tod sind nicht einzigartig für Caspasen; BCL-2 - Familie Proteine und Cytochrom c haben Rollen in zelluläre Energetik in gesunden Zellen , sondern sind auch Teil des Kerns apoptotischen Weg, der von vielen Arten von Zellstress aktiviert. 22-25 Obwohl nicht bewiesen ist , scheint es logisch , dass die Evolution Tag verknüpft hat -Jobs zu Tode-Arbeitsplätze innerhalb der gleichen Moleküle rechtzeitige Beseitigung von untauglich oder unerwünschte Zellen zu gewährleisten.

Gegenwärtig sind die molekularen Mechanismen von nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität nicht verstanden, und das Ausmaß der nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität während der embryonalen Entwicklung und in erwachsenen Geweben ist auch nicht bekannt. Eine große Herausforderung ist die Schwierigkeit, Tag-Jobs aus dem Tod Jobs von Caspasen zu unterscheiden. Im Gegensatz zur Apoptose und pyroptosis, als Caspase-Aktivität durch eine proteolytische Kaskade verstärkt wird, werden die Tag-Jobs von Caspasen erwartet bei wesentlich geringeren Mengen an enzymatischer Aktivität auftreten, wahrscheinlich unter der Nachweis von vielen verfügbaren technologien.

Vor der vorliegenden Arbeit entwickelt andere eine Vielzahl von Caspase Biosensoren für verschiedene Zwecke. Die SCAT Biosensoren (zB ECFP-DEVD-Venus) schnell in Echtzeit Caspase - Aktivität in kultivierten Zellen und tierischen Geweben erkennen FRET verwenden. 26,27 Nach Caspase - Spaltung, die Kern gezielte GFP - Einheit von Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) erfährt subzellulärer Relokalisation innerhalb von Minuten , wenn seine Plasmamembran-Haltegurt durch Caspasen gespalten wird. 28 in ähnlicher Weise ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relokalisiert aus dem Cytosol in den Zellkern auf Caspase - Spaltung. 29,30 Mehr Vor kurzem wurde das Chromophor in iCasper geschickt entwickelt , wenn sie von Caspasen gespalten zu fluoreszieren, ermöglicht Detektion von Biosensor - Aktivität in Echtzeit in Neuronen von Drosophila - Embryonen, sondern in erster Linie in Verbindung mit Entwicklungs Zelltod. 31 Caspase-abhängigen Tod von olfaktorischen Neuronen während alterte demonstbewertet durch Immundetektion der Caspase-gespaltenen Form von CPV Biosensoren (beispielsweise mCD8-PARP-Venus). 32,33 Wichtig ist , dass die aktivierte Form von Caspase-3 in Abwesenheit von Zelltod durch sensitive immunostain in Stacheln detektierter kultivierten Neuronen und im Soma die Caspase-abhängigen Fluoreszenz des Kern CellEvent Reporterfarbstoff verwenden, aber Schwierigkeiten aufgrund Phototoxizität angetroffen wurden, obwohl Zelltod erst nach spine Eliminierung verzögert. 19 Somit werden neue Caspase Biosensoren erforderlich nachzuweisen und verfolgen Zellen mit basalen Caspase - Aktivität in vivo.

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir einen einen neuen Dual Farbe Caspase Biosensor bezeichnet CaspaseTracker. Diese Strategie kombiniert eine modifizierte Version der Drosophila Caspase-sensitive Apoliner Biosensors 28 mit dem Drosophila G-TRACE FRT - Rekombinase - System 34 permanent zu markieren und die Zellen in vivo zu verfolgen. <sup> 35 Die Gal4-aktivierte G-TRACE - System ermöglicht ein sehr niedriges Niveau von Caspasen CaspaseTracker zu aktivieren, was zu RFP Expression im Zytoplasma und permanent kern gezielte GFP - Expression in einer beliebigen Zelle , die je Caspase - Aktivität erfahren hat. 35 Dieses System kann etikettieren Zellen im Laufe des Lebens in ganzen Tieren unter Verwendung von Drosophila melanogaster, ein lenkbar und am weitesten verbreiteten Modellsystem für die Untersuchung von Caspasen und Zelltod. 36-38

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Protocol

1. Herstellung von CaspaseTracker Flies

  1. Zur Vorbereitung CaspaseTracker (DQVD) fliegt für Experimente, führen Sie diese Quer: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP; Ubi> Stop> GFP-nls), durch die Übertragung von 7-10 jungfräulichen Weibchen (oder männlich) die Caspase Biosensor Substrat mCD8-DIAP1-Gal4 durch den Ubiquitin - Promotor 35 zusammen mit der gleichen Anzahl von männlichen (bzw. weiblichen) angetrieben G-TRACE Fliegen, die das zweite Chromosom cyo Ausgleicher haben zu vermeiden Letalität der homozygoten Kombination von G- Fliegen Trage TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP und Ubi> Stop> GFP-nls) 34. Platz fliegt in einem frischen Lebensmittel Fläschchen mit frischer Hefe-Paste als Proteinquelle.
  2. Inkubieren Dateien bei 18 ° C für 5 bis 7 Tage (maximal 2 Wochen) und entfernen Sie dann die Eltern aus dem Fläschchen fliegt mit neuen Nachkommen zu vermeiden, Überfüllung und neue Zucht Fläschchen einzurichten.
  3. Weiter Inkubation bei 18 ° C bis Nachkommen eclose fliegt. Wählen Sie das nicht Cyo [non-curly Flügel] Nachkommen des korrekten Genotyp von CaspaseTracker, die 35 für CaspaseTracker und G-TRACE Elemente transgen sind.
  4. Gleichzeitig erzeugen Kontrolle der Eltern nicht-transgenen W118 Fliegen und Caspase-unempfindlich (DQVA) fliegt parallel spezifischen CaspaseTracker RFP und GFP-Fluoreszenz zu überprüfen.
  5. Führen Sie die PCR-Genotypisierung, um zu bestätigen Dateien mit CaspaseTracker unter Verwendung der Primer: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, ein 3897-bp-Produkt zu erzeugen. Für die Genotypisierung die G-Trace-Loci, verwenden Sie die folgenden Primer, die für GFP (474 ​​bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; für RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; und für Flpase (655 bp), 5 'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Für die Genotypisierung Gal4 im pUWR Vektor (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Gewebepräparation, Färbung und Montage

  1. Für Fliegen Dissektionen verhindern seziert Gewebe zu Kunststoff-Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen kleben, beschichten Spitzen und Rohre mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Wasser gelöst.
  2. Dissect fliegt auf einem Silikonkissen mit einer Pinzette.
    1. Schäden an den Spitzen der Zange auf eine harte Oberfläche zu vermeiden, wenn das Gewebe Dissektion durchführen, führen Präparation auf einer Siliziumoberfläche. Für Silikon-Dissektion Platten machen, schmelzen das Silizium im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialliste). Nach dem Silikon schmelzen, fügen Sie 3 bis 4 ml zu einem Durchmesser von 60 mm Gewebekulturschale. Silicon Geschirr kann wiederverwendet werden.
    2. Anesthetize eine Fliege mit CO 2, und übertragen sie mit 1 ml kaltem PBS auf eine Silikonplatte. Führen Sie das CO 2 in ein Fläschchen , die Fliege mit einem Blasrohr enthält, und dann übertragen Sie die narkotisiert fly toa Pad , die eine CO 2 Versorgung.
    3. Verwenden Sie eine Zange, die Fliege Kopf, und ein zweites Paar von Zange zu halten, den Brustkorb in die entgegengesetzte Richtung zu ziehen, die Fliege Kopf vom Körper zu trennen abdeckt, ohne dass die Verbindung zwischen dem Kopf und foregut zu beschädigen.
    4. Verwenden Sie 2 Paar Zangen, die Flügel und Beine aus dem Thorax zu entfernen.
    5. Verwenden Sie ein Paar Zangen des Thorax zu halten, und ein anderes Paar von Zange den Bauch ziehen Sie sie vom Thorax wieder zu trennen, ohne die Verbindung zwischen dem Vorderdarm und Mitteldarm zu beschädigen.
    6. Präparieren inneren Organe einschließlich Gehirn, Darm, Malpighischen Gefäße und der Ovarien , wie zuvor unter Beweis gestellt. 39-41
    7. Entfernen Sie alle Stücke der Kutikula und die Fettkörper mit einer Pinzette, da diese Gewebe starke Autofluoreszenz produzieren. Geduld und Übung erforderlich, um eine vollständige Organsystem vorzubereiten, wie dargestellt.
  3. Übertragen Sie seziert Gewebe zu 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und reparieren Gewebe with 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) bei RT für 20 bis 30 min mit der Drehung in der Dunkelheit Bleich RFP und GFP in den Geweben zu vermeiden. Vermeiden Sie längere Fixierung, die nachfolgende Färbung Ergebnisse beeinträchtigen können.
  4. Entfernen des Paraformaldehyds durch vorsichtiges Pipettieren und wäscht 3 mal mit 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) bei RT.
  5. Permeabilisieren die Gewebe mit 0,5 ml PBST bei 4 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln. Kürzere Inkubationszeiten unvollständige Permeabilisierung und des Kompromisses Färbung Ergebnisse verursachen.
    1. Wenn es notwendig ist, die Hintergrundfärbung zu reduzieren, sollten Gewebe in 0,5 ml PBST mit 1% BSA anstelle von PBS inkubiert.
  6. Waschen Sie die Gewebe 3-mal mit 0,5 ml PBST.
  7. Beflecken Kerne und filamentöse Aktin (F-Aktin), gelten 0,5 ml PBST mit 10 ug / ml Hoechst 33342 blau Kern Farbstoff und 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-Actin-Färbung und Inkubation gleichzeitig mit Geweben für 1 h bei RT with sanfte Rotation im Dunkeln. Vermeiden Sie längere Färbung, da dies den Hintergrund zu erhöhen.
    1. Für die Immunfärbung, inkubieren fixiert und permeabilisiert Gewebe mit 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml PBS über Nacht bei 4 ° C, Fleck mit 1: 100-Verdünnung von anti-ELAV Antikörper oder mit 1: 200-Verdünnung von Anti-Caspase-3 Nacht bei 4 ° C (300 ul). Folgen durch den entsprechenden Sekundärantikörpers, verdünnt 1: 100 und Inkubation für 1 bis 3 h bei RT. Siehe Materialliste für spezifische Antikörper Informationen.
  8. Waschen Sie die Tücher 3 mal für jeweils 5 min in 0,5 ml PBST mit sanfter Drehung.
  9. Mit einer Pipette, entfernen Sie alle PBST und dann 200 ul hinzufügen Antibleichbefestigungsmittel (siehe Materialien) vollständig Gewebe für 1-3 h bei RT abdecken oder 4 ° über Nacht C. Optimale Gewebe, die die Montagemittel vollständig aufgenommen haben, wird auf dem Boden des Röhrchens sinken.
  10. Vorreinigung der Glasobjektträger mit Wasser oder 70% Ethanol und das Gewebe mit Befestigungsmittel auf die Glas übertragenRutsche.
  11. Vorsichtig ein Deckglas über dem Gewebe. Vaseline auf dem Glasobjektträger und Deckglas zu vermeiden, um das Gewebe durch Überkompression zu zerstören. Entfernen Sie die zusätzlichen Befestigungsmittel mit Seidenpapier.
  12. Verschließen Sie die Deckglas durch Anwendung Nagellack alle entlang der Ränder des Deckglases zu vermeiden Leckage von Mitteln aus den Geweben Montage.

3. konfokale Mikroskopie

  1. Verwenden eines invertierten konfokalen Epi-Fluoreszenzmikroskop. Jedoch oben rechts Mikroskope verwendet werden kann. Um das Bild zu Geweben tiling Verwendung aufrechtzuerhalten stabile Raumtemperaturdrift des Fokus und der Verschiebung der xy-Ebene zu vermeiden, aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion der Komponenten. Umweltkontrollsysteme und Fokusdrift-Kompensationssysteme helfen, dieses Problem durch den Verlust von thermo-Gleichgewicht des Mikroskopsystems zu vermeiden.
  2. Platzieren Sie den Schieber auf der Bühne des Mikroskops. Nehmen Sie ein paar Testbilder mit geringer Auflösung (125 x 125 Pixel) eind die entsprechende Anzahl der Kacheln bestimmen erforderlich, um die gesamte Region von Interesse (ROI) zu decken.
  3. Stellen Sie das Mikroskop Scansystem zum Erfassen von Bildern mit Scan-Auflösung wie 500 x 500 Pixel. Wählen Sie das Ziel wie ein 20X NA 0,8 oder einem 63X NA 1.4 Plan-Apochromat Ziel für Gewebe durch Glasplättchen zu analysieren, so dass jedes der Bilder (Fliesen) überlappt um 20% auf allen Seiten.
  4. Stellen Sie die Bildsequenz von längste bis Anregungswellenlängen kürzesten, als die langwellige Licht niedriger Photobleaching verursacht. Die Sequenz von längste Anregungswellenlänge kürzeste: (i) 633 nm für Phalloidin F-Actin und auf Antikörper gegen aktivierte Caspasen, (ii) 561 nm für RFP, (iii) 488 nm für GFP und (iv) 405 nm Hoechst Kernfärbung.
  5. Während der Bilderzeugung minimieren Exposition von Zellen mit Fluoreszenzlaseranregung während des Prozesses Bildgebung Photobleaching zu vermeiden, indem die Laserintensität zu reduzieren qualitativ hochwertige Bilder von Gewebe zu erhalten.
  6. Nachdem ichMagiern werden gesammelt, die Bilder mit Mikroskop-Software zusammenführen.

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Representative Results

Es gibt zwei wichtige Komponenten , die CaspaseTracker erlauben, Caspase - Aktivität in normalen , gesunden Zellen (Abbildung 1a) zu erkennen. Die erste davon ist ein 146 Aminosäure-Caspase-spaltbare Polypeptid nach der Caspase modellierten Biosensor Apoliner (Abbildung 1b). 28 Das Polypeptid aus DIAP1 (Drosophila Inhibitor der Apoptose) abgeleitet ist , eine einzelne natürlich vorkommenden Caspase - Stelle enthält , die typischerweise während der Apoptose gespalten wird , durch die Caspase drice. 42,43 drice entspricht Caspase-3 bei Säugetieren und spaltet den meisten bekannten zellulären Substraten. 4,32 Charakteristisch für Caspasen, DIAP1 und die davon abgeleiteten Polypeptid nach einer bestimmten Asparaginsäure gespalten werden, Asp20 innerhalb der Caspase Anerkennung gelegen Sequenz 17-DQVD-20, und die Mutation des obligatorischen Asp20 Rückstand zu Ala (DQVA) abschafft Spaltung. 42,43 Ähnlich Apoliner, 28 dieses DIAP1 Fragment ist anchoim Zytoplasma rot an der Plasmamembran über Maus CD8 (alpha - Kette die Aminosäuren 1-220), einem häufig verwendeten Werkzeug in Drosophila. Die CD8 - Membrananker verhindert jede tethered Ladung eine Kern - Translokationssequenz (nucGFP im Falle Apoliner) aus Translokation in den Zellkern in Abwesenheit von Caspase - Aktivität trägt. 28 die zweite Schlüsselkomponente der CaspaseTracker der Drosophila G-TRACE - System ist , in dem die Hefe Transkriptionsfaktors Gal4 induziert die Expression von Flippase (FLP) Rekombinase (und gleichzeitig induziert RFP). 34 Flippase ein Stoppcodon führt zu einer dauerhaften Expression nucGFP exzidiert. Bis G-TRACE Reaktion auf Caspase - Aktivität zu machen, wurde es mit dem Apoliner System kombiniert durch Anbinden Gal4, die erforderlich ist , G-TRACE, zur Plasmamembran verankerter Caspase-spaltbare DIAP1 Fragment Apoliner (Abbildung 1a) zu aktivieren. 35

Wir haben zusätzliche modifikationen zur Apoliner Komponente von CaspaseTracker Nutzen zu verbessern. Am wichtigsten ist, ist es entscheidend, daß der Caspase Biosensor selbst nicht Caspasen hemmen, möglicherweise Zellen bewahren, die sonst sterben würden. Obwohl die Apoliner Transgen nicht offensichtlich Phänotypen in Drosophila 28, verursacht hat als eines potenten Caspase - Inhibitor zu erwarten wäre, auch die gelegentliche Konservierung von Zellen würde dem Zweck der Identifizierung normalen Zellen mit Caspase - Aktivität zu besiegen. Jedoch enthält das DIAP1 Fragment in Apoliner ein Motiv (135-DICG-138) , die anschließend potently gezeigt wurde drice hemmen, die gleiche Caspase spaltet DIAP1 bei Asp20. 43 Der Mechanismus der Caspase - Hemmung durch eine Kristallstruktur offenbart wurde , in dem DIAP1 Asp135 in die drice aktiven Stelle als Caspase Substrat nachahmen gebunden (aber gespalten wird nicht). 43 Biochemische Analysen zeigten , dass eine Arg - Substitution an Asp135 drice-hemmende Funktion abschafft. 43 DarumCaspaseTracker, wurde mit der gleichen D135R - Mutation entwickelt , um Caspase Hemmung (Abbildung 1b). 35 Ähnlich Apoliner, die natürlich vorkommende DIAP1 Asn-Asn - Sequenz an der de novo N-Terminus nach der Spaltung bei Asp20 vermeiden wurde Gly-Val in CaspaseTracker geändert zu verhindern den Abbau von Gal4 durch den N- Terminus -Regel auf Caspase - Spaltung (Abbildung 1b). 28 Darüber hinaus haben wir eigene RFP ein myc-Tag an den C-Terminus von Gal4 für schnellen Nachweis von CaspaseTracker Ausdruck. 35 notwendigerweise Apoliner des fusionierten und nucGFP Kassetten gelöscht wurden , um es mit G-TRACE kompatibel zu machen, die auch RFP und nucGFP enthält. 28,35

Weil Gal4 trägt seine eigenen Kernsignallokalisierung und aktiviert potent Transkription über ihre Ziel - DNA - Response - Element (UAS) , wenn auf andere Transgene in Drosophila fusioniert, vermutlich nur wenige Moleküle von Gal4 relerleichtert durch cytoplasmatische Caspasen sind ausreichend auf RFP Expression innerhalb weniger Stunden (geschätzt ≤12 h) zu drehen. Da Biosensor Aktivität erfordert de novo Transkription und Translation von RFP, ist es nicht in Echtzeit die enzymatische Aktivität berichten. Obwohl CaspaseTracker RFP deutlich wahrscheinlich innerhalb eines Tages abgebaut wird nach einer Caspase-Aktivität aufhört, wird nucGFP für die Lebensdauer der Zelle und ihrer Nachkommenschaft durch den Ubiquitin-Promotor exprimiert werden.

Um zunächst zeigen , dass CaspaseTracker Caspase - Aktivierung in vivo reagiert, erwachsenen CaspaseTracker Biosensor Fliegen wurden ausgesetzt Tod auslösenden Stimuli zu Zelle. Das Drosophila Ovar ist ein gut untersuchtes Zelltod Modell als Eikammern den programmierten Zelltod unterziehen , wenn die Tiere gestresst sind, einen vermuteten Wirkmechanismus Umweltbedingungen der Anpassung der Produktion auf Nachkommenschaft. 37,44,45 Zelltod zu induzieren, Biosensor Fliegen waren kalt schockiert 1 h bei -7° C (Einfrieren der Tiere) und Ovarien von lebenden Tieren am nächsten Tag (Abbildung 2a) präpariert wurden. Im Gegensatz zu unbehandelten Biosensor Fliegen, waren die Eikammern nach Kälteschock deutlich kleiner und zeigten robust rot (letzten) und Grün (permanent) Biosensor Aktivität, Biosensor - Aktivierung nach einem Zelltod Stimulus Verifizieren (2b, fusionieren). Biosensor - Aktivität wurde in den Kernen der beiden Keimzellen (Nährzellen und Eizellen) und somatische Zellen (Follikelzellen) in Eikammern, aber nur in den behandelten Fliegen festgestellt. 35 Morphologien Charakteristik der Apoptose wurden leicht beobachtet in Biosensor-positive Eikammern einschließlich Kernfragmentierung, DNA-Kondensation und Abbau (Verlust der Bläue). Biosensor-Aktivität kann in den gleichen Zellen mit beiden Kernkondensation (Hoechst) und aktive Caspasen (immunostain), aber die intensivste Färbung für aktive Caspasen nachgewiesen werden aufgetreten in Bereichen, in denen sowohl nukleare DNA und caspase - Biosensor - Signale wurden verringert oder abgebaut (Abbildung 2b). 46,47 Die Mechanismen Zelltod nach dem Kalt Schock auftreten , sind nicht gut charakterisiert, und andere Tod Mechanismen im Spiel sein kann. Jedoch wurden ähnliche Ergebnisse folgende Aminosäure Verhungern erhalten wird , von der bekannt ist , Apoptose zu verursachen. 35

Zu bestimmen, ob CaspaseTracker könnte nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität detektieren, die inneren Organe von gesunden 1 Tage alte Fliegen wurden durch Entfernen des autofluoreszierenden Kutikula und Fett sorgfältig seziert. Gewebe von einem einzigen Vertreter Fliege wurden fixiert, montiert, mit Hoechst gefärbten Zellkernen und mit Phalloidin-Färbung für F-Actin zu markieren Muskelzellen zu erkennen. Im Gegensatz zu gesunden Eikammern, die Biosensor - Aktivierung fehlt, hatten die F-Actin-gefärbten Muskelzellen zwischen Eikammern sowohl rote als auch grüne Biosensor-Aktivität (Abbildung 3a, Einschub). Es ist jedoch möglich, dass die biosensor Etiketten auch andere Zellen. Viele andere gesunde Gewebe und Organe optimal aufgezogen 1 Tage alten Fliegen zeigte prominente Caspase - Biosensor - Aktivität vermutlich basalen nicht apoptotischen Caspase - Funktion (Abbildung 3a) reflektiert. Biosensor-positiven Zellen erschienen morphologisch normalen und traten in organisierten Mustern in Geweben darauf hindeutet , dass bestimmte Untergruppen von Zellen Caspasen aktivieren, zum Beispiel Streifen von Biosensor-positiven Zellen Einwickeln der Enddarm (3a, Einschub).

Der beste Beweis, dass CaspaseTracker ein spezifischer Reporter von Caspasen ist, ist das Fehlen des Signals bei Fliegen des Steuer Biosensor exprimierenden, die CaspaseTracker Ausnahme einer einzelnen Asp zu Ala Aminosäuremutation an der obligatorischen Caspase-Spaltstelle identisch ist, ändert DQVD zu DQVA ( 1b und 3b). Mit Ausnahme einer außerordentlich seltenen Zelle (Abbildung 3b, grüner Pfeil), das einzige Signal observed in den DQVA Steuer Biosensor Fliegen sind autofluoreszenten Strukturen, wie Mundteile (3b) und aufgenommene Nahrung in der Ernte und an anderer Stelle (Abbildung 3b und 4), die in nicht-transgenen Eltern Fliegen auch beobachtet werden , dass die Caspase - Biosensor fehlt. 35 die CaspaseTracker markierten Zellen treten in regelmäßigen Abständen entlang der Malpighischen (Niere) Tubuli und weisen oft sowohl den letzten (rot) und letzten (grün) Caspase - Aktivierung gleichzeitig, während viele Zellen im Gehirn, optischen Loben, Cardia, Ernte, midgut und Eileiters sind entweder rot oder grün (4 und 5a).

Für Hinweise darauf , dass langlebige Zellen Caspase - Aktivität überleben können, wurde die Optik lobe immunhistochemisch für die pan-neuronalen Marker ELAV (embryonal letalen abnorme Vision). 48 Die Kerne vieler Neuronen wurden doppelt mit nuklear gezielte GFP aus CaspaseTracker und ELAV gekennzeichnet, im Einklang mit langlebigen cells mit Caspasen für Nicht-Tod - Funktionen (Abbildung 5b). Außerdem, wenn der Biosensor 10 Tage lang ausgeschaltet ist (mit Gal80ts), Biosensor-positive Zellen für die Dauer fortbestehen im Darm (Figur 6a und b), Gehirn und anderswo (nicht gezeigt). Mit Hilfe der Caspase-Biosensor CaspaseTracker bieten wir erstmals einen Überblick über die basale Caspase-Aktivität in ganzen Tieren.

Abbildung 1
Abbildung 1: CaspaseTracker Biosensor - System für nicht-apoptotische Caspase - Aktivität zu detektieren. (a) Komponenten des Drosophila Caspase Biosensor. (b) Die Caspase-spaltbare Teil CaspaseTracker Biosensor - System besteht aus einer Plasmamembrananker zusammengesetzt (mCD8), ein Fragment von DIAP1 eine natürliche Caspase-Spaltstelle Asp20 enthält , auf die Gal4 - Transkriptions verschmolzenen Faktor mit einem C-terminalen 3x-myc-Tag und über den Ubiquitin pro exprimiertMoter. Caspase-Spaltung resultiert in Translokation von Gal4 in den Kern des G-TRACE-System zu induzieren. In einem Kontroll Biosensor wird die erforderliche Asp20-Rest in der 4-Aminosäure Caspase-Spaltstelle (DQVD) geändert Ala (DQVA) Caspase-Spaltung zu beseitigen. Transgene CaspaseTracker Fliegen enthalten 4 Transgene. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: CaspaseTracker wird durch Caspasen während des Zelltods aktiviert. (a) Schematische Darstellung der Drosophila Ovar und Flussdiagramm für Kälteschock-induzierten Zelltod. Drosophila Ovar Zeichnung (von Polan Santos) und Drosophila Bild (von Darren Obbard) werden mit Genehmigung verwendet. (b) Eikammern aus dem Ovar von 6- Tag weibliche CaspaseTracker fliegt gefüttert w i-ten normalen Fliegen Lebensmittel für 6 Tage (unbehandelt) oder 1 Tag nach Kälteschock (-7 ° C, 1 h, gefolgt von 25 ° C für 24 h) Caspase-Aktivierung in Eikammern zu induzieren. Vergrößerungen von kalt behandelt Ovar (unten rechts Frames) in einer Entwicklung Ovariole Kette drei Eikammern zeigen mit dem Nachweis von Kernkondensation (oben Eikammer), Kernfragmentierung (mittlere Eikammer und -einsätze) und Abbau (untere Ei (etwa vertikal zentriert) Kammer) auf Basis von Hoechst DNA-Färbung (blau). Aktive Caspasen (anti-Caspase-3, Magenta) in den mittleren und unteren Eikammern erkannt. RFP und GFP-Biosensor-Aktivität (rot, grün und gelbe Pfeile) treten in Zellen mit Kern-DNA-Kondensation, die oft diffus mit aktiver Caspasen (Einschübe) färben. Weiße Pfeile markieren Kerne beide Biosensor Aktivität und aktive Caspase immunostain fehlt. * Autofluorescence Signale. Diese Daten werden mit Erlaubnis von Tang reproduziert et al., Science Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Der Nachweis für die weit verbreiteten physiologischen Caspase - Aktivität. (a) Zusammengeführt konfokales Bild von CaspaseTracker (DQVD) RFP und nucGFP aus einer einzigen neu geschlüpften Fliege auf 18 ° C erhöht, seziert und gefärbt mit H33342 für Kerne und Phalloidin für F-Actin (pink) und mit DIC abgebildet. Phalloidin ist nur für Eikammern im Einsatz gezeigt. (B) Die gleichen Verfahren und Abbildungsbedingungen wurden für die Kontrolle CaspaseTracker gefolgt (DQVA) fliegt. * Autofluoreszie- Strukturen. Diese Daten werden mit Erlaubnis von Tang et al reproduziert., Science Rep 2015 Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehendiese Figur.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Basal Caspase - Aktivität in vielen Geweben höheren Vergrößerungen von DIC und Fluoreszenz - konfokale Bilder von GFP (Vergangenheit) und RFP (letzten) CaspaseTracker (DQVD) Aktivität und Hoechst-gefärbte Kerne im Gehirn, Cardia, Ernte, midgut, Vasa Malpighi und Eileitern aus 3a. * Autofluoreszie- Strukturen. Diese Daten werden mit Genehmigung von Tang et al., Science Rep 2015 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Neuronen des Drosophila Optik Lappen. (a) DIC und konfokale Bilder mit RFP (letzten) und GFP (Vergangenheit) CaspaseTracker (DQVD) Aktivität und Hoechst-gefärbte Kerne im Gehirn. RFP + GFP doppelt markierte Zellen (gelbe Pfeile). (B) NucGFP kolokalisiert mit immunostain für pan neuronalen Kern ELAV Protein in der optischen Loben von CaspaseTracker (DQVD) Gehirn fliegen. Neuronen mit co-lokalisierten Signale NucGFP und ELAV gezeigt sind (weiße Pfeile). Beachten Sie, RFP-markierten Neuronen in diesem Bereich nicht vorhanden sind. Diese Daten werden mit Genehmigung von Tang et al., Science Rep 2015 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Hier zeigen wir die Konstruktion und Funktionsweise von CaspaseTracker, die Erkennung von weit verbreiteten basalen Caspase-Aktivität in gesunden Geweben erleichtern. Die kritischen Schritte zum Detektieren nicht-apoptotischen Caspase - Aktivität in vivo sind: 1) Fliegen mit dem Biosensor - Transgen zu erzeugen, 2) Caspase-spezifische Reporterfunktion mit geeigneten Kontrollen Verifizieren, 3) Praktizieren Techniken dissection alle inneren Organsysteme adulter Drosophila zu beobachten, und 4) Scheidungs ​​Biosensor Aktivität von autofluoreszenten Artefakte.

Die natürliche Caspase-spaltbare Polypeptid, das als Caspase-spezifischen Sensor dient wurde modifiziert durch den Biosensor jede Caspase-inhibitorische Aktivität zu vermeiden. Weitere Modifikationen wurden gemacht, einen schnellen Abbau des Gal4 Transkriptionsfaktors zu vermeiden und das Einführen eines Epitop-Tag. Wir beschreiben auch ganze Körperorgan Dissektion von Fliegen, Immunfärbung, Montage und konfokale Mikroskopie von Fliegengewebes zu detektieren nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität.

Während CaspaseTracker zum Erfassen Zellen ideal ist, die mit geringen Mengen von Caspase-Aktivität zu überleben, ist es nicht ein Reporter von Echtzeit-Enzymaktivität, wie mehrere Stunden auf dem Biosensor zu drehen erforderlich. Wir haben jedoch nicht die minimale Zeit der Detektion bestimmt, die viel kürzer als erforderlich für die hier beschriebenen Anwendungen wahrscheinlich ist. Im Gegensatz zu CaspaseTracker ist die Hauptbeschränkung anderer Caspase Biosensoren ihre Unfähigkeit, geringe Mengen an Caspase-Aktivität zu erfassen, da sie in erster Linie zu studieren Zelltod ausgelegt sind. Caspase - Aktivität wird nach einem Zelltod Stimulus verstärkt, was zu massiven Zell Abriss in weniger als 30 min. 49 Daher Detektion von Caspase - Aktivierung wird häufig angenommen , ein Marker für bestimmte Zell Tod. 50,51 Jedoch zeigt Beweise Befestigungs dass Caspasen haben nicht-apoptotische, auch nicht-abbauenden Funktionen in gesunden Zellen. 7-21 Die Presumed geringe Mengen an räumlich und zeitlich beschränkt enzymatische Aktivität von Caspasen, die ihren Tag Arbeitsplätze durchzuführen sind unterhalb der Nachweisgrenze von verfügbaren Technologien wahrscheinlich. Dieses Problem wird durch CaspaseTracker, überwinden , die wahrscheinlich einige Caspase Spaltungsereignisse erfordert robuste Signale zu erzeugen, und erfordert Aktivität nicht laufenden Caspase enzymatische permanent diese Zellen in vivo zu markieren.

Die vorgelegten Beweise gibt an, dass CaspaseTracker für Caspasen spezifisch ist, wenn wir nicht die Möglichkeit, dass andere, nicht identifizierte Asp-spezifische Proteasen CaspaseTracker aktivieren konnte ausgeschlossen werden. Allerdings Fütterung fliegt mit einem Cocktail von Caspase-Inhibitor-Peptide blockiert CaspaseTracker Aktivität (nicht veröffentlicht). Wir betonen auch die Bedeutung Biosensoren zu vermeiden, die sich Caspasen hemmen, und die Bedeutung der Kontrolle Biosensoren und Fliegen nicht-transgenen zum Insekt Kutikula, interne Fett Depo falsche Schlüsse aufgrund Autofluoreszenz inhärenten zu vermeidensitzt, Lebensmittel oder andere Störfaktoren eingenommen.

Eine weitere Herausforderung ist die Unterscheidung pro-Tod und nicht den Tod Funktionen von Caspasen. Pro-Tod und nicht-death Funktionen könnten die Expansion von Immunzellen evolutionär zum Zweck der Übergang Zellen zwischen einem normalen physiologischen Zustand zu einem in geeigneter Weise zeitlich Tod, beispielsweise verbunden werden, um Infektionen und anschließende Eliminierung dieser Zellen zu bekämpfen Krebs zu verhindern. Somit können wir die Möglichkeit nicht auszuschließen , dass einige der beobachteten basal Caspase - Aktivität in inneren Organen ist stattdessen ein Versuch Zelltod zu fördern, scheint im Einklang mit der geschätzten zig Milliarden Zelltods auftreten täglich in den menschlichen Körper. 52 jedoch die gesunde Morphologie von Zellen zeigt den Biosensor stark zum Ausdruck, dass CaspaseTracker Caspase-Aktivität der Nachweis für den normalen Tag-Jobs von Caspasen soll fähig ist.

Caspasen sind vorgeschlagen Nicht Tod Rollen wie Zelle zu haben,Proliferation. Dies ist mit früheren Versuchen konsistente Säugerzelllinien stabil virale Proteine exprimieren , zu erzeugen , die binden und hemmen direkt zellulären Caspasen (zB CrmA). Während Hunderte von Zellkolonien während der Medikamentenauswahl mit dem leeren Kontrollvektor entstand, unerwartet Null Kolonien in Parallelkulturen gebildet mit den Vektor-exprimierenden Caspase-Inhibitoren transfiziert (nicht veröffentlicht). Somit weisen Caspasen wahrscheinlich weit verbreitete Funktionen in normalen Zellen, die zur Zeit unterschätzt werden. Dies wird weiter gestützt durch die Erkenntnis, dass die basale Biosensor-Aktivität in der CaspaseTracker fly wird in vielen Zelltypen in den meisten Organsystemen nachgewiesen, einschließlich Neuronen, in normalen gesunden Fliegen. Gesunde Caspase-Aktivität in Neuronen können synaptischen Endungen zerlegen normale Funktion des Gehirns zu fördern, indem sie die gleichen Substrate wie die während der Apoptose zu spalten oder ihren Tag Job-Funktionen verschiedene völlig aus Apoptose-ähnliche Aktivitäten sein kann. Während Tief gegenüber hohen enzymatischen Konzentrationen von aktivemCaspasen kann ein entscheidender Unterschied zwischen Tag Jobs und Zelltod sein, gibt es nur wenige Knockin mutierten Tiere mit spezifischen Caspase-nichtspaltbare Substrate , die diese Möglichkeit unterstützen. 17,53 deutet jedoch darauf hin , dass die jüngsten Fortschritte Caspase-8 hemmt Nekroptose möglicherweise durch RIPK Spaltung, 54 synaptischen Depression und AMPA - Rezeptor - Endozytose durch Caspase - Spaltung von GAP43, 55 und mikroRNA Verarbeitung reguliert werden kann durch Caspase - Spaltung von Dicer reguliert werden. 14,15,56

Es gibt viele weitere Anwendungen dieses Biosensors. Zu bestimmen , ob Caspasen zu bestimmten Zeiten oder in spezifischen Geweben aktiviert sind, die Expression des Biosensors kann leicht zeitlich geregelt werden (zB unter Verwendung Gal80ts) und in spezifischen Zelltypen (beispielsweise Geruchsspezifische Gal4 - Treiber). Mit Gal80ts Biosensor Ausdruck zu unterdrücken, bis Entstehung von Erwachsenen noch in weit verbreiteten Biosensor Aktivität führte fliegt, was darauf hinweist, dass caspases kann auf adulte Stadien (Abbildung 6c und d) aktiviert werden. 35 das DIAP1 Fragment mit anderen Caspase - Substrate, andere Anwendungen Durch den Austausch können Biosensoren spezifisch für verschiedene Caspasen sind und für die Spaltung von spezifischen Substraten detektiert wird . Der CaspaseTracker Biosensor wird unser Verständnis der Rolle von nicht-apoptotischen Caspase-Aktivitäten zu verbessern.

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Acknowledgments

Wir danken Polan Santos und Darren Obbard für Drosophila Abbildungen in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena für die Verwendung des JHMRI Insektarium. Diese Arbeit wurde von der Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) unterstützt wurde, und NIH gewährt NS096677, NS037402 und NS083373 (JMH). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

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Molecular Biology Ausgabe 117 Caspase Biosensor, Apoptose nicht-apoptotische Gehirn Neuronen CaspaseTracker
<em>In</em> - <em>vivo</em> - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in <em>Drosophila</em>
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Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

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