Abstract
Gekweekte hartspiercellen kunnen worden gebruikt om cardiomyocyt biologische technieken gebruiken die complementair is aan in vivo systemen te bestuderen. Bijvoorbeeld, de zuiverheid en de bereikbaarheid van in vitro kweek maakt fijne controle over biochemische analyses, live beeldvorming en elektrofysiologie. Langetermijnkweek cardiomyocyten biedt toegang tot aanvullende experimentele benaderingen die niet op korte termijn kweken kan worden voltooid. Bijvoorbeeld de in vitro onderzoek dedifferentiatie, celcyclus herintreding en celdeling tot nu toe grotendeels beperkt tot cardiomyocyten van de rat, die voorkomen robuuster langetermijnkweek zijn. Echter, de beschikbaarheid van een rijke toolset van transgene muizen lijnen en goed ontwikkelde ziekte modellen muis systemen aantrekkelijk voor cardiale onderzoek. Hoewel verschillende rapporten bestaan van volwassen muis cardiomyocyt isolatie, enkele studies tonen aan hun lange termijn cultuur. Hier voorgesteld, is een stap-voor-stap werkwijze voor deisolatie en de lange termijn de cultuur van volwassen muis hartspiercellen. Eerst wordt retrograde Langendorff perfusie gebruikt om efficiënt verteren het hart met proteasen, gevolgd door zwaartekracht sedimentatie zuivering. Na een periode van dedifferentiatie na isolering, de cellen geleidelijk hechten aan de kweek en kan gekweekt weken. Adenovirus cellysaat wordt gebruikt om de geïsoleerde cardiomyocyten efficiënt transduceren. Deze methoden bieden een eenvoudige, maar krachtige modelsysteem om cardiale biologie studeren.
Introduction
Gekweekte hartspiercellen worden vaak gebruikt om cel gedrag te observeren in een goed gecontroleerde omgeving in vitro. Zo kunnen morfologische, elektrische, biochemische of mechanische celeigenschappen worden bestudeerd speciale substraten, 1,2 in gedefinieerde media, en in reactie op kleine moleculen, peptiden, genregulatie, 3 of elektrische stimulering. 4 De cellulaire inhoud eveneens met gedefinieerd co-culturen. 5 De in vitro experimenten zijn bruikbaar bij grote drugs of genetische screens en complement in vivo werkwijzen van verschillende soorten onderzoeken waarbij cardiomyocyt biologie.
Langlopende cultuur maakt experimentele wegen die vereisen langere tijd aan fenotypische verandering te bewerkstelligen. Een actueel voorbeeld is dat van volwassen zoogdieren cardiomyocyt proliferatie, indien dedifferentiatie, celcyclus herintreding en celdeling kenmerkend bestudeerd via seVeral dagen tot weken. 6,7 Hier het uitgebreide cultuur tijd vergemakkelijkt genetische manipulatie, 7,8 functionele dedifferentiatie (bijv sarcomeer demontage) 9 en mogelijk transcriptie dedifferentiatie. 6 Latere celcyclus re-entry en celdeling vereist nog langere periodes cultuur om te observeren, vooral als er meerdere rondes van verdeeldheid zijn de experimentele doel. Het belang van de cardiomyocyt celcyclus staat centraal in verschillende recente belangrijke wetenschappelijke werken van hart regeneratie, waarbij de dedifferentiatie en proliferatie van reeds bestaande hartspiercellen verantwoordelijk voor hart regeneratie in zebravis en neonatale muizen aangetoond. 10-12 dus de mogelijkheid te stimuleren dedifferentiatie en celcyclus re-entry in zoogdiercellen volwassen hartspiercellen blijft een belangrijke vraag in het menselijke hart regeneratie 13-15
I n vitro experimenten bestuderen de celcyclus van zoogdiercellen cardiomyocyten hebben voornamelijk gebruikt rat bronnen, vanwege hun relatieve gemak van langetermijnkweek opzichte muismodellen. 16 echter murine systemen bieden een rijke bron van goed gekarakteriseerde transgene gereedschappen en ziektemodellen die bruikbaar zijn in zowel in vitro als in vivo protocollen. Zo heeft Cre-based lijn traceren de identificatie van reeds bestaande hartspiercellen ingesteld als bron regenereren myocardium in de neonatale muis hart in vivo. 12 In vitro onderzoek van lijn getraceerd neonatale muis hartspiercellen het onderzoek interacties met stromale heeft ingeschakeld cellen door co-kweek met fibroblasten. 5 vanwege zijn uitdagingen, 17 enkele gevallen bestaan uit de isolatie en langdurige kweek van volwassen muizen cardiomyocyten. 18,19
De isolatie van levensvatbare volwassen muizen cardiomyocyten korte termijn kweek alleen bekend is een uitdagende taak. dit protocol biedt stap-voor-stap instructies over hoe om levensvatbare hartspiercellen van volwassen muizen die gebruikt kan worden voor zowel de korte termijn als op lange termijn onderzoek te bereiken. Hartspiercellen die met dit protocol kan efficiënt worden getransduceerd met adénovirale vectoren 20,21 en gedurende weken. Deze werkwijzen verschaffen een krachtig systeem om cardiomyocyt studie biologie in vitro.
De hierin beschreven werkwijzen zijn gebaseerd op verschillende elementen uit vroegere werken varianten van het Langendorff retrograde perfusie. 18,22 Hoewel verschillende protocollen van de isolatie van volwassen muizen cardiomyocyten korte termijn cultuur en onderzoek 23-25 het voordeel gepubliceerd dit protocol is de mogelijkheid om de geïsoleerde cardiomyocyten kweek op lange termijn. Deze zijn nuttig voor het bestuderen van cellulaire processen waarbij ectopische genexpressie en vereisen langere tijdsperioden, bijvoorbeeld in cellulaire herprogrammering strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hier geschetst zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Universiteit van Californië, San Francisco.
OPMERKING: kort na extraheren van het hart van de muis thorax, coronaire retrograde perfusie gebruikt om efficiënt verteren de extracellulaire matrix met collagenase en protease XIV. De ventrikels worden vervolgens geïsoleerd, mechanisch gedissocieerd en gefiltreerd in een enkele celsuspensie. Zwaartekracht sedimentatie wordt uitgevoerd om cardiomyocyten, die uit bindweefselcellen zoals fibroblasten en endotheelcellen worden gescheiden door hun hoge dichtheid isoleren. De gezuiverde hartspiercellen kunnen worden gekweekt wekenlang-laminine beklede polystyreen en getransduceerd met vectoren adenovirus gen.
1. Cardiomyocyte Isolation
- Bereid Buffers, Chirurgische Station en perfusie Apparatus
- Bereid buffers en media volgens Table 1.
- Schakel circulerend waterbad, ingesteld ingangstemperatuur zodanig dat productie van verwarmde watermantel een temperatuur van 37 ° C bereikt.
- Clean perfusie systeem door te spoelen met 70% ethanol. Verwijder vervolgens alle sporen van ethanol uit het systeem door te spoelen met verschillende volumes van steriel water.
- Plaats het perfusie systeem perfusie buffer (Tabel 1). Eerst afvalwater uit het systeem vervolgens spoelen met 2 volumina perfusiebuffer. Vul dan de dode ruimte met perfusie buffer zodanig dat de binnenste kolom van de warmte jas is gevuld met perfusie buffer, maar de debubbling kamer leeg is.
TIP: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de regel onder de debubbling kamer zijn. Om recalcitrant bellen te verwijderen, gaan alle kranen en laat de druk op te bouwen in de lijn voor een paar seconden. Laat vervolgens de onderste kraan, waardoor de hoge druk perfusie buffer om jet uit het stopcontact; de snelle doorstroming en turbulence zal helpen los bellen die zijn gevangen in de buurt van de perfusie stopcontact. - Bereid een spuit met naald te worden gebruikt voor aorta canule. Bevestig een 18 G stompe naald in een 1 ml injectiespuit gevuld met perfusie buffer. Verwijder luchtbellen en bevestig de spuit assemblage tot een arm van de dissectie miscroscope verlichting met lab tape.
TIP: Als u een stomp uiteinde naald maken van een afgeschuinde naald, doorsnijden de naald as met draad cutters. scherpen dan de tip met een schuren van steen totdat de tip is vlak.
Opmerking: Om het slippen van de aorta van de naald tijdens cannulatie verminderen, opgeruwd schacht van de canule naald met een scheermesje. Bevestig de naald door de naaf en bovenste as, zag toen het scheermes heen en weer loodrecht op de lengteas van de naald as tijdens het draaien tot enkele groeven binnen 1 cm van de punt van de naald schacht gemaakt. Overschakelen naar een nieuw scheerapparaat wanneer het mes bot wordt. - Plaats een schonepetrischaal onder de microscoop ontleden aan het hart tijdens infusen bevatten. Plaats het belichtingstoestel arm zodanig dat de punt van de canule aan de rand van het beeldveld, maar niet belemmeren van de dissectie. Zorgen de punt van de canule onder de rand van de petrischaal.
LET OP: Om u te helpen immobiliseren het hart tijdens dissectie, plaats een klein (~ 5-7 cm 2) vierkant van 215 micron maas in de petrischaal. Wanneer het hart wordt geplaatst op deze mesh, zal het de wrijving te verminderen schuiven en roteren van het hart tijdens mechanische manipulatie te creëren. - Tie 2 met losse hechtingen dubbele overhandse knopen rond de naaf van de punctienaald te gebruiken voor bevestiging van de aorta.
- Hart Extraction en Canulatie
- Dien heparine (5 IU / g lichaamsgewicht) via intraperitoneale injectie. Wacht 20 minuten zodat de heparine circuleren naar het hart.
- Verdoven van de muis door intraperitoneale injection van 20% ethylcarbamaat (2 mg ethylcarbamaat / g lichaamsgewicht). Acht voet totdat de muis onder diepe narcose (ca. 3-5 minuten).
LET OP: Deep verdoving wordt bevestigd door een gebrek aan zowel de teen knijpen en hoornvlies reflexen. Als de muis niet diep anesthesie met 8 heeft bereikt - 10 min, vervolgens toedienen van een extra dosis van ethylcarbamaat. Hoewel individuele reacties op anesthesie zal variëren tussen de muizen, het niet diep anesthesie bij de eerste dosering in te voeren kan gedegradeerd ethylcarbamaat, die diepe narcose kan beletten, zelfs na herhaalde toediening aan te geven. Om degradatie te voorkomen, stelt een verse oplossing van ethylcarbamaat voor elk gebruik. - Immobiliseren de muis om de operatie platform door het veiligstellen van elke ledemaat met chirurgische tape. Ontsmet de incisie met een liberale bedrag van 70% ethanol. Pat droog met een lab-wipe.
- Til de huid met weefsel tang net onder het borstbeen. Maak een laterale incisie met kleine schaar, snijden through de huid en de buik.
- Gebruik hemostats aan de ribbenkast til via het borstbeen. Met behulp van kleine dissectie schaar, uitbreiding van de incisie in een V-vorm in de richting van de oksels. Snijd door de eerste rib en punctie het middenrif aan elke kant.
- Blijf de ribbenkast met hemostats tillen en gebruik maken van kleine iris schaar om het membraan volledig doorsnijden. Zorg ervoor dat het hart niet te doorboren.
- Trek de ribbenkast rostraal behulp verbonden hemostats en snel maar nauwkeurig breiden de V-vorm incisie door snijden door de ribbenkast naar de oksels aan beide zijden. Trek het middelste gedeelte van de ribbenkast volledig en ging de bijgevoegde hemostats om zijn plaats te houden.
- Verwijder het hartzakje met behulp van fijne pincet.
- Terwijl het hart voorzichtig op te tillen met behulp gebogen pincet, doorsnijden de aderen en slagaderen aangesloten op het hart. Onmiddellijk plaats het hart in ijskoude perfusie buffer om de spieren te vertragen.
- Plaats het hart in een petrischaal ondereen dissectie microscoop (plaats op een klein stukje van 215 urn gaas te helpen immobiliseren tijdens dissectie). Knip de overtollige niet-hartweefsel met behulp van fijne iris schaar. Wees voorzichtig bij het snijden in de buurt van de aorta.
- Doorsnijden van de aorta in de buurt van de brachioencephalic slagader, en zorg niet te laten bellen of weefsel puin voer de opening.
- Vul de petrischaal die het hart met ijs perfusie koude buffer zodanig dat het vloeistofniveau stijgt boven de opening van de canule. Huls de aorta op de canule zodanig dat de punt net distaal van de aortaklep.
TIP: Om het risico op luchtembolie te verminderen, iets drukt u de spuit op de canule voorafgaand aan infusen om mogelijke luchtbellen die aan het einde van de canule kan hebben ontwikkeld te verwijderen. Bovendien houdt de punt van de canule en de aorta onder de oppervlakte van de oplossing te voorkomen dat er luchtbellen terwijl de mantel aorta. - Schuif een pre-gebonden 7-0 zijden hechtdraad omlaagde schacht van de infusen naald en positie net boven de punt van de naald. Draai de knoop met fijne pincet. Herhaal deze stap met een tweede hechting geplaatst net boven de eerste.
LET OP: Zorg ervoor dat de punt van de naald is nog steeds boven de aortaklep voor en na het aandraaien. - Duw langzaam de spuit 0,5 ml perfusiebuffer uitwerpen door de coronaire vasculatuur.
OPMERKING: Als de infusen succesvol was, zal bloed worden gevisualiseerd het verlaten van de coronaire vaatstelsel en samenbrengen uit de dorsale aders en slagaders.
Belangrijk: De tijd van openen van de borstholte (met name prikken membraan) perfusie initiële worden geminimaliseerd om hypoxische blootstelling en maximaliseren van de overleving en de gezondheid van de geïsoleerde cardiomyocyten. Idealiter zou deze minder dan 5 min.
- perfusie
LET OP: De retrograde perfusieinrichting kan geschikt worden gebruikt in een schone omgeving op een standaard laboratorium werkbank of in een laminaire stroming kap om de steriliteit te maximaliseren. Echter, na perfusie voltooid, werkzaamheden moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming om contaminatie te minimaliseren.- Voorzichtig maar stevig Verwijder de canulenaaf van de spuit (met steriele handschoenen) door langzaam draaien en weer. Terwijl het trekken van de infusen naald af van de spuit langzaam uitwerpen perfusie buffer in de naald hub om luchtbellen te voorkomen tijdens perfusie.
- Verwijder de recirculatie vangst buis van onder de perfusie uitlaatpoort en te vervangen door een verspilling vangst beker. Bevestig de naaldnaaf om de luer adapter die is bevestigd aan de perfusie uitlaatpoort (figuren 1, 2) op de watermantel, terwijl de pomp draait op de laagste instelling (15 rpm ~ 6 ml / min).
TIP: Bij het aansluiten van de naald hub naar de luer adapter, zodat de druipende perfusie buffer te connect de vloeistof in de naaldnaaf om de voorkomen dat er luchtbellen. - Perfuseren het hart zonder recirculatie tot en met 8 ml van de perfusie buffer is opgezogen door de slang.
Opmerking: Het volume van perfusie buffer afgezogen door de slang in deze stap neemt een dood volume van 7 ml van het perfusie systeem, dus in totaal 15 ml perfusiebuffer gepompt door het hart. - Verwijder de inlaatbuis van de perfusie buffer. Kan lucht worden aangezogen door de inlaat voor minder dan het dode volume van het systeem.
LET OP: Het volume van de lucht aangezogen in deze stap moet worden aangepast om te voorkomen dat er lucht in de coronaire vaatstelsel (zie stap 1.3.7). - Plaats de inlaatbuis in de digestiebuffer (tabel 1), net boven de bodem van de buis. Feed langzaam en laat de inlaatbuis om voldoende volume te zuigen om te voorkomen dat overvulling van de buis.
- Visualiseren en volg de luchtbel tussende perfusie buffer en digestiebuffer aangezien het door de warmte mantel. Waarnemen van het niveau van perfusie buffer in het midden van de warmte mantel beginnen te dalen wanneer de luchtbel het borrelen de kamer bereikt. Zodra de digestiebuffer het borrelen de kamer bereikt, zal het vloeistofniveau in de hitte mantel stabiel blijven.
BELANGRIJK: Als het niveau van de perfusie buffer te laag, sluit de uitlaat kraan en open de ontluchting kraan. Laat het level te stijgen naar een comfortabel niveau (3-5 inches boven de uitlaatpoort). Dan stop de perfusie pomp en sluit de ontluchting kraan. Open de uitlaatpoort kraan en de perfusie pomp opnieuw te starten. - Bekijk de oplossing die uit het hart. Als laatste van de perfusie buffer verlaat het hart en de digestiebuffer begint circuleert door het hart, zal kleurverandering van helder tot lichtbruin worden waargenomen als gevolg van de aanwezigheid van collagenase.
- Perfuseren het hart met de spijsvertering bufferongeveer 10 - 15 min. Het hart zal beginnen slungelig als het collageen wordt afgebroken en verliest het mechanische ondersteuning.
- Dissociatie mechanische en zuivering
- Verwijder het hart van de canule met een pincet en plaats in een droge petrischaal. Snel trimmen extra-ventriculaire weefsel met behulp van fijne iris schaar. Breng de ventrikels een verse petrischaal die perfusie buffer te wassen. Verplaats de petrischaal op een steriele kap en de ventrikels overbrengen naar een nieuwe, droge petrischaal.
- Verzamel 7,5 ml van de spijsvertering buffer van het vuur jas en voeg 2,8 pl van 1 M CaCl2, meng door inversie. Voeg 2-3 ml digestiebuffer met CaCl 2 naar de ventrikels in de petrischaal.
Opmerking: De concentratie van Ca2 + wordt verhoogd 300-700 uM - Snel vermaal het ventriculaire weefsel met fijne tang, zodat de meeste stukken kleiner dan 1 mm3. Voeg het blijvening Ca 2+ aangevuld spijsvertering buffer van stap 1.3.2 naar de gedissocieerde ventrikels in de petrischaal en meng door voorzichtig schudden.
- Plaats de petrischaal in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Schud de petrischaal om de 2 min totdat er voldoende hartspiercellen (zie opmerking hieronder) zijn vrijgelaten uit het weefsel.
OPMERKING: De lengte van de incubatie moet worden aangepast selecteerbaar om mate van vertering volgens de behoeften van het experiment. In het algemeen langere incubatietijden verhogen opbrengst en zuiverheid, maar kan de snelheid van celhechting en overleving verminderen. 5-10 min is over het algemeen voldoende om een hoog rendement te bereiken (~ 5-10 x 10 5 cellen per hart). - Breng de petrischaal terug naar een laminaire stroming kap. Met behulp van een pipet afgesneden 45 ° voorzichtig pipet het weefsel verder dissociëren.
- Gebruik steriele handschoenen om de 215 urn gaas vouwen in een kegel en vast te houden over een 50 ml conische. Pipetde gedissocieerde weefselsuspensie op het gaas en laat het filtraat afwateren in de 50 ml conische. Gebruik 7,5 ml voorverwarmde stopbuffer (tabel 1) het wassen van de cardiomyocyten petrischaal door het gaas, te combineren met het eerste filtraat.
OPMERKING: Ca2 + wordt verhoogd tot 1,1 mM uiteindelijke en definitieve 2,5% FBS in de stopbuffer neutraliseert proteaseactiviteit. - Breng de celsuspensie om een 15 ml conische en laat om zich te vestigen door de zwaartekracht gedurende 15 min.
- Verwijder voorzichtig het supernatant met een transfer pipet zodanig dat slechts 50 - 100 ul oplossing blijft boven de cellen. Voeg 10 ml van voorverwarmde, in evenwicht gebracht cultuur media (tabel 1) en meng door voorzichtig omkeren. Laat de hartspiercellen om zich te vestigen door de zwaartekracht gedurende 15 min.
TIP: Om de zuiverheid te verhogen, herhaalt u stap 1.4.8 zoals gewenst. - Verwijder het supernatant voorzichtig met een transfer pipet zodanig dat slechts 50 - 100 ul of oplossing blijft boven de cellen.
2. Cardiomyocyte Cultuur
- Voorbekleding weefselkweek behandelde petrischalen met laminine (10 ug / ml) en bewaar bij 37 ° C gedurende 2 uren voorafgaand aan uitplaten cellen. Net voor plating, zuigen de laminine oplossing van de weefselkweekplaat. Was eenmaal met PBS of MEM, vervolgens zuigen restvloeistof die niet-geadsorbeerde laminine verwijderen.
- Voeg genoeg voorverwarmd, in evenwicht gebracht cultuur media om de gewenste cel dichtheid te bereiken, meng door voorzichtig omkeren. Plaat gewenste concentratie van cellen in het kweekvat (typisch 5-20 x 10 4 cellen / cm 2). De opbrengst van cardiomyocyten isolatie beoordelen, tel de cellen via hemacytometer of tests plaat door eerst de dichtheid onder een microscoop. Een volwassen muis hart biedt typisch 0,5-1,0 x 10 6 cellen in deze fase van het protocol.
TIP: Bij gebruik van platen met 96 putjes, gebruik dan een 1.000 III micropipette met een punt snijden bij een 45 ° hoek celschade door kracht scheren minimaliseren. Plaats de pipetpunt zodanig dat de bodem van het putje raakt wordt uitgeworpen celsuspensie teneinde invoering belletjes ontstaan. - Verplaats de celkweekschaal snel op een 37 ° C incubator met 5% CO2 en 95% vochtigheid. Verander media als nodig is om de verzuring te voorkomen: elke 1-5 dagen, afhankelijk van celdichtheid. Minimaliseren behandeling van de kweekschaal gedurende de eerste 3-6 dagen om de bevestiging aan de celkweek oppervlak vergemakkelijken.
OPMERKING: Om cel overlast zoveel mogelijk te beperken tijdens de media verandert wanneer de cellen nog niet volledig aangesloten, het uitvoeren van een half-media verandering. Zuig het medium langzaam terwijl de pipetpunt net onder het oppervlak van de media. Dan langzaam aanvullende media voeg waarbij de pipetpunt net boven het oppervlak van het medium tegen de wand van de kweekschaal. - Om de levensvatbaarheid van hartspiercellen te beoordelen, te controlerende morfologie onder helderveld microscopie. Vers geïsoleerde cardiomyocyten handhaven van een ongeveer staafvormige morfologie met scherpe, duidelijke randen onder helderveld belichting (figuur 2).
LET OP: Bevestig levensvatbaarheid door kleuring van de cellen met trypan blauw. - Om de zuiverheid van de cardiomyocyt isolement te beoordelen, controleren de celmorfologie om hartspiercellen te identificeren. Vlekken op de kernen met Hoechst 33342 totale cellen te identificeren.
LET OP: Cardiomyocytes geïdentificeerd kunnen worden uit niet-hartspiercellen door hun karakteristieke morfologie (staafvormige) en grootte (ongeveer 100-200 urn in lengte). Alternatief zal vers geïsoleerde cardiomyocyten positief cardiomyocyt-specifieke merkers, zoals alfa-actinine 26 (Figuur 3C, D) of cardiale troponine T. 27 vlekken
3. Gene Transductie met adenovirus
- Bereid adenovirus cellysaat met behulp van gevestigde methoden. 21 transduceren de hartspiercellen met behulp van cellysaat van adenovirus producerende cellen 10. Op dag 0 en dag 1 na isolatie, voorzichtig het cellysaat aan de media die de cardiomyocyten.
OPMERKING: Een hoge titer adenovirus voorbereiding zal sterke expressie te bereiken in ongeveer 48-72 uur. Stel de multipliciteit van infectie proefopzet passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een wild-type volwassen ICR (CD1) muis hart levert doorgaans 500.000 tot 1 miljoen hartspiercellen uit een succesvolle isolement. Onmiddellijk na isolatie, de cellen behouden een meestal staafvormig uiterlijk (Figuur 3A) met intacte sarcomeren en kan worden gebruikt voor functionele studies met cardiomyocyt contractiliteit. Een hoog percentage van staafvormige cardiomyocyten (boven 90%) is een indicatie van effectieve perfusie en de spijsvertering. Levensvatbare hartspiercellen zal groot zijn (~ 100-200 urn in lengte) en blijken een scherpe buitenste membraan onder helderveld verlichting (figuur 3A) te hebben. Immunokleuring voor cardiomyocyt- specifieke sarcomerische markers, zoals alfa-actinine, leidt tot een duidelijk sarcomeer banding patroon (Figuur 3C). Samen met morfologische analyse en nucleaire kleuring met DAPI, kan immunokleuring worden gebruikt om de zuiverheid van de geïsoleerde cardiomyocyten beoordelen. fibroblasts zullen klein en rond zijn net na isolatie, maar zal snel hechten en verspreid dun op celcultuur plastic, waardoor facile onderscheiding van hartspiercellen.
Een laag percentage staafvormige cardiomyocyten is een indicatie van een mislukte isolatie. Dit kan het gevolg zijn van een gebrek aan de aorta snel canule nadat het hart wordt gewonnen uit het dier. Inefficiënte perfusie vanwege een luchtembolie of onjuiste cannulatie bijvoorbeeld factoren ook de morfologie en levensvatbaarheid van de cardiomyocyten.
Na enkele dagen in kweek, de cardiomyocyten nemen een afgeronde morfologie (figuur 3B). Binnen 1-2 weken, levende cardiomyocyten hechten aan het substraat en beginnen verspreiding (Figuur 3D, E). Dode cellen kunnen worden geïdentificeerd door trypan blauw uitsluiting. Een succesvolle isolatie en cultuur zal opleveren van ongeveer 50% woont cardiomyocyten na 1 week. Verontreiniging door niet- cardiomyocyten, zoals fibroblasten resulteert in een hoog percentage van deze cellen in kweek later vanwege hun proliferatieve potentie. Dit kan worden vermeden door het aantal van de zwaartekracht sedimentatie en / of via pre-plating om de zuiverheid te verhogen. 28
Transductie met adenovirus kan worden gebruikt om sterke genexpressie binnen 48 bereiken - 72 uur (figuur 3E). Adenovirus serotype 5 is efficiënt transduceren volwassen muis hartspiercellen in vitro als gevolg van de hoge expressie van het coxackie-adenovirus receptor, maar kan afhankelijk van het type gebruikte media. 20
Figuur 1. Cardiomyocyte Isolatie apparatuur en instrumentarium. (A) Chirurgische instrumenten gebruikt om de muis extraherenhart en canule van de aorta, van boven naar beneden: hemostats, tissue tang, gebogen tang, Dumont # 5 fijne tang, klein ontleden schaar, fijn iris schaar, fijn squeeze schaar (B) De Langendorff perfusie-systeem dat wordt gebruikt om de muis hart verteren. . Perfusie buffers worden opgezogen door de inlaatbuis (1) Door de perfusie pomp (2) en door de pomp uitlaatbuis (3) in de inlaatpoort aan het verwarmde water mantel (4). De perfusie buffers worden verwarmd door de verwarmde watermantel als ze door de spiraalvormige glazen buis, de debubbling kamer, en vervolgens uit de canule naald bevestigd aan de perfusie uitlaatpoort (5), die is verbonden door een kraan. Onderstaande conische buis vangt de perfusie buffers, die opnieuw door de inlaatbuis. De drukpoort (6), voldaan poort (7) en opening (8) blijven gesloten tijdens perfusie om een constant debiet te handhaven. Het water mantel wordt verwarmd door een circulerend waterbad invoeren door The jacket inlaat (9) en de uitlaat (10) poorten. Een ring stand wordt gebruikt om het verwarmde water jasje in een verticale positie (rode klemmen, zwarte basis onder de paarse conische buis rek) vast te houden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematisch overzicht van perfusie-systeem. Belangrijke delen van de perfusie Apparatus worden aangeduid als bedoeld in het manuscript. De stromingsrichting van perfusie buffer wordt aangegeven met pijlen. Let op de positionering van de aorta canule, moet het puntje van die zichtbaar door de doorzichtige aorta te zijn, zodat het wordt boven de aortaklep geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Geïsoleerde Adult Mouse Cardiomyocytes. Hartspiercellen werden geïsoleerd en gezaaid op laminine-Coated 96 well platen, zoals beschreven in het protocol Hierin. (A) Vers geïsoleerde hartspiercellen, gezaaid met ongeveer 8.000 cellen / cm2. Merk op dat vers geïsoleerde, levensvatbare hartspiercellen verschijnen ongeveer staafvormige met scherpe randen (witte pijlpunt). Echter cardiomyocyten die lijken een diffuse buitenste membraan onder helderveld zijn dood. Tijdens de eerste paar dagen van de cultuur, de hartspiercellen wordt uitgegaan van een afgeronde vorm (B). (C) Immunokleuring voor alpha-actinine (groen) onthult karakteristieke sarcomeer banding in een cardiomyocyten bij d1 post-isolatie. Nucleaire vlek (DAPI) verschijnen in blauw. Top shows ingezoomd beeld van geschetst regio lager beeld. (D) (E) Helderveld en epifluorescerende beelden tonen hartspiercellen op dag 11 na isolatie getransduceerd met adenovirus die een GFP reporter onder de controle van een CMV-promoter ( een geschenk van Robert Gerard op UT Zuid). Cellen werden gezaaid bij ongeveer 18.000 cellen / cm2 en werden getransduceerd op dag 0 met een multipliciteit van infectie van ongeveer 800 plaque-vormende eenheden (PFU) per cel. Schaal bars. 50 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Cardiomyocyte isolatie buffer (CIB) | |||
| Voeg 900 ml ultrapuur water om een schone beker onder magmagnetische roeren. | |||
| Voeg de buffercomponenten in de tabel aangegeven. | |||
| bestanddeel | MW | Eindconc (mM) | 1X (g / l) |
| NaCl | 58,44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74.55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 O 2 HPO4.7H | 268,07 | 0.33 | 0,088 |
| 4 MgSO .7H O 2 | 246,48 | 0.5 | 0.123 |
| taurine | 125.1 | 30 | 3,753 |
| BDM | 101.1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| Glucose | 180,16 | 22 | 3,964 |
| Stel de pH with 5 M NaOH. | |||
| Zet het volume op 1 liter met ultrapuur water. | |||
| Steriel filter w / 0,22 pm vacuüm filter. | |||
| Voeg 0,5 ui 0,1 U / ml insuline per liter cardiomyocyten isolatiebuffer. | |||
| perfusiebuffer | |||
| bestanddeel | Laatste | Volume (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mM | 0.2 | |
| Totaal | - | 200 | |
| spijsvertering buffer | |||
| bestanddeel | Laatste | Bedrag | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1M) | 300uM | 4,5 pl | |
| protease XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| collagenase II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Totaal | - | 15 ml | |
| Stop buffer | |||
| bestanddeel | Laatste | Volume (ml) | |
| perfusiebuffer | 95% | 14.25 | |
| CaCl2 (1M) | 1,5 mM | 22.5 | |
| FBS | 5% | 0.75 | |
| Totaal | - | 15 ml | |
| Cultuurmedia | |||
| bestanddeel | Laatste % | Volume (ml) | |
| MEM media | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0.2 | |
| Totaal | 100% | 100 ml | |
| Kweekmedia laten equilibreren bij 37 ° C, 5% kooldioxide. | |||
Tabel 1: oplossingen en buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De algehele gezondheid van de geïsoleerde cardiomyocyten afhankelijk van verschillende belangrijke aspecten van dit protocol. Ten eerste, de tijd tussen hart extractie perfusie is kritisch en moet worden uitgevoerd in 5 minuten of minder. Verwijdering van calcium helpt bij cel-cel interacties dissociëren, maar een negatieve invloed celgezondheid lange termijn. 29-32 Zo vinden we het voldoende om calcium te verwijderen tijdens de eerste paar minuten perfusie met EGTA (ethyleenglycol-azijnzuur) chelatie, 22 maar al snel te herstellen calcium tijdens de spijsvertering en de daaropvolgende stappen.
Het gebruik van protease XIV verbetert faatontsluitrendement vergelijking alleen collagenase. Dit vermindert inconsistentie door collagenase batch variabiliteit, 18,24 en verhoogt de zuiverheid van cardiomyocyten onder waardoor het scheiden tijdens zwaartekracht sedimentatie. Niettemin, over-vergisting zal efficiënte gehechtheid aan de cultuur substraat, zodat een fijne balans i te voorkomens die nodig is om de cel opbrengst en zuiverheid te optimaliseren met behoud van celhechting en de levensvatbaarheid. Derhalve kan de concentratie van proteasen en de lengte van de spijsvertering worden aangepast aan de experimentele doelen passen. In het algemeen zal een geringe mate van digestie de bijlage en overleving van de cardiomyocyten verhogen. Het gebruik van trypsine is gemeld bij een aantal cardiomyocyten isolatieprocedures. 18 Toevoeging van trypsine op de protease cocktail hier gebruikte (collagenase en protease XIV) de levensvatbaarheid van de hartspiercellen in cultuur langdurige, wellicht als gevolg van over-digestie of splitsing essentiële oppervlak en / of extracellulaire matrixeiwitten.
De opname van butaandion monoxime (BDM) tijdens de isolatie remt de hartspier contractie, en vermindert de negatieve gevolgen als gevolg van terminal contractuur, energieverbruik, en de calcium paradox. 29,33 Echter, in onze ervaring, het verwijderen van BDM voorafgaand aan cultuur versnelt dedifferentiation en laat de cellen zich aanpassen aan de cultuur in twee dimensies.
Het is belangrijk op te merken dat langdurige aanpassingen aan 2-D kweek kan beïnvloeden functionele aspecten van de cardiomyocyten, zoals contractiliteit. Daarom moet contractiliteit en elektrofysiologie experimenten worden uitgevoerd kort na isolatie, wanneer natief sarcomeer organisatie nog intact. Zoals met alle in vitro experimenten, de cellen in cultuur zonder bepaalde extrinsieke invloeden die in vivo, zoals humorale immune of signalering. Anderzijds kunnen bepaalde co-culturen worden uitgevoerd om de interacties tussen cardiomyocyten en andere celtypen te bestuderen. 5,34 Ook in vitro cultuur kan worden gebruikt voor cardiomyocyten gedrag gedefinieerde moleculaire signalen in de kweek media. Daarom moet de algemene doelstellingen van het experiment zorgvuldig worden overwogen en afgewogen tegen de beperkingen en voordelen van dit kweeksysteem.
35 Opgemerkt zij dat FBS en andere van dieren afgeleide sera bevatten onbekende componenten die cellulaire fysiologie kunnen beïnvloeden . 36,37 Ondanks de zeer gewaardeerde aanwezigheid van groeifactoren in FBS, do 38 de cardiomyocyt culturen hier gepresenteerde niet vermenigvuldigen. Integendeel, de celcyclus blokkeren lijkt een aanhoudende eigenschap van volwassen muizen cardiomyocyten ex vivo behouden van de celcyclus verlaten gedurende de perinatale periode van ontwikkeling. 12,39 Deze eigenschap is van groot belang voor het gebied van cardiale regeneratieve geneeskunde, waarbij terugkeer van zoogdier hartspiercellen volwassene om een proliferatieve fenotype heeft een zwaar nagestreefd doel geweest. 3,26,40-42 bijzonder, het is momenteel onduidelijk in hoeverre dedifferentiatie vereist is voor hartspiercellen om weer in de celcyclus, maar de contribution van dedifferentiatie aan regeneratie in de lagere gewervelde dieren wordt goed ondersteund 43,44,10,11 Verder dedifferentiatie wordt steeds vaker waargenomen in cardiomyocyt proliferatie en hart regeneratie in zoogdieren systemen, ten minste op functioneel niveau, met inbegrip van myofibrillar demontage 6,12,9 Daarom moet de toestand van differentiatie van hartspiercellen in cultuur zorgvuldig overwogen en gemoduleerd volgens de behoeften van de onderzoeksdoelen. Als zodanig kunnen de kweekomstandigheden kan eventueel worden gewijzigd overeenkomstig serumconcentratie gebruik gedefinieerd serum substituten of serumvrij medium verminderen. Bijvoorbeeld, volwassen cardiomyocyten van de rat vertoont georganiseerde sarcomeren werden gekweekt op lange termijn zonder serum, maar groeifactoren zoals fibroblast groeifactor, epidermale groeifactor en triiodothyronine werden in gedefinieerde media. 45 Het is denkbaar dat soortgelijke mediumformuleringen of mogelijk andere formuleringen zoals die ontleend aan differentiatie protocollen 46 kan worden gebruikt om goed gedifferentieerde volwassen muis hartspiercellen in cultuur die goed georganiseerde structuren sarcomeer weergegeven handhaven. Alternatieve formuleringen kunnen ook worden ontwikkeld fenotypes (zoals zeer de gedifferentieerde cardiomyocyten) 6 bereiken afhankelijk van de behoeften van het experiment, maar verdere werkzaamheden nodig zijn.
De rol van de fibroblasten is betrokken bij de controle van neonatale muis cardiomyocyt celcyclus 5 en volwassen muizen cardiomyocyten differentiatie (door middel van hypertrofische IL6 signalering) in de lange termijn cultuur. 19 Vandaar dat de groei van de fibroblasten in de cultuur moet worden verantwoord in de experimentele interpretaties . De groei van fibroblasten in kweek kan worden geregeld door toevoeging van groei beperken verbindingen zoals cytosine arabinoside 19 (AraC) of met pre-plating stappen. 28 echter AraC ook groei van cardiomyocyten remmen, zodat alternatievemethoden worden gebruikt om de groei van fibroblasten in onderzoek naar de cardiomyocyt celcyclus controleren. In de hier beschreven protocol, kan de eerste cardiomyocyt zuiverheid worden verhoogd door het herhalen van de zwaartekracht sedimentatie stap (zie 1.4.8).
De werkwijzen bieden daarbij een in vitro systeem dat kan worden gebruikt om de aard van volwassen zoogdieren cardiomyocyt celcyclus blokkade bestuderen. In tegenstelling tot primaire cellen van andere organismen, zoals ratten of cavia, primaire muis cardiomyocyten bieden een schat aan krachtige en goed gekarakteriseerde genetische hulpmiddelen, zoals Cre-based lineage tracing knock-in modellen, 47 die kan worden gebruikt om eenvoudig identificeren cellen afkomstig van bestaande hartspiercellen. 12,48 Daarnaast zijn primaire cardiomyocyten volwassen muizen blootgesteld aan de natuurlijke ontwikkeling die leiden tot celcyclus blokkade tegenstelling cellijnen en gedifferentieerde ES, iPSC cellen 46 die, ondanks hun convenience en aanpasbaarheid aan grote drug schermen, kan 2 beperkt nut in experimenten sonderen van de aard van de volwassen cardiomyocyt celcyclus exit te hebben.
Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode te isoleren en cultuur volwassen muis hartspiercellen. Verschillende werkwijzen eerder aangetoond de isolatie van volwassen muizen cardiomyocyten op korte termijn studie, maar tot dusver weinig rapporten bestaan uit de langdurige kweek van volwassen muizen cardiomyocyten. 18-19 De mogelijkheid om volwassen muis hartspiercellen handhaven in kweek moet inschakelen de in vitro studie van de cardiomyocyt biologie onder experimentele omstandigheden die langdurige onderzoek. Zo kan genexpressie worden gemanipuleerd met adenovirusvectoren, die typisch vereist enkele dagen volledig tot uitdrukking komen. Latere fenotypische veranderingen en analyse kan nog langere tijd vergen, afhankelijk van de experimentele doelen. De hier gepresenteerde methoden is het mogelijk de cultuur van volwassen muis cardiomyocytes voor enkele weken. Dit zou een krachtig systeem voor het onderzoeken van voorzichtige vragen in cardiomyocyten biologie, zoals die met betrekking tot regulatie van de celcyclus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de UCSF Program for Breakthrough Biomedisch Onderzoek (deels gefinancierd door de Sandler Foundation), de NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738), en de Edward Mallinckrodt Jr Foundation. JJ werd ondersteund door een postdoctorale beurs van de NIH (T32HL007731). De auteurs zijn zelf verantwoordelijk voor de inhoud van dit werk, dat niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH vertegenwoordigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
