Abstract
培养的心肌细胞可用于研究是否可使用那些对体内系统补充技术心肌生物学。例如， 在体外培养的纯度和可访问性使得在生化分析，实时成像，和电精细控制。心肌细胞长期培养提供了访问，不能在短期内培养进行额外的实验方法。例如，去分化，细胞周期再入，和细胞分裂的体外调查迄今基本上被限制在大鼠心肌细胞，这似乎是在长期培养更加健壮。然而，转基因小鼠线和发达的疾病模型的丰富的工具集的可用性使鼠标系统的心脏研究的吸引力。尽管一些报道成年小鼠心肌细胞分离存在的，一些研究展示自己的长期培养。这里介绍的，是为一步一步的方法成年小鼠心肌细胞的分离和长期培养。首先，逆行的Langendorff灌注被用来有效地消化用蛋白酶的心脏，接着通过重力沉降纯化。一段去分化下述分离后，将细胞逐渐附着到培养，并且可以是数周培养。腺病毒的细胞裂解物，用于有效地转导的分离的心肌细胞。这些方法提供了一种简单，但功能强大的模型系统来研究生物学的心脏。
Introduction
培养的心肌细胞经常用于监测在体外良好控制的环境中细胞的行为。例如，形态，电气，生化或机械细胞性质可在工程衬底进行研究，在确定的培养基1,2，以及响应于小分子药物，肽，基因调控，3或电刺激。4蜂窝含量可以还使用定义共培养物来控制。5 这些体外实验是在大的药物或遗传筛选有用和体内方法各种类型涉及心肌生物学调查补充。
长期的文化使那些需要长的时间内，实现表型改变的实验途径。适时地例子是成年哺乳动物心肌细胞增殖，其中去分化，细胞周期再入，和细胞分裂典型地研究过本身的veral天至数周，6,7这里，延长培养时间有利于遗传操作，7,8分化的功能（ 例如，肌节拆卸）9和潜在的转录分化。6随后细胞周期重新进入和细胞分裂，需要更长的时间培养观察，特别是如果多轮师都是实验性的目标。心肌细胞周期的重要性是中央在心脏再生，其中，预先存在的心肌细胞的分化和增殖已显示负责在斑马鱼和新生小鼠心脏再生几个最近的关键科学著作。10-12。因此，有可能刺激分化和细胞周期重新进入哺乳动物成年心肌留在人的心脏再生13-15的一个关键问题
I N体外实验研究哺乳动物心脏的细胞周期肌细胞已主要使用鼠源，由于其相对容易长期培养的相比小鼠模型16然而，鼠系统提供的充分表征的基因的工具和疾病模型是在体外 和体内有用资源丰富协议。例如，基于Cre的谱系追踪，使预先存在的心肌细胞的鉴定如在体内的新生小鼠心脏再生心肌的一个来源。12 体外谱系追踪新生小鼠的心肌细胞的研究已启用与基质相互作用的检查细胞通过共培养成纤维细胞。5然而，由于它的挑战，17报道很少成年小鼠心肌细胞的分离和长期培养的存在。18,19
单独短期培养存活成年小鼠心肌细胞的分离被称为是一个具有挑战性的任务。这protocOL提供了有关如何实现从可用于短期和长期的调查成年小鼠心肌细胞存活一步一步的指导。使用此协议分离的心肌细胞可以与腺病毒载体20,21和培养周有效地转。这些方法提供了强大的系统来研究生物学心肌体外 。
本文所描述的方法是基于从使用的Langendorff逆行灌注的变化之前的作品几个元素。18,22虽然几个协议已发表 关于短期培养和研究中，23-25 的优点的成年小鼠心肌细胞的隔离该协议是能够培养分离的心肌细胞长期的。这将是在涉及异位基因表达并且需要延长的时间段，例如在细胞的初始化策略细胞过程的研究是有用的。
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Protocol
这里列出的所有程序已获得批准的机构动物使用及护理委员会在加州大学旧金山分校。
注：简单地说，来自小鼠胸腔中提取的心脏后，冠状动脉逆行灌注被用来有效地消化用胶原酶和蛋白酶XIV细胞外基质。然后心室被隔离，机械分离并过滤成一个单一的细胞悬浮液。重力沉降进行分离的心肌细胞，这是从基质细胞样的成纤维细胞和内皮细胞可以通过高密度分离。纯化的心肌细胞可用于在层粘连蛋白涂层的聚苯乙烯周中培养，并用腺病毒基因载体转导。
1.心肌隔离
- 准备缓冲器，外科站和灌注设备
- 按Tab键准备缓冲区和媒体乐1。
- 开启循环水浴，设定输入温度，使得加热的水套的输出达到37℃的温度。
- 通过用70％乙醇冲洗干净灌注系统。然后用无菌水几卷冲洗除去从系统中乙醇的所有痕迹。
- 装入灌注缓冲液（ 见表1）灌注系统。一是排水系统从，然后用2体积的灌注缓冲液冲洗。然后填充灌注缓冲液使得热套的内侧列充满灌注缓冲液的死空间，但脱泡腔室是空的。
提示：确保无气泡存在于脱泡室下方的线。要删除顽固的气泡，使所有旋塞，让压力线内建立了几秒钟。然后松开下活塞，使高压灌注缓冲区从出口射流;快速流动和turbulencË将有助于驱逐被抓灌注出口附近的气泡。 - 准备的注射器针头被用于主动脉插管。附加一个18G的钝针到1ml注射器充满灌注缓冲液中。去除气泡和修复注射器组件与实验室磁带解剖miscroscope照明的一只手臂。
提示：若要从斜口针创建一个钝头针，用横切线切割针轴。然后磨练与打磨石头尖，直到提示是平坦的。
注意：为降低插管期间从针主动脉滑移，粗糙化用剃刀刀片的插管针头的轴。由轮毂和上轴固定针头，然后看到剃刀来回垂直于针杆的长轴旋转的同时，直到几个沟槽已1厘米针杆的尖端的内创建。切换到一个新的剃须刀当刀片变钝。 - 将一个洁净解剖显微镜下面的培养皿中插管遏制心脏。所述照射器臂，使得所述套管的尖端靠近视场的边缘定位，但不妨碍清扫。确保套管的前端在培养皿的边缘的下方。
注：要帮助清扫过程中固定的心脏，放置一个小的（〜5 - 6 平方厘米），215微米网孔方形的培养皿。当心脏被放置在该网格，它会产生磨擦，以减少滑动和机械操作过程中心脏的旋转。 - 领带2缝线与周围的套管针的毂松双反手结用于主动脉固定。
- 心脏提取和插管
- 管理通过腹膜内注射肝素（5 IU / g体重）。等待20分钟，使肝素流通至心脏。
- 麻醉小鼠腹腔注射鼠标20％的氨基甲酸乙酯（2毫克的氨基甲酸乙酯/ g体重）的离子。密切观察，直到鼠标是深麻醉下（大约3 - 5分钟）。
注：深麻醉是由缺乏既脚趾捏和角膜反射的证实。如果鼠标还没有由8达到深度麻醉 - 10分钟，然后施用的氨基甲酸乙酯的额外剂量。虽然麻醉个体反应将小鼠之间有所不同，未能进入在第一次给药麻醉过深可能表明退化的氨基甲酸乙酯，这可能会妨碍深麻醉即使经过多次给药。为了防止退化，准备的氨基甲酸乙酯每次使用前新鲜溶液。 - 通过确保与手术磁带每个肢体固定鼠标的手术平台。用70％乙醇的自由量消毒切口区域。抹干了实验室擦拭。
- 提起用组织钳只是胸骨下方皮肤。请用小剪刀外侧切口，切割救援人员到场唉皮肤和腹部。
- 用止血钳经胸骨轻轻抬起胸腔。使用小的解剖剪刀，在朝向腋窝V字形延伸的切口。通过第一肋切割并穿刺每侧隔膜。
- 继续解除与止血胸腔和使用小光圈剪刀完全横切隔膜。小心不要刺破心脏。
- 缩回吻侧使用连接止血，并迅速肋骨但仔细通过朝向两侧腋下胸腔切割延伸的V形切口。完全缩回胸腔的中间部分和放下所附止血就位持有。
- 删除使用细镊子心包。
- 当使用弯钳轻轻提起心脏，横切连接到心脏的静脉和动脉。立即将心脏在冰冷的灌注缓冲减缓肌肉收缩。
- 放置在心脏下一个培养皿解剖显微镜（地方上的一小块215微米的网格，以帮助清扫过程中固定）。修剪用细虹膜剪任何过量的非心脏组织。主动脉附近切割时要小心。
- 断面附近brachioencephalic动脉主动脉，并注意不要让气泡或组织碎片进入开通。
- 填充含有用冰冷的灌注缓冲液，使得液位上升套管的开口上方的心脏培养皿。鞘主动脉到套管，使得尖端只是远离主动脉瓣。
提示：为了减少空气栓塞的风险，在插管的注射器略微压下插管之前，以除去可能在套管的端部已经开发潜在气泡。此外，保持套管的尖端和主动脉溶液的表面之下，以避免引入气泡而护套主动脉。 - 滑动追平前7-0丝线下来插管针和位置正好针尖上方的轴上。拧紧用细镊子结。重复此步骤，以放置正上方的第一的第二缝合线。
注：确保该针尖仍主动脉瓣上述前和紧后。 - 慢慢地压下注射器通过冠状动脉血管弹出0.5毫升灌注缓冲。
注：如果插管成功，血液得以显现而使冠状动脉血管和汇集了背静脉和动脉。
重要：从胸腔打开的时间（特别是穿刺隔膜）到初始灌注应尽量少，以减少缺氧暴露并最大限度地分离的心肌细胞的存活和健康。理想情况下，这个时间应小于5分钟。
- 灌注
注：逆行灌注装置可在一个清洁的环境中方便地操作一个标准的实验室工作台上或放置在层流罩最大化无菌。然而，灌注完成后，工作应在层流进行，以尽量减少污染。- 轻轻地但坚定慢慢扭动来回移除注射器（使用无菌手套）套管座。而拉动插管针从注射器的，慢慢地喷射灌注缓冲液进针毂，以防止在灌注期间的气泡。
- 从灌注出口下方取出循环收集管，并用废抓烧杯代替。附加针毂，其固定于灌注出口端口的路厄氏适配器（ 图1，图2）上的水套，而泵是在最低设置运行（15 RPM，〜6毫升/分钟）。
提示：当针集线器连接到鲁尔适配器，让滴水灌注缓冲精读NECT到在针毂的液体，以避免引入气泡。 - 灌注心脏而不再循环直到8毫升灌注缓冲液已经通过入口软管吸出。
注：灌注缓冲液中在该步骤由入口软管吸气体积假定为7毫升的灌注系统死体积，总共为15ml灌注缓冲液中通过心脏泵送。 - 从灌注缓冲液移除入口管。允许空气通过所述入口为小于系统的死体积被吸出。
注意：在这个步骤中吸入的空气的体积，必须进行调整，以防止空气进入冠状脉管（见步骤1.3.7）。 - 放置入口管进入消化缓冲液（ 表1），只是在管的底部的上方。订阅缓慢并允许进口管抽吸足够体积，以避免过满管。
- 可视化和遵循的气泡在灌注缓冲液并行进通过热夹套的消化缓冲液。观察在加热夹套的中心灌注缓冲液的水平开始下降，一旦气泡到达脱泡室。一旦消化缓冲到达脱泡室的液体中的热量夹套水平将保持稳定。
重要说明：如果灌注缓冲水平降得太低，关闭出口活塞，打开排活塞。允许电平上升到一个舒适的水准（3 - 第5英寸出口段）。然后，停止灌注泵和关闭排活塞。打开出口活塞并重新启动灌注泵。 - 观看解决方案从心脏出现。作为最后的灌注缓冲液中离开心脏和消化缓冲液开始通过心脏循环，从清晰的颜色变化到浅棕色将观察到由于胶原酶的存在。
- 灌注消化缓冲的心脏约10 - 15分钟。心脏就会开始懒散的胶原降解，它失去的机械支撑。
- 机械分离与纯化
- 从在干燥培养皿镊子和地点插管取出心脏。用细虹膜剪修剪快额外心室组织。转移心室到新鲜培养皿含有培养皿灌注缓冲液洗。移动至培养皿无菌罩和心室转移到新鲜，干燥培养皿。
- 从热护套收集7.5毫升消化缓冲液，并添加1M的氯化钙 2.8微升，颠倒混匀。用氯化钙 3毫升消化缓冲液到心室中的陪替氏培养皿-添加2。
注：钙离子的浓度是从300至700微米凸起 - 很快磨碎用细镊子心室组织，使大部分作品是小于1mm 3。添加保持从步骤1.3.2至在培养皿中解离的心室ING 钙补充消化缓冲液并通过温和搅拌混合。
- 放置培养皿在37℃培养箱，用5％ 的 CO 2。摇动培养皿每2分钟，直到有足够的心肌细胞（见下面的注释）已经从组织释放。
注：孵化的长度可能需要根据实验的需要进行调整，以微调消化的程度。通常，较长的温育时间增加产率和纯度，但可能减少细胞附着和存活率。 5 - 10分钟通常足以获得高的产率（〜5 -每个心脏10×10 5个细胞）。 - 传送培养皿回一个层流罩。使用以45°角切割移液管，轻轻吸取的组织中以进一步分离。
- 使用无菌手套到215微米的网折叠成锥形并容纳超过一个50ml锥形。吸管离解的组织悬浮液到网和让滤液排到50ml锥形。使用7.5毫升预温热终止缓冲液（ 见表1）的通过筛网从培养皿洗心肌细胞，与第一滤液组合。
注： 钙升高到最终的1.1毫米，并在终止缓冲液最终2.5％FBS的中和蛋白酶活性。 - 细胞悬液转移到15毫升锥形，并允许通过重力15分钟以沉淀。
- 小心地取出用移液管这样的上清液，只有50 - 100微升的解决方案仍然是细胞之上。加入10 mL预热，平衡的培养基（ 表1），并轻轻地倒转混合。让心肌细胞通过重力15分钟解决。
提示：为了提高纯度，重复步骤1.4.8应有的作用。 - 100微升Ø - 小心地用移液管等，只有50取出上清液˚F解决方案仍然是细胞之上。
2.心肌文化
- 预涂层的组织电镀细胞之前培养处理与层粘连蛋白（10微克/毫升），并存储培养皿在37℃下2小时。之前，为了电镀，吸从组织培养板层粘连蛋白的解决方案。用MEM或PBS洗一次，然后吸残余液体以除去未吸附的层粘连蛋白。
- 加入足够的预热的，平衡的培养基以达到所需的细胞密度，轻轻翻转混匀。板所需的细胞浓度到培养容器（一般为5 - 20×10 4个细胞/ cm 2）。为了评估心肌隔离的产率，通过检查在显微镜下密度计通过血细胞计数器或测试板上的细胞。成年小鼠心脏通常会提供0.5 - 1.0×10 6个细胞在这个阶段的协议。
提示：如果使用96孔板，使用1000微升micropipETTE带以45°角切割的前端，以尽量减少由于剪切力的细胞损伤。放置枪头使得其接触孔的底部的细胞悬浮液的喷射过程中，以最小化引入气泡。 - 迅速移动至细胞培养皿于37℃培养箱，用5％ 的 CO 2和95％的湿度。根据需要，以防止酸化改变媒体：每1 - 取决于细胞密度5天。在第一个3最小化培养皿的处理 - 13天以促进附着于细胞培养表面。
注：要在媒体的变化减少细胞的干扰时，细胞还没有完全连接，进行一个半媒体的变化。慢慢吸媒体，同时保持枪头只是媒体的表面之下。然后慢慢地通过保持枪头只是对培养皿的壁的介质的表面上方添加其他介质。 - 为了评估心肌的生存能力，检查下明场显微术的形态。新鲜分离的心肌细胞保持与在光照下尖锐，鲜明边缘的大致棒状的形态（ 图2）。
注意：用台盼蓝染色细胞活力确认。 - 为了评估心肌隔离的纯度，检查细胞形态，以确定心肌细胞。与染色赫司特33342细胞核，以确定细胞总数。
注：心肌可以从非心肌通过特性的形态（棒状）和大小来识别（大约100 - 200微米长）。或者，新鲜分离的心肌细胞将染色阳性特定心肌标记物，如α-辅肌动蛋白26（ 图3C，D）或心脏肌钙蛋白T. 27
3.转基因腺病毒
- 通过开办的制备腺病毒细胞裂解液编制方法21转导使用来自腺病毒生产细胞10细胞裂解物的心肌细胞。在隔离在分别为0白天或每日1次，小心地将细胞裂解液加入到含有心肌媒体。
注：高滴度的腺病毒制备物将在大约48实现强劲表现- 72小时。调整感染复数以适应实验设计。
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Representative Results
野生型成人ICR（CD1）小鼠心脏通常产生从一个成功的隔离500,000到1,000,000心肌细胞。分离后立即将细胞保持大多棒状外观（ 图3A）与完整肌节和可用于涉及心肌收缩功能研究。棒状心肌（90％以上）的高百分比是有效灌注和消化的指示。可行的心肌细胞将是大的（〜100 - 200微米长）和出现有在光照下（ 图3A）的急剧外膜。免疫染色特定心肌肌节标记，例如α-辅肌动蛋白，将导致不同的肌节带型（ 图3C）。在与形态分析和核染色用DAPI一起，免疫染色可以用于评估分离的心肌细胞的纯度。 FIBR只是隔离州后，将小而圆，但很快就会附着和薄摊在细胞培养塑料，从而使浅显的区别从心肌细胞。
棒状心肌的低百分比是不成功的隔离的指示。这可能会导致从失败的心脏从动物中提取后快速导管插入主动脉。低效灌注时，由于空气栓塞或者例如不正确插管，也可能影响心肌细胞的形态和生存力。
后在培养数天，心肌细胞假定一个圆形的形态（ 图3B）。在1 - 2周，活心肌细胞附着于基底，并开始扩展（ 图3D中的E）。死细胞可以通过台盼蓝夹杂来鉴定。一个成功的分离培养将产生约50％的现场心肺1周后肌细胞。非心肌细胞，如由于其增殖潜力的成纤维细胞，将导致这些细胞后在培养物的高百分比的污染。这可以通过增加重力沉降的数量和/或通过预镀以增加纯度来避免。28
转导的腺病毒可用于在48实现强的基因表达- 72小时（ 图3E）。腺病毒血清型5是转导在体外成年小鼠心肌细胞由于柯萨奇腺病毒受体的高表达效率，但可取决于所使用的介质的类型。20
图1. 心肌细胞分离设备和仪器仪表。用（A）手术器械提取鼠标心脏和导管插入主动脉，从上到下：止血，组织钳，弯钳，杜蒙＃5细镊子，小解剖剪刀，精细虹膜剪，精挤剪刀（B）用于消化小鼠心脏中的Langendorff灌注系统。 。灌注缓冲剂通过入口管（1）由灌注泵吸（2），并通过泵出口管（3）插入所述入口端口在加热的水套（4）。灌注缓冲区由加热的水套温热，因为他们通过螺旋玻璃管，脱泡室行进，然后出附着到灌注出口端口（5），它是由一个活栓连接的插管针头。下面的锥形管捕获灌注缓冲剂，通过入口管，其被重新分发。压力端口（6），遵守端口（7）和排气（8）保持，以保持一个恒定的流量灌注期间关闭。水套是由一个循环水浴通过第进入加热È护套入口（9）和出口（10）的端口。一个环形底座用于保持在垂直位置加热水套（红色夹子，紫锥管架下方的黑底座）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.灌注系统的示意图。如提到的手稿的灌注装置的重要部位标注。灌注缓冲液的流动方向由箭头表示。注意主动脉插管的定位，它的尖端应该通过半透明的主动脉可见，以确保它被放置在主动脉瓣上方。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 隔离成年小鼠心肌细胞。心肌细胞进行分离，种植到如描述的协议在此层粘连蛋白涂层的96孔板（ 一）新鲜分离的心肌细胞，种子大约8000细胞/ cm 2。需要注意的是新鲜分离的，可行的心肌出现大约有锋利的边缘（白箭头）棒状。但是，似乎有下明弥漫外膜心肌细胞都死了。在培养的第几天，心肌假定圆形形状（B）（C）的免疫染色用于α-辅肌动蛋白（绿色）揭示了在D1隔离后心肌细胞特性横纹肌条纹。核染色（DAPI）以蓝色显示。顶部示出了在较低的图像放大概述区域的图像（D） 。（E）明和啶图像显示在用腺病毒CMV启动子控制下携带绿色荧光蛋白记者转天11后隔离心肌细胞（从罗伯特·杰勒德在UT西南的礼物）。细胞接种在约18,000细胞/ cm 2，并使用每个细胞约800噬斑形成单位（PFU）的感染复数转导在第0天。比例尺：50微米请点击此处查看该图的放大版本。
| 心肌细胞分离缓冲液（CIB） | |||
| 添加900毫升超纯水的下MAG一个干净的烧杯NETIC搅拌。 | |||
| 添加缓冲部件在表中所指示的。 | |||
| 零件 | MW | 最终浓度（MM） | 1X（克/升） |
| 氯化钠 | 58.44 | 120 | 7.013 |
| 氯化钾 | 74.55 | 5.4 | 0.403 |
| 的 Na 2 HPO4.7H 2 O | 268.07 | 0.33 | 0.088 |
| 硫酸镁4·7H 2 O | 246.48 | 0.5 | 0.123 |
| 牛磺酸 | 125.1 | 三十 | 3.753 |
| BDM | 101.1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238.3 | 25 | 5.958 |
| 葡萄糖 | 180.16 | 22 | 3.964 |
| 调整pH值机智H 5 M氢氧化钠。 | |||
| 调节音量，以1升用超纯水。 | |||
| 无菌过滤器瓦特/ 0.22微米的真空过滤机。 | |||
| 加入0.5微升每升心肌细胞分离缓冲0.1 U / ml的胰岛素。 | |||
| 灌注缓冲 | |||
| 零件 | 最后 | 体积（ml） | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA（0.4M） | 0.4毫米 | 0.2 | |
| 总 | - | 200 | |
| 消化缓冲液 | |||
| 零件 | 最后 | 量 | |
| CIB | - | 15毫升 | |
| 氯化钙（1M） | 300μM | 4.5微升 | |
| 第十四蛋白酶 | 0.2毫克/毫升 | 3毫克 | |
| 胶原酶II | 2.4毫克/毫升 | 36毫克 | |
| 总 | - | 15毫升 | |
| 挡车器 | |||
| 零件 | 最后 | 体积（ml） | |
| 灌注缓冲 | 95％ | 14.25 | |
| 氯化钙（1M） | 1.5毫米 | 22.5 | |
| FBS | 5％ | 0.75 | |
| 总 | - | 15毫升 | |
| 文化传媒 | |||
| 零件 | 最后 ％ | 体积（ml） | |
| MEM媒体 | 90％ | 90 | |
| FBS | 10％ | 10 | |
| Primocin | 0.2％ | 0.2 | |
| 总 | 100％ | 100毫升 | |
| 允许培养基在37℃，5％二氧化碳平衡。 | |||
表1： 解决方案和缓冲区。
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Discussion
分离出心肌细胞的整体健康取决于该协议的几个重要方面。首先，从心脏提取到灌注的时间是非常关键的，应在5分钟以下进行。钙的除去有助于解离细胞-细胞相互作用，但能细胞健康长期负面影响。29-32。因此，我们发现它足以通过EGTA灌注的最初几分钟期间去除钙（乙二醇四乙酸）螯合， 22但很快消化和随后的步骤中恢复钙。
利用蛋白酶十四大大提高比单独胶原酶消化效率。这减少了不一致性由于胶原酶批次变异，18,24并通过重力沉降过程中促进分离增加心肌细胞的纯度。然而，过度的消化会阻止有效的附着于培养基质，所以一个良好的平衡我š需要优化细胞产率和纯度，同时保持细胞附着和生活力。因此，蛋白酶和消化的长度的浓度可以被修改以适应实验目标。在一般情况下，一个较小的程度消化将增强心肌细胞的附着和存活。胰蛋白酶的使用已经报道在某些心肌隔离协议。18然而，加入胰蛋白酶至此处所用的蛋白酶鸡尾酒（胶原酶和蛋白酶ⅩⅣ）减少在培养的心肌细胞的长期生存能力，可能是由于过度消化或切割的必要表面和/或细胞外基质蛋白。
丁二酮肟（BDM）的分离过程中包括抑制心肌收缩，从而降低了由于终端挛缩，能量消耗，而且钙悖论的消极后果。29,33然而，根据我们的经验，拆除BDM之前文化催生dedifferentiation和允许细胞适应培养在两个维度。
要注意的是长期适应到的2-D培养可能影响心肌功能方面，诸如收缩是非常重要的。因此，收缩和电生理学实验应该隔离，当本土机构肌仍然完好无损后不久进行。此外，与任何体外实验，在培养所述细胞是缺乏如体液或免疫信号本体内某些外在影响的。另一方面，定义的共培养物，可实现为研究心肌细胞和其他细胞类型之间的相互作用。5,34此外， 在体外培养可用于研究与在培养基中定义的分子信号的心肌细胞的行为。因此，实验的总体目标应慎重考虑，反对这种文化系统的局限性和优势称重。
。35应当注意的是，FBS和其他动物衍生的血清含有未知组分可影响细胞生理，36,37尽管生长因子FBS井赞赏的存在，38这里介绍的心肌细胞培养不繁殖。相反，阻断细胞周期似乎是成年小鼠心肌细胞的持久化属性体外 ，在开发的围产期从他们的细胞周期退出维护。12,39此属性是重大利益心脏再生医学，这里的场成年哺乳动物心肌回复到增殖表型已经重追求的目标。3,26,40-42值得注意的是，它是目前还不清楚什么程度去分化为心肌细胞重新进入细胞周期是必需的，但contributio去分化在低等脊椎动物再生的n被很好地支持43,44,10,11此外，越来越多地在哺乳动物系统中，至少在功能级别，包括肌原纤维拆卸6,12,9心肌细胞增殖和心脏再生被观察去分化因此，在培养心肌细胞的分化状态，应慎重考虑，并根据研究目标的需要调节。这样，培养条件可以潜在地进一步修饰以降低血清浓度，使用定义的血清替代品或无血清培养基。例如，成年大鼠心肌细胞表现出组织肌节分别培养长期无血清，但生长因子，如成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，和甲状腺素在确定的培养基中使用45可以想象的是类似媒体的制剂，或潜在的其他制剂如那些适于从differenti通货膨胀协议，46可被用于维持在培养分化良好成年小鼠心肌细胞可显示高度有组织的肌节的结构。替代制剂也被开发以实现其它的表型（如高度去分化的心肌细胞）6根据实验的需要，但进一步的工作是必需的。
成纤维细胞的作用已牵涉于在长期培养新生小鼠的心肌细胞周期5和成年小鼠心肌细胞的分化（通过肥厚IL6信令）的控制。19因此，成纤维细胞在培养物中生长应占实验解释。在培养的成纤维细胞的生长可通过加入生长限制通过预镀的步骤类似阿糖胞苷19（阿糖胞苷）或化合物来控制。28然而，阿糖胞苷也将抑制心肌细胞的生长，使替代方法应被用来控制成纤维细胞在关于心肌细胞周期研究生长。在这里所描述的协议，初始心肌纯度可以通过重复重力沉降步骤（见1.4.8）来增强。
本文的方法提供了一种体外系统，可用于研究成年哺乳动物的心肌细胞周期阻滞的性质。相反来自其它生物体，如大鼠或豚鼠主细胞，原代小鼠心肌细胞提供了丰富的有力和充分表征的遗传工具，例如基于Cre的谱系追踪敲入模型47，其可用于容易地识别从预先存在的心肌细胞的细胞。12,48此外，主成年鼠心肌细胞已经经受导致细胞周期阻滞天然发育的条件下，不同的细胞系和分化的ES或iPSC的细胞46，尽管他们convenienCE和适应大型药物筛选，2可能在实验中探测成人的心肌细胞周期退出的有限性工具。
该协议概述了一个可靠的方法来分离，培养成年小鼠心肌细胞。几种方法已经证实为短期研究成年小鼠心肌细胞的分离，但迄今为止，很少有报告成年小鼠心肌细胞的长期培养的存在。18,19保持成年小鼠心肌细胞在培养应使该能力心肌细胞生物学需要长期研究的实验条件下的体外研究。例如，基因表达可以使用腺病毒载体，其通常需要几天来实现充分表达被操纵。随后的表型变化和分析可以根据实验的目标需要的时间甚至更长的时间。这里介绍的方法允许成年小鼠cardiom文化yocytes数周。这应该在心肌细胞生物学谨慎的问题，诸如与细胞周期调控的调查提供了一个功能强大的系统。
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Acknowledgments
该项目由加州大学旧金山分校计划突破生物医学研究（由桑德勒基金会提供部分资助），美国国立卫生研究院途径来独立奖（R00HL114738）和爱德华马林克罗特小基金会。 JJ是由来自美国国立卫生研究院（T32HL007731）的博士后奖学金支持。作者在此工作，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见的内容负责。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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