Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В Vivo биосенсоров Треки Non-апоптотической активности каспазы в Drosophila

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

Для того, чтобы обнаружить здоровые клетки в целых животных , которые содержат низкие уровни активности каспазы, высокочувствительный биосенсор назначенный CaspaseTracker был сгенерирован для дрозофилы. Каспазы-зависимой биосенсора обнаруживается активность в долгоживущих здоровых клетках во внутренних органах взрослых животных, выращенных в оптимальных условиях при отсутствии стимулов смерти.

Introduction

Каспазы цистеиновых протеаз, которые опосредуют апоптотической гибели клеток путем скола много внутриклеточных белков после ключевых остатков аспарагиновой. Например, инициатор каспазы активировать эффекторные каспазы, derepress нуклеазы ДНК, понадеясь компоненты цитоскелета и изменяет липидный состав клеточных мембран , чтобы быстро ликвидировать клетки и стимулировать их признание и полном охвате соседними клетками, располагающие клеточных трупов. 1-4 Подсчитано что миллиарды клеток умирают в день в человеческом теле, и апоптоз является важным механизмом вызванной химиотерапией смерти опухолевых клеток. 5 Другой набор каспаз может привести к гибели клеток с помощью различных не-апоптотических процессов для стимуляции врожденного иммунитета. 6 Таким образом, большинство исследований каспаз была сосредоточена на своих функций про-смерти.

Интересно, что первые данные в поле показали, что одни и те же каспазы несут ответственность за развитие клеточной смерти также необрывающегося пУНКЦИИ. Пионерские исследования показали , что каспазы участвуют в различных клеточных функций в здоровых клетках, в том числе регуляции клеточной пролиферации и миграции в процессе эмбриогенеза. 7-9 Каспазы требуется для индивидуализации сперматид в дрозофилы 10,11, для блокирования альтернативного necroptotic гибель клеток пути у мышей 12,13, а также для обработки микроРНК в C. Элеганс. 14,15 В , возможно , самой долгоживущей клетки, нейроны, каспазы и другие апоптическая машины участвуют в регуляции активности нейронов по обрезке синаптических окончаний, процесс считается необходимым для укрепления других синапсов для обучения и памяти 16 - ти. 18 возможно , что каспазы облегчают синаптическую обрезку по типу мини-апоптозу крошечных нейрональных проекций без всей клеточной гибели. 19 Тем не менее, каспазы могут иметь альтернативные функции , не связанные с апоптозом , как события. 20,21 Двойная рольs в жизни и смерти не являются уникальными для каспаз; BCL-2 белки семейства и цитохром с играют свою роль в клеточных энергетики в здоровых клетках , но также являются частью основного пути апоптоза , который активируется многими типами клеток стресса. 22-25 Хотя это и не доказано, что кажется логичным , что эволюция связана день -jobs до смерти-рабочих мест в рамках одних и тех же молекул, чтобы обеспечить своевременное устранение непригодных или нежелательных клеток.

В настоящее время молекулярные механизмы, не апоптотической активности каспазы не поняты, и степень не-апоптотической активности каспазы во время эмбрионального развития и во взрослых тканях также не известно. Главной проблемой является трудность в различении однодневные рабочие места от смертельных заданий каспаз. В отличие от апоптоза и pyroptosis, когда активность каспазы усиливается протеолитического каскада, днем ​​рабочих мест каспаз, как ожидается, произойдет при гораздо более низких уровней ферментативной активности, вероятно, ниже обнаружения с помощью множества доступных техничтодологии.

До начала работы, представленной здесь, другие разработали различные каспазы биосенсоры для различных целей. Копро биосенсоры (например, ECFP-DEVD-Венера) быстро обнаруживать активность каспазы в режиме реального времени в культивируемых клетках и тканях животных с использованием FRET. 26,27 При каспазы расщепления, то GFP фрагмент Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- ядерных целевых nucGFP) подвергается внутриклеточную релокализация в течение нескольких минут , когда его плазмалеммы-фал расщепляется каспазы. 28 Точно так же, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes из цитоплазмы в ядро при каспазы расщепления. 29,30 Подробнее в последнее время хромофора в iCasper был искусно разработан флуоресцировать при расщеплении с помощью каспаз, что позволяет обнаруживать биосенсора активности в реальном масштабе времени в нейронах Drosophila эмбрионов, но в первую очередь в связи с развитием клеточной гибели. 31 каспазы-зависимую гибель обонятельных нейронов при старении было demonstоценили иммунологического обнаружения каспазы-расщепляется форме КНД биосенсоров (например, mCD8-ППА-Венера). 32,33 Важно отметить, что активированная форма каспазы-3 был обнаружен в отсутствие гибели клеток путем чувствительной immunostain в корешках культивированные нейроны, а в соме с использованием каспазы-зависимой флуоресценции CellEvent репортерного красителя ядерной, но трудности возникли из - за фото-токсичности, хотя гибель клеток было отложено до после устранения позвоночника. 19 Таким образом, новые каспаз биосенсоры необходимы для обнаружения и отслеживать клетки с базальной активности каспазы в естественных условиях.

Для преодоления этих трудностей, мы получили новый двойной цвет каспазы биосенсора, обозначенный CaspaseTracker. Эта стратегия сочетает в себе модифицированную версию Drosophila каспазы-чувствительных Apoliner биосенсора 28 с Drosophila G-волоконные системы FRT рекомбинантному 34 постоянно маркировать и отслеживать клетки в естественных условиях. <SUP> 35 Gal4-активированная система G-TRACE позволяет очень низкие уровни каспазы активировать CaspaseTracker, что приводит к экспрессии RFP в цитоплазме и постоянное выражение ядерной мишенью GFP в любой клетке, которая когда- либо испытывали активность каспазы. 35 Эта система может маркировать клетки на протяжении жизни в целом животных с использованием дрозофилы, послушным и широко используется модель системы для изучения каспаз и гибели клеток. 36-38

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление CaspaseTracker Мух

  1. Для подготовки CaspaseTracker (DQVD) мух для экспериментов, выполнить этот крест: UBI-CaspaseTracker х G-TRACE (UAS-RFP; UAS-ФЛП; Ubi> Стоп> GFP-NLS), путем передачи 7-10 девственница (или мужчина) мух , несущий каспазы биосенсора субстрат mCD8-DIAP1-GAL4 движимый убиквитин промотора 35 вместе с таким же числом мужчин (или женщин) G-волоконные мух, которые имеют вторую хромосому CYO балансир , чтобы избежать летальности гомозиготных комбинации G- СЛЕД (UAS-RFP, UAS-ФЛП и Ubi> Стоп> GFP-NLS) 34. Место летит в свежей ампуле пищи со свежей дрожжевой пасты в качестве источника белка.
  2. Выдержите файлы при 18 ° С в течение от 5 до 7 дней (максимум 2 недели), а затем удалить родительский мух из флакона, чтобы избежать переполненности с новым потомством, и создать новые селекционные ампул.
  3. Продолжить инкубации при 18 ° С до тех пор, пока потомство мух Эклоз. Выберите не-CYO [не-сURLy крыло] Потомство правильного генотипа CaspaseTracker, которые являются трансгенными для CaspaseTracker и G-35 микроэлементами.
  4. Одновременно, генерировать родительский контроль не трансгенными w118 мух и каспазы-нечувствительной (DQVA) летит параллельно, чтобы проверить конкретную CaspaseTracker RFP и флуоресценции GFP.
  5. Выполните ПЦР генотипирование, чтобы подтвердить файлы с CaspaseTracker с использованием праймеров: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, производя продукт в 3897 пар оснований. Для генотипирования G-Trace локусов, используют следующие праймеров дл GFP (474 ​​п.н.), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3'-CTT CAG CTC GTA GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; для RFP (258 п.н.), 5'-GGC ТГК TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG СТТ GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; и Flpase (655 б.п.), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-НКУ TAC ТАА CGC TCT TTG TTG TCT CTG TCA С. Для генотипирования Gal4 в векторе pUWR (554 п.н.), 5'-GAA GCA CAC СТТ CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Подготовка ткани, Окрашивание и Монтажное

  1. Для мух вскрытий, предотвратить рассеченные ткани от прилипания к пластическим наконечники пипеток и центрифужные пробирки, пальто советы и пробирки с 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), растворенный в воде.
  2. Рассеките летит на силиконовой подушке с помощью щипцов.
    1. Во избежание повреждения кончики щипцов на твердую поверхность при выполнении рассечение тканей, выполняют рассечение на поверхности кремния. Для изготовления силиконовых пластин рассечение, расплавить кремний в коммерческом наборе в соответствии с инструкциями производителя (список материалов). После плавления силикон, добавить 3 до 4 мл в тканевой культуральной чашке диаметром 60 мм. Кремниевые блюда могут быть использованы повторно.
    2. Обезболить муху с CO 2, и передать его на силиконовой пластине с 1 мл холодного PBS. Введем CO 2 во флакон , содержащий муху , используя распылитель, а затем передать наркозом мухи тоа Pad , который имеет запас CO 2.
    3. Используйте пару щипцов, чтобы держать голову летать, а вторую пару щипцов, чтобы вытащить грудную клетку в противоположном направлении, чтобы отсоединить голову летучей от тела, охватывающего не повреждая соединение между головкой и передней кишки.
    4. Используйте 2 пары щипцов, чтобы удалить крылья и ноги из грудной клетки.
    5. Используйте пару щипцов держать грудную клетку, а другая пара щипцов, чтобы вытащить живот, чтобы отделить его от грудной клетки снова, не повредив связь между передней кишки и кишкой.
    6. Проанализируйте внутренние органы , включая мозг, кишечник, мальпигиевых канальцев и яичников , как было показано ранее. 39-41
    7. Удалите все кусочки кутикулы и жир тела с пинцетом, как эти ткани производят сильное аутофлюоресценция. Терпение и практика должны подготовить полную систему органов, как показано на рисунке.
  3. Передача расчлененный ткани в 1,5 мл центрифужные пробирки, и исправить тканей Wiй 0,5 мл 4% параформальдегида в PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) при КТ в течение 20 до 30 мин с вращением в темноте, чтобы избежать отбеливающим RFP и GFP в тканях. Избегайте длительного фиксации, что может поставить под угрозу последующие результаты окрашивания.
  4. Удалите параформальдегид осторожно пипеткой и промыть 3 раза с 0,5 мл PBST (PBS + 0,1% Тритон Х-100) при комнатной температуре.
  5. Проницаемыми ткани с 0,5 мл PBST при 4 ° С в течение ночи при осторожном встряхивании. Более короткие инкубирование может привести к неполному пермеабилизирующего и компромиссом окрашивания результаты.
    1. Если необходимо уменьшить фоновое окрашивание, рассмотреть инкубацией ткани в 0,5 мл PBST с 1% БСА, вместо PBS.
  6. Промыть в ткани 3 раза с 0,5 мл PBST.
  7. Для того, чтобы окрасить ядра и нитчатых актина (F-актин), наносят 0,5 мл PBST с 10 мкг / мл Hoechst 33342 синий ядерный краситель и 0,3 мкМ Alexa Fluor 633 фаллоидином F-актина пятно и инкубировать одновременно с тканями в течение 1 ч при КТ шIth нежный вращение в темноте. Избегайте длительного окрашивания, так как это приведет к увеличению фона.
    1. Для иммунологического окрашивания, инкубировать фиксированной и проницаемыми ткани с 0,1% тритона Х-100 в 0,5 мл PBS в течение ночи при температуре 4 ° С, морилку с 1: 100 разбавлении анти-Elav антителом или с 1: 200 разбавлении анти-каспазы-3 в течение ночи при 4 ° С (300 мкл). Следовать соответствующим вторичным антителом, разведенным 1: 100 и инкубируют в течение от 1 до 3 ч при комнатной температуре. См список материалов для конкретного антитела информации.
  8. Промыть в ткани 3 раза, каждый в течение 5 мин в 0,5 мл PBST при осторожном вращении.
  9. С пипетку, удалите все PBST, а затем добавить 200 мкл анти-отбеливатель крепления агента (см материалы), чтобы полностью покрыть ткани в течение 1-3 ч при комнатной температуре, или 4 ° С в течение ночи. Оптимальные ткани, которые полностью поглощаются монтажный агент будет опускаться на дно пробирки.
  10. Предварительно очистить стекло с водой или 70% этанола и переносят ткани с монтажным агента к Glass слайд.
  11. Аккуратно поместите стеклянную крышку скользить по ткани. Нанести вазелин на предметное стекло и покровным, чтобы избежать разрушения ткани путем пересжатия. Удалить дополнительный монтажный агент с бумажной салфеткой.
  12. Уплотнение крышки скольжения, применяя лак для ногтей все по краям покровного стекла, чтобы избежать утечки монтажа агентов из тканей.

3. конфокальной микроскопии

  1. Используйте перевернутую конфокальной эпи-флуоресцентного микроскопа. Тем не менее, до правые микроскопов могут быть также использованы. Для тканей изображения с помощью черепицу, поддерживать стабильную температуру в помещении, чтобы избежать дрейф фокуса и сдвига плоскости ху из-за теплового расширения и сжатия компонентов. Системы экологического контроля и системы компенсации дрейфа фокус помогают избежать этой проблемы в связи с потерей термопечати равновесия системы микроскопа.
  2. Поместите слайд на столик микроскопа. Сделайте несколько пробных изображений с использованием низкого разрешения (125 х 125 пикселей)d определяют необходимое количество плиток, необходимых для покрытия всей области интереса (ROI).
  3. Установите систему сканирующего микроскопа для захвата изображений с разрешением сканирования, таких как 500 х 500 пикселей. Выбор цели, такие как 20X NA 0,8 или цели План-Apochromat 63X Н.А. 1.4 для анализа тканей через покровные стекла, так что каждое из изображений (плитки) перекрывает на 20% со всех сторон.
  4. Настройка последовательности изображений с длинной до коротких волн возбуждения, так как длинноволновое излучение вызывает более низкое фото-отбеливание. Последовательность из длинной до короткой длиной волны возбуждения: (I) 633 нм для фаллоидином F-актина и на наличие антител к активированному каспаз, (II) 561 нм для ЗП, (III), 488 нм для GFP, и (IV), 405 нм для Hoechst окрашивающий ядра.
  5. Во время визуализации, свести к минимуму воздействие клеток к флуоресцентного лазерного возбуждения при визуализации процесса, чтобы избежать фото-отбеливание за счет уменьшения интенсивности лазерного излучения для получения высококачественных изображений тканей.
  6. После того как ямаги собирают, слияние изображений с помощью программного обеспечения микроскопа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Есть два ключевых компонента , которые позволяют CaspaseTracker обнаружить активность каспазы у нормальных здоровых клеток (рис 1а). Первый из них представляет собой 146 аминокислоты каспазы-расщепляться полипептид по образцу каспазы биосенсора Apoliner (рисунок 1b). 28 Этот полипептид получен из DIAP1 (ингибитор дрозофилы апоптоза) , содержащего единственный встречающийся в природе сайт каспазы , который расщепляется во время апоптоза , как правило , по каспазы DRICE. 42,43 DRICE эквивалентно каспазы-3 в организме млекопитающих и расщепляет наиболее известных клеточных субстратов. 4,32 Характеристика каспаз, DIAP1 и его производный полипептид расщепляются после определенного аспарагиновой кислоты, Asp20 находится в пределах распознавания каспазы последовательность 17-DQVD-20, и мутация обязательного Asp20 остатка на Ала (DQVA) упраздняет расщепление. 42,43 Подобно Apoliner 28 этот фрагмент DIAP1 является анчокрасный в цитоплазме на плазматической мембране с помощью мыши CD8 (альфа - цепь аминокислот 1-220), обычно используемым инструментом в дрозофилы. CD8 мембрана анкер предотвращает привязанный груз , несущий последовательность ядерной транслокации (nucGFP в случае Apoliner) от транслокации в ядро , при отсутствии активности каспаз. 28 Второй ключевой компонент CaspaseTracker является система G-волоконные дрозофила , в котором дрожжи фактор транскрипции Gal4 индуцирует экспрессию флиппазы (FLP) рекомбиназой (и одновременно вызывает ЗП). 34 флиппазы вырезает стоп - кодон , что приводит к постоянному выражению nucGFP. Для того, чтобы G-TRACE реагировать на активности каспазы, она была объединена с системой Apoliner путем привязывания GAL4, который необходим для активации G-волоконные, к плазменной мембраной якорь каспазы-расщепляться DIAP1 фрагмента Apoliner (рис 1а). 35

Мы сделали дополнительный MODIFications к компоненту Apoliner из CaspaseTracker для улучшения полезности. Самое главное, это очень важно, чтобы сама каспазы биосенсор не ингибирует каспазы, потенциально сохраняя клетки, которые в противном случае умрут. Хотя трансгенная Apoliner не вызывает явных фенотипы у дрозофилы 28, как можно было бы ожидать от потенциального ингибитора каспазы, иногда даже сохранение клеток нанесло бы поражение цели определения нормальных клеток с активностью каспазы. Тем не менее, фрагмент DIAP1 в Apoliner содержит мотив (135-DICG-138) , который был впоследствии показано, эффективно ингибируют DRICE, тот же каспазы , что расщепляет DIAP1 на Asp20 43 . Механизм ингибирования каспазы была обнаружена кристаллическая структура , в которой DIAP1 Asp135 забивается в DRICE активный сайт как мимической каспазы субстрата (но не расщепляется). 43 Биохимический анализ показал , что замена Arg на Asp135 ликвидирует DRICE-ингибирующее функцию. 43 Поэтому, CaspaseTracker был разработан с той же мутации D135R , чтобы избежать каспазы ингибирования (рис 1b). 35 Подобно Apoliner, встречающийся в природе последовательность DIAP1 Asn-Asn на De Novo N-конце после расщепления на Asp20 было изменено на Gly-Val в CaspaseTracker для предотвращения деградации Gal4 по правилу N-концевого при каспазы расщепления (рис 1b). 28 Кроме того, мы слиты с Мус-таг на с-конце Gal4 для готового обнаружения экспрессии CaspaseTracker. 35 необходимости, собственный RFP Apoliner в и nucGFP кассеты были удалены , чтобы сделать его совместимым с G-волоконные, который также содержит RFP и nucGFP. 28,35

Поскольку Gal4 несет свой собственный сигнал ядерной локализации и сильнодействующий активирует транскрипцию с помощью своей целевой реакции ДНК - элемента (UAS) при слиянии с другими трансгенов в дрозофилы, предположительно , лишь несколько молекул Gal4 отноблегчены цитоплазматических каспаз достаточно, чтобы включить выражение RFP в течение нескольких часов (по оценкам ≤12 ч). Поскольку биосенсора деятельность требует транскрипции De Novo и перевод запроса предложений, не сообщает ферментативной активности в реальном масштабе времени. Хотя CaspaseTracker RFP будет значительно ухудшаться, вероятно, в течение дня после того, как активность каспазы прекращается, nucGFP будет выражаться промотор убиквитина для жизни клетки и ее потомства.

Для того, чтобы продемонстрировать , что первый CaspaseTracker реагирует на активацию каспазы в естественных условиях, для взрослых CaspaseTracker биосенсора мухи были подвержены смерти клетки индуцирующие стимулы. Яичник Drosophila является хорошо изученным модель гибели клеток , как яичные камеры подвергаются запрограммированную гибель клеток , когда животные подчеркнуты, а предполагаемый механизм согласования условий окружающей среды потомству производства. 37,44,45 Чтобы вызвать гибель клеток, биосенсоры мухи были холодными шоку 1 час при -7° C (замораживание животных), и яичники вырезали у живых животных на следующий день (рис 2а). В отличие от необработанных биосенсора мух, яичные камеры после холодового шока были заметно меньше и выставлены надежные красный (последние) и зеленый (постоянный) биосенсора деятельность, проверяя активацию биосенсора после гибели клеток стимула (рис 2b, слияние). Биосенсоров активность была обнаружена в ядрах обоих зародышевых клеток (трофоцитов и ооциты) и соматические клетки (фолликулостимулирующий клетки) в яичном камерах, но только в обработанных мух. 35 морфологией характеристика апоптоза также легко наблюдать в биосенсора положительной яйцевых камер в том числе ядерной фрагментации, конденсации ДНК и деградации (потеря синевы). Биосенсоров активность может быть обнаружена в тех же клетках как с ядерной конденсации (Hoechst) и активных каспаз (immunostain), но наиболее интенсивное окрашивание для активных каспаз имели место в районах, где как ядерная ДНК и КАСПАСе биосенсоры сигналы были уменьшены или деградируют (2б). 46,47 Механизмы гибель клеток наблюдалась после холодного шока не хорошо охарактеризованы, и другие механизмы , как правило, находится в игре. Тем не менее, подобные результаты были получены после голодания аминокислоты, который , как известно, вызывает апоптоз. 35

Для того, чтобы определить, является ли CaspaseTracker может обнаружить не-апоптический активность каспазы, внутренние органы здоровых 1-дневных мух были тщательно рассечены путем удаления autofluorescent кутикулу и жир. Тканей из одного представителя мухи были установлены, смонтированы, окрашивали Hoechst, чтобы отметить ядер и с фаллоидином пятном для F-актина, чтобы обнаружить мышечные клетки. В отличие от здоровых яйцевых камер, которые испытывают недостаток активации биосенсора, F-актина окрашенных мышечные клетки между яйцевых камер имели красный и зеленый биосенсора активность (фиг.3А, вставка). Тем не менее, возможно, что биосеnsor также этикетки и другие клетки. Многие другие здоровые ткани и органы оптимально выращенной 1-дневных мух выставлены заметную биосенсора активность каспазы предположительно отражающие базальный , не апоптический функцию каспазы (рис 3а). Биосенсор-позитивные клетки появились морфологически нормальных и имели место в организованных узоров в тканях , предполагающих , что определенные подмножества клеток активации каспазы, например , полосы биосенсора-позитивных клеток обертыванием кишку (рис 3a, вставка).

Лучшим доказательством того, что CaspaseTracker является специфическим репортер каспаз является отсутствие сигнала у мух, выражающих управления биосенсора, который идентичен CaspaseTracker для одной мутации Асп Ала аминокислоты в обязательном сайта расщепления каспазы за исключением того, изменение DQVD к DQVA ( 1б и 3б). Для исключительно редкой ячейки (рис 3b, зеленая стрелка), единственный сигнал Observ За исключениемред в биосенсора мух управления DQVA являются autofluorescent структуры, такие как части рта (рис 3b) и съеденной пищи в урожае и в других местах (рис 3b и 4), которые также наблюдаются в нетрансгенных родительских мух , у которых отсутствует каспазы биосенсора. 35 в CaspaseTracker-меченые клетки происходят через регулярные интервалы вдоль мальпигиевых (почки) канальцах и часто демонстрируют как в последнее время (красный) и прошлое (зеленый) активацию каспазы одновременно, в то время как многие клетки в головном мозге, оптические лепестки, кардии, растениеводство, кишка и яйцевод либо красные или зеленые (рисунки 4 и 5а).

Для доказательства того, что долгоживущие клетки могут выжить активность каспазы, оптическая лопасть была иммуноокрашиванию для пан-нейронный маркер Elav (эмбриональный летальный аномальное зрение). 48 Ядра многих нейронов двойной помечены ядерной мишенью GFP из CaspaseTracker и Elav, в соответствии с долгоживущей CELLS с использованием каспазы для функций необрывающегося (рис 5б). Кроме того, если биосенсор выключен в течение 10 дней ( с использованием Gal80ts), биосенсоры-позитивные клетки сохраняются в течение длительности в кишечнике (рис 6а, б), головном мозге и в другом месте (не показано). Используя каспазы биосенсора CaspaseTracker, мы предоставляем первый обзор базальной активности каспазы в целых животных.

Рисунок 1
Рисунок 1: CaspaseTracker система биосенсора для обнаружения не-апоптический активность каспазы. (а) Компоненты каспазы биосенсора дрозофилы. (б) каспазы-расщепляться часть системы биосенсора CaspaseTracker состоит из плазматической мембраны якоря (mCD8), фрагмент DIAP1 , содержащий природный каспазы-сайт расщепления Asp20 , слитый с транскрипцией Gal4 фактор с с-концевым 3х-Myc тегом и выражается через убиквитин проMoter. Каспазы расщепления приводит к транслокации Gal4 к ядру, чтобы побудить систему G-TRACE. В контрольной биосенсора, необходимая Asp20 остаток в каспазы сайт расщепления 4-аминокислоты (DQVD) изменяется на Ала (DQVA) упразднить каспазы расщепления. Трансгенные CaspaseTracker мух содержат 4 трансгены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: CaspaseTracker активируется каспаз во время гибели клеток. (а) Схема Drosophila яичнике и блок - схемы для холодной ударно-индуцированной гибели клеток. Drosophila яичник рисунок (по Polan Santos) и дрозофилы изображения (Даррен Obbard) используются с разрешения. (б) камеры яйцеклетки из яичника 6- день самка CaspaseTracker мух кормили ж Ith нормальная муха пищи в течение 6 дней (необработанных) или 1 день после холодового шока (-7 ° С, 1 ч, с последующим добавлением 25 ° C в течение 24 часов), чтобы вызвать активацию каспазы в яйцевых камер. Увеличенных холодной обработке яичнике (нижний правый кадры) показывают три яичных камеры в одной из развивающихся яйцевая трубка цепь (сконцентрированные приблизительно вертикально) с признаками ядерной конденсации (сверху яйцо камеры), ядерной фрагментации (средняя яйцевой камеры и вставках) и деградации (нижняя яйца камера) на основе ДНК красителем Hoechst (синий). Активные каспазы (анти-каспазы-3, пурпурного) обнаруживаются в средней и нижней яйцевых камер. RFP и GFP биосенсора активность (красный, зеленый и желтый стрелки) происходят в клетках с конденсацией ядерной ДНК, которая часто Stain диффузно с активными каспаз (вставках). Белые стрелки указывают ядра, лишенные как биосенсора активности и активной каспазы immunostain. * Автофлюоресценции сигналы. Эти данные воспроизводятся с разрешения Tang и др., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Данные для широкого физиологической активности каспазы. (а) Объединенное конфокальной образ CaspaseTracker (DQVD) RFP и nucGFP из одного недавно eclosed муха , поднятый на 18 ° C, расчленены и окрашивали H33342 для ядер и фаллоидином для F-актина (розовый), и визуализируют с помощью ДВС - синдрома. Фаллоидином показывается только на вставке для яйцевых камер. (Б) следовали те же процедуры и визуализации условий для управления CaspaseTracker (DQVA) мух. * Autofluorescent структуры. Эти данные воспроизводятся с разрешения Tang и др., Sci Rep 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэта фигура.

Рисунок 4
Рис . 4: Базальная активность каспазы во многих тканях увеличениями ДВС - синдрома и флуоресценции конфокальной образы GFP ( в прошлом) и RFP (недавние) CaspaseTracker активности (DQVD) и Hoechst-окрашенных ядер в мозге, кардии, кадрирование, кишкой, мальпигиевых канальцев и яйцеводы из рис 3а. * Autofluorescent структуры. Эти данные воспроизводятся с разрешения Tang и др., Sci Rep 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Non-апоптическая активность каспазы в нейронах дрозофилы оптические лопасть. (а) DIC и конфокальной изображения с RFP (последние) и ( в прошлом) CaspaseTracker (DQVD) активности GFP и Hoechst-окрашенных ядер в головном мозге. RFP + GFP двойственные-меченых клеток (желтые стрелки). (Б) NucGFP локализуется с immunostain для пан нейронного белка ядерной Elav в оптической доле CaspaseTracker (DQVD) летать мозг. Нейроны с колокализуются сигналами NucGFP и Elav показаны (белые стрелки). Обратите внимание, RFP-меченных нейронов, не присутствуют в этой конкретной области. Эти данные воспроизводятся с разрешения Tang и др., Sci Rep 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы проиллюстрируем строительные и внутренние работы CaspaseTracker, которые облегчают обнаружение широко распространенного базальной активности каспазы в здоровых тканях. Критические шаги для обнаружения не-апоптический активность каспазы в естественных условиях являются: 1) формирование мух с биосенсора трансгена, 2) проверки каспазы конкретной функции репортера с соответствующим контролем, 3) практикует методы рассечение соблюдать все внутренние органы и системы взрослого дрозофилы, и 4) отличительная биосенсора активность от autofluorescent артефактов.

Естественным каспазы-расщепляться полипептид, который служит в качестве датчика каспазы-специфический был изменен, чтобы избежать каких-либо каспазы-ингибиторной активностью по биосенсора. Дальнейшие изменения были сделаны, чтобы избежать быстрой деградации фактора транскрипции Gal4, а также введение эпитоп тега. Мы также описать весь орган тела рассечение мух, иммунное окрашивание, монтаж и конфокальной микроскопии летучей тканиs, чтобы обнаружить, не апоптический активность каспазы.

В то время как CaspaseTracker идеально подходит для обнаружения клеток, которые выживают с низким уровнем активности каспазы, это не репортер активности фермента в режиме реального времени, а через несколько часов требуется, чтобы включить биосенсора. Тем не менее, мы не определили минимальное время для обнаружения, который, вероятно, намного короче, чем это необходимо для применений, описанных здесь. В отличие от CaspaseTracker, главным ограничением других каспаз биосенсоров является их неспособность обнаружить низкие уровни активности каспазы, так как они предназначены в первую очередь для изучения клеточной гибели. Каспазы активность усиливается после гибели клеток стимул, вызывая массовый снос клеток менее чем за 30 мин. 49 Таким образом, обнаружение активации каспазы часто считается маркером определенной клеточной смерти. 50,51 Тем не менее, все больше свидетельств указывает на то, что каспазы есть не-апоптическая, даже не-деструктивных функций в здоровых клетках. 7-21 presuМЕД низкий уровень пространственно и временно ограничено ферментативную активность каспаз, которые осуществляют их изо дня в рабочие места, вероятно, ниже обнаружения с помощью имеющихся технологий. Эта проблема решается с помощью CaspaseTracker, что , вероятно , требует несколько событий каспазы расщепления генерировать надежные сигналы, и не требуют постоянного активности каспазы ферментативную постоянно маркировать эти клетки в естественных условиях.

Доказательства, представленные указывает на то, что CaspaseTracker является специфическим для каспаз, хотя мы не можем исключить возможность того, что другие неустановленные Asp-специфических протеаз может активировать CaspaseTracker. Тем не менее, кормление мух с коктейлем из каспазы-ингибитора пептидов блокирует CaspaseTracker активности (неопубликованной). Мы также подчеркиваем важность недопущения биосенсоров, которые сами тормозят каспазы, а также важность контроля биосенсоров и не трансгенными мух, чтобы избежать ошибочных выводов из-за присущих автофлюоресценции кутикулы насекомых, внутренний жир Depoсидит, съеденной пищи или других вмешивающимся фактором.

Еще одной проблемой является отличительной про-смерти и необрывающегося функции каспаз. Функции Pro-смерть и необрывающегося могут быть связаны эволюционно с целью перехода клеток между нормальным физиологическим состоянием к соответствующим приуроченной смерти, например расширение иммунных клеток для борьбы с инфекцией, и последующее устранение этих клеток, чтобы предотвратить рак. Таким образом, мы не можем исключить возможность того, что некоторые из наблюдаемых базальной активности каспазы во внутренних органах, вместо этого попытка способствовать гибели клеток, по- видимому в соответствии с оцененные десятки смертей миллиардов клеток происходит ежедневно в организме человека. 52 Тем не менее, здоровый морфологии клеток, экспрессирующих биосенсор сильно указывает на то, что CaspaseTracker способен обнаруживать активность каспазы, предназначенный для обычных дневных заданий каспаз.

Каспазы предлагается иметь роли необрывающегося, такие как клеткипролиферации. Это согласуется с более ранними попытками генерировать клеточные линии млекопитающих , стабильно экспрессирующих вирусные белки , которые связываются и непосредственно ингибируют клеточные каспазы (например, CrmA). В то время как сотни клеточных колоний возникли во время выбора лекарственного средства с пустым контрольным вектором, неожиданно нулевой колонии образуются в параллельных культурах, трансфицированных вектором, экспрессирующим ингибиторов каспаз (неопубликованные данные). Таким образом, каспазы вероятно, широко распространенные функции в нормальных клетках, которые в настоящее время недооцененной. Это дополнительно подтверждается тем фактом, что базальная биосенсора активность в CaspaseTracker лету обнаруживается во многих типах клеток через большинство органов и систем, в том числе нейроны, у нормальных здоровых мух. Здоровая активность каспазы в нейронах могут демонтировать синаптических окончаний, чтобы способствовать нормальной функции мозга при расщеплении те же субстраты, как во время апоптоза, или их функции день работы могут быть совершенно отличны от апоптозом, как деятельности. В то время как низкий по сравнению с высокими уровнями ферментативных активногокаспазы может быть критически важное различие между дневным рабочим местам и гибели клеток, есть несколько Достучаться мутантных животных с определенными каспазы-uncleavable субстратов , которые поддерживают эту возможность. 17,53 Тем не менее, в последнее время прогресс указывает на то, что каспазы-8 ингибирует necroptosis , возможно, расщепляя RIPK, 54 синаптической депрессии и эндоцитоз рецептора АМРА может регулироваться каспазы расщепления Gap43, 55 и обработки микроРНК могут регулироваться каспазы расщепления Dicer. 14,15,56

Есть много дополнительных применений этого биосенсора. Для того, чтобы определить , является ли каспазы активируются в определенные моменты времени или в определенных тканях, экспрессия биосенсора может быть легко регулируется во времени (например, с использованием Gal80ts) и в определенных типах клеток (например, обонятельные драйверов для конкретных Gal4). Использование Gal80ts для подавления экспрессии биосенсора до появления взрослых мух не все еще привело к широкому распространению биосенсора активности, что указывает на КАСПАСES может быть активирован на взрослых стадиях (6С и г). 35 Заменив фрагмент DIAP1 с другими каспаз субстраты, другие приложения могут включать в себя биосенсоры специфичны для разных каспаз и для обнаружения расщепление специфических субстратов. CaspaseTracker биосенсора усилит наше понимание роли не-апоптотических деятельности каспазы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим Polan Сантос и Даррен Obbard для дрозофилы иллюстраций на рис. 2а, Марсело Якобс-Лорена для использования инсектарий JHMRI. Эта работа была поддержана стипендией Research Foundation Life Science (ГВУ), Комитет Гранты Университета Гонконга AoE / B-07/99 (MCF) и NIH предоставляет NS096677, NS037402 и NS083373 (JMH). Хо Лам Тан является Shurl и Кей Курчи Foundation сотрудник Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Tags

Молекулярная биология выпуск 117 каспазы биосенсор, апоптоз не-апоптотических мозг нейроны CaspaseTracker
<em>В Vivo</em> биосенсоров Треки Non-апоптотической активности каспазы в <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter