Abstract
Cardiomyocytes cultivés peuvent être utilisées pour étudier la biologie des cardiomyocytes en utilisant des techniques qui sont complémentaires des systèmes in vivo. Par exemple, la pureté et l' accessibilité de la culture in vitro permet un contrôle précis sur les analyses biochimiques, l' imagerie en direct, et l' électrophysiologie. la culture à long terme des cardiomyocytes offre un accès à des approches expérimentales supplémentaires qui ne peuvent être accomplies dans les cultures à court terme. Par exemple, l'enquête in vitro de dédifférenciation, cycle cellulaire rentrée, et la division cellulaire a jusqu'ici été largement limitée à des cardiomyocytes de rat, qui semblent être plus robuste dans la culture à long terme. Cependant, la disponibilité d'un riche ensemble d'outils de lignées de souris transgéniques et des modèles de maladies bien développés rendre les systèmes de souris attrayant pour la recherche cardiaque. Bien que plusieurs rapports existent d'isolement des cardiomyocytes de souris adulte, peu d'études démontrent leur culture à long terme. Présenté ici, est une méthode étape par étape pour lel'isolement et la culture à long terme des cardiomyocytes de souris adultes. Tout d'abord, rétrograde perfusion Langendorff est utilisé pour digérer efficacement le cœur avec des protéases, suivie d'une purification gravité de sédimentation. Après une période de dédifférenciation isolement suivant, les cellules se fixent peu à peu à la culture et peuvent être cultivées pendant des semaines. lysat cellulaire adenovirus est utilisé pour transduire efficacement les cardiomyocytes isolés. Ces méthodes fournissent un système de modèle simple, mais puissant pour étudier la biologie cardiaque.
Introduction
Cardiomyocytes Cultured sont fréquemment utilisés pour surveiller le comportement des cellules dans un environnement bien contrôlé in vitro. Par exemple, les propriétés morphologiques, électriques, biochimiques ou mécaniques cellules peuvent être étudiés sur des substrats modifiés, le 1,2 dans des milieux définis, et en réponse aux médicaments à petites molécules, des peptides, la régulation des gènes, 3 ou une stimulation électrique. 4 Le contenu cellulaire peut également être contrôlés à l' aide de co-cultures définies. 5 Ces expériences in vitro sont utiles dans un grand médicament ou écrans génétiques et complètent les méthodes in vivo pour divers types d'enquêtes portant sur des cardiomyocytes biologie.
la culture à long terme permet avenues expérimentales qui nécessitent des périodes de temps prolongées pour obtenir un changement phénotypique. Un exemple approprié est celui de la prolifération des cardiomyocytes adultes chez les mammifères, où la dédifférenciation, le cycle cellulaire rentrée, et la division cellulaire est typiquement étudiées sur soijours veral à quelques semaines. 6,7 Ici, le temps de culture étendue facilite la manipulation génétique, 7,8 dédifférenciation fonctionnelle (par exemple, le démontage sarcomère) 9 et dédifférenciation potentiellement transcriptionnelle. 6 Après cycle cellulaire ré-entrée et la division cellulaire nécessite des périodes de culture encore plus longues d'observer, en particulier si plusieurs cycles de division sont le but expérimental. L'importance de la cellule-cycle de cardiomyocytes est au cœur de plusieurs ouvrages scientifiques clés récents dans la régénération du cœur, où la dédifférenciation et la prolifération des cardiomyocytes préexistantes a été montré responsable de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre et la souris néonatales. 10-12 Ainsi, la possibilité pour stimuler la dédifférenciation et cycle cellulaire ré-entrée dans les cardiomyocytes adultes de mammifères reste une question clé dans la régénération du cœur humain 13-15
I n expériences in vitro l' étude du cycle cellulaire chez les mammifères des maladies cardiomyocytes ont principalement utilisé des sources de rat, en raison de leur relative facilité de culture à long terme par rapport aux modèles de souris. 16 Cependant, les systèmes murins offrent une riche source d'outils transgéniques bien caractérisés et des modèles de maladies qui sont utiles à la fois in vitro et in vivo , protocoles. Par exemple, le traçage de la lignée à base de Cre a permis l'identification des cardiomyocytes préexistantes comme une source de régénération du myocarde dans le coeur de la souris néonatale in vivo. 12 Les études in vitro de cardiomyocytes de souris néonatales lignagères tracé ont permis l'examen des interactions avec stromal cellules par le biais de co-culture avec des fibroblastes. 5 Cependant, en raison de ses défis, 17 quelques rapports existent de l'isolement et à long terme la culture de cardiomyocytes de souris adultes 18,19.
L'isolement des cardiomyocytes de souris adultes viables pour la culture à court terme seul est connu pour être une tâche difficile. Cette protocol fournit étape par étape les instructions sur la façon d'atteindre cardiomyocytes viables de souris adultes qui peuvent être utilisés à la fois à court terme, ainsi que des enquêtes à long terme. Cardiomyocytes isolés en utilisant ce protocole peuvent être efficacement transduites avec des vecteurs adénoviraux 20,21 et cultivés pendant des semaines. Ces méthodes fournissent un système puissant pour étudier la biologie des cardiomyocytes in vitro.
Les procédés décrits ici sont basés sur plusieurs éléments de travaux antérieurs utilisant des variations de la perfusion rétrograde Langendorff. 18,22 Bien que plusieurs protocoles ont été publiés sur l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes pour la culture à court terme et à l' étude, l'avantage de 23-25 ce protocole est la capacité de la culture des cardiomyocytes isolés à long terme. Ceci sera utile dans l'étude des processus cellulaires impliquant l'expression des gènes extra-utérine et nécessitant des périodes de temps prolongées, par exemple dans les stratégies de reprogrammation cellulaire.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par l'utilisation et l'entretien Commission institutionnelle animale de l'Université de Californie, San Francisco.
NOTE: En bref, après avoir extrait le coeur du thorax de la souris, une perfusion rétrograde coronaire est utilisée pour digérer efficacement la matrice extracellulaire avec de la collagénase et la protéase XIV. Les ventricules sont ensuite isolés mécaniquement dissociées et filtré en une seule suspension cellulaire. la sédimentation par gravité est effectuée pour isoler les cardiomyocytes qui sont séparés à partir de cellules stromales telles que les fibroblastes et les cellules endothéliales par leur haute densité. Les cardiomyocytes purifiés peuvent être cultivées pendant des semaines sur polystyrène laminine enduit et transduction avec des vecteurs de gènes de l'adénovirus.
1. cardiomyocytes Isolation
- Préparer Tampons, Station chirurgicale et Perfusion Appareil
- Préparer des tampons et des médias selon Table 1.
- Allumez bain à circulation d'eau, régler la température d'entrée de telle sorte que la sortie de la chemise d'eau chauffée atteint une température de 37 ° C.
- Propre système de perfusion par rinçage avec 70% d'éthanol. Ensuite, retirer toutes les traces d'éthanol à partir du système par rinçage avec plusieurs volumes d'eau stérile.
- Charger le système de perfusion avec le tampon de perfusion (tableau 1). l'eau d'abord de vidange du système, puis rincer avec 2 volumes de tampon de perfusion. Ensuite, remplir l'espace mort avec un tampon de perfusion de telle sorte que la colonne intérieure de la chemise de chaleur est rempli avec le tampon de perfusion, mais la chambre d'élimination de bulles est vide.
CONSEIL: Assurez -vous pas de bulles d'air sont présentes dans la ligne en dessous de la chambre de débullage. Pour éliminer les bulles récalcitrants, engager tous les robinets et laisser la pression de construire à l'intérieur de la ligne pendant quelques secondes. Puis relâcher le robinet d'arrêt inférieur, ce qui permet la perfusion du tampon à haute pression à jet provenant de la sortie; l'écoulement rapide et Turbulence va aider à déloger les bulles qui sont capturés près de la sortie de perfusion. - Préparer une seringue avec une aiguille à utiliser pour la canulation de l'aorte. Joindre une aiguille émoussée 18 G à une seringue de 1 ml rempli avec un tampon de perfusion. Retirer les bulles d'air et fixer l'ensemble de seringue à un bras de l'illuminateur dissection de Miscroscope avec du ruban de laboratoire.
ASTUCE: Pour créer une aiguille à extrémités franches d'une aiguille biseautée, transect la tige d'aiguille avec des pinces coupantes. Puis parfaire la pointe avec une pierre de ponçage jusqu'à ce que la pointe est plate.
REMARQUE: Pour réduire le glissement de l'aorte de l'aiguille lors de cathétérisme, poncer l'arbre de l'aiguille de ponction à l' aide d' une lame de rasoir. Fixer l'aiguille par le moyeu et l'arbre supérieur, puis a vu le rasoir avant et en arrière perpendiculaire à l'axe de l'arbre de l'aiguille en tournant jusqu'à ce que plusieurs rainures ont été créées au sein de 1 cm de la pointe de la tige d'aiguille. Basculer vers un nouveau rasoir lorsque la lame devient terne. - Placez un nettoyageboîte de Pétri en dessous du microscope à dissection pour contenir le coeur pendant la canulation. Positionner le bras d'illumination de telle sorte que la pointe de la canule se trouve près du bord du champ de vision, mais ne gêne pas la dissection. Veiller à la pointe de la canule est en dessous du rebord de la boîte de Pétri.
NOTE: Pour aider à immobiliser le coeur lors de la dissection, placez un petit (~ 5-7 cm 2) carré de 215 micromètres dans la boîte de Pétri. Quand le cœur est placé sur ce maillage, il va créer la friction pour réduire de glissement et de rotation du cœur lors de la manipulation mécanique. - Attacher 2 points de suture avec lâche doubles noeuds renversés autour du moyeu de l'aiguille de canule à utiliser pour la fixation de l'aorte.
- Extraction Coeur et Cannulation
- Administrer l'héparine (5 IU / g de poids corporel) par injection intrapéritonéale. Attendre 20 min pour permettre à l'héparine de circuler vers le cœur.
- Anesthetize la souris par injection intrapéritonéaleion de carbamate d'éthyle à 20% (2 mg carbamate d'éthyle / g de poids corporel). Observer attentivement jusqu'à ce que la souris est sous anesthésie profonde (environ 3-5 min).
NOTE: L' anesthésie profonde est confirmée par un manque à la fois de pincement de l' orteil et les réflexes de la cornée. Si la souris n'a pas atteint l'anesthésie profonde de 8 - 10 min, puis administrer une dose supplémentaire de carbamate d'éthyle. Bien que les réponses individuelles à l'anesthésie varient entre les souris, le défaut d'entrer anesthésie profonde lors de la première dosage peut indiquer carbamate d'éthyle dégradé, ce qui peut empêcher l'anesthésie profonde même dosage répétée. Pour éviter la dégradation, préparer une solution fraîche de carbamate d'éthyle avant chaque utilisation. - Immobiliser la souris vers la plate-forme de la chirurgie en fixant chaque branche avec du ruban adhésif chirurgical. Désinfecter la zone d'incision avec une quantité généreuse de 70% d'éthanol. Pat sécher avec un laboratoire essuyez.
- Soulever la peau avec des pinces de tissu juste en dessous du sternum. Faire une incision latérale avec de petits ciseaux, coupe through la peau et de l'abdomen.
- Utilisez hémostatiques pour soulever délicatement la cage thoracique via le sternum. Utilisation de petits ciseaux de dissection, étendre l'incision dans une forme de V vers les aisselles. Couper à travers la première côte et à la perforation de la membrane de chaque côté.
- Continuer de soulever la cage thoracique avec hémostatiques et utiliser de petits ciseaux à iris à sectionner complètement le diaphragme. Prenez soin de ne pas percer le cœur.
- Rentrez la cage thoracique en utilisant rostrale hémostatiques attachés et rapidement, mais étendre soigneusement l'incision en forme de V en coupant à travers la cage thoracique vers les aisselles des deux côtés. Dégager la partie centrale de la cage thoracique pleinement et fixer les hémostatiques attachés à maintenir en place.
- Retirer le péricarde en utilisant une pince fine.
- Tout en soulevant doucement le cœur à l'aide des pinces courbes, sectionner les veines et les artères attachées au cœur. Placer immédiatement le cœur dans un tampon de perfusion glacé pour ralentir la contraction musculaire.
- Placez le coeur dans une boîte de Pétri sousun microscope de dissection (lieu sur un petit morceau de 215 um mesh pour aider à immobiliser pendant la dissection). Coupez tous les tissus non-cardiaque en excès à l'aide d'iris ciseaux fins. Faites preuve de prudence lors de la coupe près de l'aorte.
- Transect l'aorte à proximité de l'artère brachioencephalic, et de prendre soin de ne pas laisser des bulles ou des débris de tissu entrent dans l'ouverture.
- Remplir la boîte de Pétri contenant le coeur de la glace avec du tampon de perfusion à froid de telle sorte que le niveau de liquide monte au-dessus de l'ouverture de la canule. Gaine l'aorte sur la canule de telle sorte que la pointe est juste en aval de la valve aortique.
ASTUCE: Pour réduire le risque d'embolie gazeuse, légèrement enfoncer la seringue sur la canule avant cathétérisme afin d'éliminer les bulles d'air qui peuvent éventuellement être développées à l'extrémité de la canule. En outre, maintenir la pointe de la canule et l'aorte sous la surface de la solution pour éviter d'introduire des bulles tout en gainant l'aorte. - Faites glisser un pré-attaché 7-0 suture de soie vers le basl'arbre de l'aiguille de ponction et la position juste au-dessus de la pointe de l'aiguille. Serrer le noeud avec une pince fine. Répétez cette étape avec une deuxième suture placée juste au-dessus du premier.
REMARQUE: Vérifiez que la pointe de l'aiguille est toujours au- dessus de la valve aortique avant et après le serrage. - abaisser lentement la seringue pour éjecter 0,5 ml de tampon de perfusion à travers le système vasculaire coronaire.
NOTE: Si le cathétérisme a réussi, le sang sera visualisé en laissant la vasculature coronaire et la mise en commun sur les veines et les artères dorsales.
IMPORTANT: Le temps d'ouverture de la cavité thoracique (en particulier, la perforation de la membrane) initiale de perfusion doit être réduit au minimum pour réduire l' exposition hypoxique et de maximiser la survie et la santé des cardiomyocytes isolés. Idéalement, ce temps doit être inférieur à 5 min.
- perfusion
NOTE: La perfusion rétrogradeappareil peut être facilement utilisé dans un environnement propre sur une paillasse de laboratoire standard ou placé dans une hotte à flux laminaire afin de maximiser la stérilité. Cependant, après la perfusion est terminée, le travail doit être effectué sous flux laminaire pour minimiser la contamination.- Doucement mais fermement retirer le moyeu de canule de la seringue (en utilisant des gants stériles) en tournant lentement en arrière. Tout en tirant l'aiguille de canulation hors de la seringue, éjectez lentement tampon de perfusion dans le moyeu de l'aiguille afin d'éviter les bulles d'air pendant la perfusion.
- Retirer le tube de recirculation de capture de dessous de l'orifice de sortie de perfusion et le remplacer par un bécher de déchets de capture. Fixez le moyeu d'aiguille à l'adaptateur luer qui est fixé à l'orifice de sortie de perfusion (figures 1, 2) sur la chemise d'eau, alors que la pompe est en marche au réglage le plus bas (15 RPM, ~ 6 ml / min).
CONSEIL: Lors du raccordement du moyeu de l' aiguille à l'adaptateur luer, laissez le tampon de perfusion égouttement pour connectez au liquide dans le moyeu de l'aiguille afin d'éviter l'introduction de bulles. - Perfuser le cœur sans recirculation jusqu'à 8 ml de tampon de perfusion ont été aspiré par le tuyau d'arrivée.
NOTE: Le volume de tampon de perfusion aspiré par le tuyau d'arrivée à cette étape suppose un volume mort de 7 ml pour le système de perfusion, donnant un total de 15 ml de tampon de perfusion pompés à travers le cœur. - Retirer le tube d'entrée du tampon de perfusion. Permettre à l'air d'être aspiré par l'orifice d'entrée pour moins que le volume mort du système.
NOTE: Le volume d'air aspiré dans cette étape doit être ajustée pour empêcher l' air de pénétrer dans la vasculature coronaire (voir étape 1.3.7). - Placer le tube d'entrée dans le tampon de digestion (Tableau 1), juste au- dessus du fond du tube. Nourrir lentement et laisser le tube d'entrée pour aspirer un volume suffisant pour éviter le débordement du tube.
- Visualiser et suivre la bulle d'air entrele tampon de perfusion et le tampon de digestion qui se déplace à travers la chemise de chaleur. Observer le niveau de tampon de perfusion dans le centre de la veste de chaleur commence à baisser une fois que la bulle d'air atteint la chambre de de bullage. Une fois que le tampon de digestion atteint la chambre d'élimination de bulles, le niveau de liquide dans l'enveloppe de chaleur restera stable.
IMPORTANT: Si le niveau de tampon de perfusion descend trop bas, fermer le robinet de sortie et ouvrir le robinet de purge. Laisser le niveau pour élever à un niveau confortable (3 - 5 pouces au-dessus du port de sortie). Ensuite, arrêter la pompe de perfusion et de fermer le robinet de purge. Ouvrir le robinet d'orifice de sortie et remettre en marche la pompe de perfusion. - Regardez la solution sortant du coeur. Comme le dernier de la mémoire tampon de perfusion quitte le cœur et le tampon de digestion commence à circuler à travers le cœur, le changement de couleur du clair au brun clair sera observée en raison de la présence de collagénase.
- Perfuser le cœur avec un tampon de digestionenviron 10 - 15 min. Le cœur va commencer affalé comme le collagène est dégradé et il perd le soutien mécanique.
- Dissociation et purification mécanique
- Retirer le cœur de la canule avec une pince et les placer dans une boîte de Pétri sec. couper rapidement les tissus extra-ventriculaire en utilisant l'iris ciseaux fins. Transférer les ventricules dans un plat contenant perfusion tampon Pétri frais pour se laver. Déplacer la boîte de Pétri à une hotte stérile et transférer les ventricules à une boîte de Pétri frais, sec.
- Recueillir 7,5 ml de tampon de digestion de la veste de feu et ajouter 2,8 pi de 1 M CaCl 2, mélanger par inversion. Ajouter 2 - 3 ml de tampon de digestion avec CaCl 2 pour les ventricules dans la boîte de Pétri.
Remarque: la concentration de Ca 2+ est augmentée de 300 à 700 pM - Triturer rapidement le tissu ventriculaire avec une pince fine, de sorte que la plupart des pièces sont plus petites que 1 mm 3. Ajouter le restetion tampon de digestion Ca 2+ complété de l' étape 1.3.2 vers les ventricules dissociées dans la boîte de Pétri et mélanger par agitation douce.
- Placer la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Agiter la boîte de Pétri toutes les 2 min jusqu'à ce que les cardiomyocytes suffisantes (voir note ci-dessous) ont été libérés du tissu.
NOTE: La durée d'incubation peut avoir besoin d'être ajustée pour affiner le degré de digestion selon les besoins de l'expérience. En général, de plus longs temps d'incubation augmente le rendement et la pureté, mais ils peuvent réduire le taux de fixation des cellules et la survie. 5 - 10 minutes est généralement suffisante pour obtenir un rendement élevé (~ 5 - 10 x 10 5 cellules par cœur). - Transférer la boîte de Pétri retour à une hotte à flux laminaire. En utilisant une pipette de transfert coupé à un angle de 45 °, délicatement la pipette le tissu à dissocier davantage.
- Utiliser des gants stériles pour plier la maille 215 um dans un cône et maintenez sur un 50 ml conique. Pipettela suspension de tissu dissocié sur le maillage et laisser le filtrat se vidanger dans les 50 ml conique. En utilisant 7,5 ml de tampon d'arrêt préchauffée (tableau 1) pour laver les cardiomyocytes à partir de la boîte de pétri à travers les mailles, se combinant avec le premier filtrat.
REMARQUE: Ca2 + est augmentée à 1,1 mM et finale finale de SBF à 2,5% dans le tampon d'arrêt neutralise l' activité de la protéase. - Transférer la suspension cellulaire à 15 ml conique et laisser reposer par gravité pendant 15 min.
- Retirez délicatement le surnageant avec une pipette de transfert de telle sorte que seulement 50 - 100 pi de solution reste au-dessus des cellules. Ajouter 10 ml de, médias préchauffée équilibrée culture (tableau 1) et mélanger par inversion douce. Autoriser les cardiomyocytes à régler par gravité pendant 15 min.
ASTUCE: Pour augmenter la pureté, répétez l' étape 1.4.8 comme souhaité. - Retirez délicatement le surnageant avec une pipette de transfert de telle sorte que seulement 50 - 100 pi osolution f reste au-dessus des cellules.
2. cardiomyocytes Culture
- Pré-coat culture tissulaire traité boîtes de Pétri avec laminine (10 pg / ml) et conserver à 37 ° C pendant 2 heures avant le placage des cellules. Juste avant le placage, aspirer la solution de laminine à partir de la plaque de culture tissulaire. Laver une fois avec du MEM ou PBS, puis aspirer le liquide résiduel pour éliminer la laminine non adsorbé.
- Ajouter pré-chauffé, les milieux de culture équilibrée suffisante pour atteindre la densité cellulaire désirée, mélanger par inversion douce. Plaque de concentration désirée de cellules dans le récipient de culture (typiquement 5 - 20 x 10 4 cellules / cm 2). Pour évaluer le rendement de l'isolement des cardiomyocytes, compter les cellules via hématimètre ou un test-plaque en vérifiant la densité sous un microscope. Un coeur de souris adulte fournit typiquement 0,5 - 1,0 x 10 6 cellules à ce stade du protocole.
ASTUCE: Si vous utilisez des plaques à 96 puits, utiliser un micropip 1000 piette avec une pointe coupée à un angle de 45 ° pour minimiser les dommages cellulaires en raison de force de cisaillement. Placer la pointe de la pipette de telle sorte qu'elle touche le fond du puits lors de l'éjection de la suspension cellulaire afin de minimiser l'introduction de bulles. - Déplacer la boîte de culture cellulaire rapidement à un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 et 95% d' humidité. Changer les médias au besoin pour empêcher l'acidification: tous les 1 - 5 jours en fonction de la densité cellulaire. Minimiser la manipulation de la boîte de culture pendant les 3 premières - 6 jours pour faciliter la fixation à la surface de la culture cellulaire.
NOTE: Pour minimiser les perturbations de la cellule lors des changements des médias lorsque les cellules ne sont pas entièrement fixé, effectuer un changement de demi-médias. Aspirer lentement les médias tout en gardant la pointe de la pipette juste en dessous de la surface du support. Puis ajouter lentement les médias supplémentaires en gardant la pointe de la pipette juste au-dessus de la surface du support contre la paroi de la boîte de culture. - Pour évaluer la viabilité des cardiomyocytes, consultezla morphologie en microscopie à fond clair. Fraîchement cardiomyocytes isolés maintiennent une morphologie plus ou moins en forme de tige avec des bords tranchants distincts sous éclairage en fond clair (Figure 2).
REMARQUE: Confirmer la viabilité par coloration des cellules avec du bleu trypan. - Pour évaluer la pureté de l'isolement des cardiomyocytes, vérifier la morphologie des cellules pour identifier les cardiomyocytes. Colorer les noyaux avec Hoescht 33342 pour identifier les cellules totales.
NOTE: Les cardiomyocytes peuvent être identifiés à partir de non-cardiomyocytes par leur morphologie caractéristique (en forme de tige) et la taille (environ 100 - 200 mm de longueur). Alternativement, les cardiomyocytes fraîchement isolés tacher positifs pour les marqueurs spécifiques de cardiomyocytes, tels que l' alpha-actinine 26 (figure 3C, D) ou cardiaque troponine T. 27
3. Gene Transduction avec un adenovirus
- Préparer lysat cellulaire adénovirus utilisant m établieéthodes. 21 transduire les cardiomyocytes utilisant lysat cellulaire à partir de cellules productrices d'adénovirus 10. Au jour 0 ou 1 jour après l'isolement, ajouter avec précaution le lysat cellulaire à un milieu contenant les cardiomyocytes.
NOTE: Une préparation d'adénovirus à titre élevé permettra d' atteindre une forte expression dans environ 48-72 h. Adapter la multiplicité d'infection en fonction de la conception expérimentale.
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Representative Results
Un type sauvage adulte ICR (CD1) coeur de la souris donne généralement de 500.000 à 1 million de cardiomyocytes provenant d'un isolement réussi. Immédiatement après l' isolement, les cellules conservent une apparence essentiellement en forme de tige (figure 3A) avec des sarcomères intacts et peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles portant sur la contractilité des cardiomyocytes. Un pourcentage élevé de cardiomyocytes en forme de tige (au-dessus de 90%) est une indication de la perfusion et la digestion efficace. Cardiomyocytes Viable sera grande (~ 100 - 200 mm de longueur) et semblent avoir une membrane extérieure nette sous un éclairage en fond clair (figure 3A). Immunocoloration pour les marqueurs sarcomériques spécifiques cardiomyocytes, tels que l' alpha-actinine, se traduira par un motif de bandes sarcomère distinctes (figure 3C). En conjonction avec une analyse morphologique et une coloration nucléaire avec DAPI, immunocoloration peut être utilisé pour évaluer la pureté des cardiomyocytes isolés. Fibroblasts sera petite et ronde juste après l'isolement, mais vont rapidement attacher et répandre mince sur culture cellulaire en plastique, permettant ainsi la distinction facile de cardiomyocytes.
Un faible pourcentage de cardiomyocytes en forme de tige est une indication d'une isolation sans succès. Cela peut résulter d'un défaut de canuler rapidement l'aorte après que le cœur est extrait de l'animal. perfusion Inefficace, en raison de l'embolie gazeuse ou cathétérisme incorrect par exemple, peut aussi influer sur la morphologie et la viabilité des cardiomyocytes.
Après plusieurs jours de culture, les cardiomyocytes prennent une morphologie arrondie (figure 3B). Dans 1 - 2 semaines, les cardiomyocytes vivants se fixent au substrat et commencent épandeur (figure 3D, E). Les cellules mortes peuvent être identifiés par l'inclusion du bleu trypan. Un isolement et la culture réussie donneront environ 50% de cardio en directmyocytes après 1 semaine. La contamination par des non-cardiomyocytes, tels que les fibroblastes se traduira par une forte proportion de ces cellules en culture plus tard en raison de leur potentiel prolifératif. Ceci peut être évité en augmentant le nombre de sédimentations de la gravité et / ou par pré-revêtement pour augmenter la pureté 28.
Transduction avec un adenovirus peut être utilisé pour obtenir l' expression de gènes forte au sein 48-72 h (figure 3E). Adenovirus serotype 5 est efficace à transduction cardiomyocytes de souris adulte in vitro en raison de la forte expression du récepteur de coxackie adénovirus, mais peut dépendre du type de support utilisé. 20
Figure 1. cardiomyocytes Isolation Équipement et Instrumentation. (A) Les instruments chirurgicaux utilisés pour extraire la souriscoeur et Cathétériser l'aorte, de haut en bas: hémostatiques, pinces de tissus, pinces courbes, Dumont # 5 pinces fines, de petits ciseaux de dissection, iris fines ciseaux, ciseaux fins squeeze (B) Le système de perfusion Langendorff utilisé pour digérer le cœur de la souris. . des tampons de perfusion sont aspirés à travers le tube d'entrée (1) par la pompe de perfusion (2) et à travers le tube de sortie de la pompe (3) dans l'orifice d'entrée de la chemise d'eau chauffée (4). Les tampons de perfusion sont réchauffées par la chemise d'eau chauffée lorsqu'ils se déplacent à travers le tube de verre en spirale, la chambre d'élimination de bulles, puis sur l'aiguille d'une canule fixée à l'orifice de sortie de perfusion (5) qui est reliée par un robinet d'arrêt. Le tube conique en dessous attrape les tampons de perfusion, qui sont remis en circulation à travers le tube d'entrée. L'orifice de pression (6), le port de compliance (7) et d'évacuation (8) reste fermé pendant la perfusion afin de maintenir un débit constant. La chemise d'eau est chauffé par un bain d'eau circulant à travers l'entrée el'entrée e de la chemise (9) et de sortie (10) orifices. Un stand d'anneau est utilisé pour maintenir la veste chauffée de l' eau dans une position verticale (pinces rouges, base noire au- dessous du support de tube conique violet). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma Vue d'ensemble du système de perfusion. Parties importantes de l'appareil de perfusion sont étiquetés comme Mentionné dans le manuscrit. Le sens d'écoulement du tampon de perfusion est indiqué par des flèches. Notez le positionnement de la canule aortique, dont la pointe doit être visible à travers l'aorte translucide, assurant qu'il est placé au- dessus de la valve aortique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Isolated souris adultes cardiomyocytes. Cardiomyocytes ont été isolés et ensemencée sur laminine-Coated plaques à 96 puits comme décrit dans le Protocole Ici. (A) cardiomyocytes fraîchement isolées, épépinées à environ 8000 cellules / cm2. A noter que les cardiomyocytes fraîchement isolés, viables, apparaissent sensiblement en forme de tige avec des arêtes vives (flèche blanche). Cependant, les cardiomyocytes qui semblent avoir une membrane externe diffuse sous fond clair sont morts. Au cours des premiers jours de culture, les cardiomyocytes prennent une forme arrondie (B). (C) immunocoloration pour l' alpha-actinine (vert) révèle caractéristique des bandes de sarcomère dans un cardiomyocytes au post-isolement d1. tache nucléaire (DAPI) en bleu. L' image de la région décrite Top shows zoomé image inférieure. (D) (E) Brightfield et images épifluorescence montrent cardiomyocytes au jour 11 post-isolement transduite avec l' adénovirus portant un rapporteur GFP sous le contrôle d'un promoteur de CMV ( un cadeau de Robert Gerard à l'UT Southwestern). Les cellules ont été ensemencées à raison d' environ 18 000 cellules / cm2 et ont été transduites au jour 0 en utilisant une multiplicité d'infection d'environ 800 unités formant des plaques (PFU) par cellule. Barres d'échelle:. 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Tampon d'isolement de cardiomyocytes (CIB) | |||
| Ajouter 900 ml d'eau ultrapure dans un bécher propre sous magagitation Netic. | |||
| Ajouter les composants du tampon dans le tableau comme indiqué. | |||
| Composant | MW | Conc finale (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58.44 | 120 | 7.013 |
| KCl | 74.55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 O 2 HPO4.7H | 268,07 | 0,33 | 0,088 |
| MgSO 4 7H 2 O | 246,48 | 0,5 | 0,123 |
| taurine | 125,1 | 30 | 3.753 |
| BDM | 101,1 | dix | 1.011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5.958 |
| Glucose | 180.16 | 22 | 3.964 |
| Ajustez l'esprit de pHh 5 M de NaOH. | |||
| Réglez le volume à 1 L avec de l'eau ultrapure. | |||
| Filtre stérile w / 0,22 uM filtre à vide. | |||
| Ajouter 0,5 pi de 0,1 U / ml d'insuline par litre de tampon d'isolement des cardiomyocytes. | |||
| Un tampon de perfusion | |||
| Composant | Final | Volume (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4M) | 0,4 mM | 0,2 | |
| Total | - | 200 | |
| Tampon Digestion | |||
| Composant | Final | Montant | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1M) | 300iM | 4,5 pi | |
| Protease XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| collagénase II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Total | - | 15 ml | |
| tampon d' arrêt | |||
| Composant | Final | Volume (ml) | |
| un tampon de perfusion | 95% | 14.25 | |
| CaCl2 (1M) | 1,5 mM | 22.5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Total | - | 15 ml | |
| Média culturel | |||
| Composant | finale% | Volume (ml) | |
| MEM médias | 90% | 90 | |
| FBS | dix% | dix | |
| Primocin | 0,2% | 0,2 | |
| Total | 100% | 100 ml | |
| Permettre aux milieux de culture à équilibrer à 37 ° C, 5% de dioxyde de carbone. | |||
Tableau 1: Solutions et tampons.
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Discussion
La santé globale des cardiomyocytes isolés dépend de plusieurs aspects importants de ce protocole. Tout d'abord, le temps depuis l'extraction du coeur de la perfusion est critique et doit être effectuée en 5 minutes ou moins. L' élimination du calcium contribue à dissocier les interactions cellule-cellule, mais peut avoir un impact négatif sur la santé des cellules à long terme. 29-32 Ainsi, nous trouvons qu'il suffit d'enlever le calcium pendant les quelques minutes initiales de perfusion par EGTA (éthylène glycol acide tétraacétique) chélation, 22 mais rapidement restaurer le calcium lors de la digestion et les étapes ultérieures.
L'utilisation de protéase XIV améliore considérablement l'efficacité de la digestion par rapport à la collagénase seule. Cela réduit l' incohérence due à la collagénase batch variabilité, 18,24 et augmente la pureté des cardiomyocytes en facilitant la séparation pendant la sédimentation par gravité. Néanmoins, sur-digestion va empêcher la fixation efficace au substrat de culture, donc un équilibre délicat is requise pour optimiser le rendement et la pureté des cellules tout en maintenant l'attachement des cellules et leur viabilité. Ainsi, la concentration de protéases et de la durée de la digestion peut être modifiée pour convenir aux buts expérimentaux. D'une manière générale, dans une moindre mesure de la digestion améliorera la fixation et la survie des cardiomyocytes. L' utilisation de la trypsine a été rapporté dans certains protocoles d'isolement des cardiomyocytes. 18 Cependant, l' addition de trypsine au cocktail de protéase utilisé ici (collagénase et de la protéase XIV) réduit la viabilité à long terme des cardiomyocytes en culture, peut - être due à une sur-digestion ou le clivage de la surface essentielle et / ou des protéines de la matrice extracellulaire.
L'inclusion de butanedione monoxime (BDM) lors de l' isolement inhibe contraction du muscle cardiaque, et réduit ainsi les conséquences négatives dues à la contracture terminal, la dépense d'énergie, et le paradoxe de calcium. 29,33 Cependant, dans notre expérience, l' élimination des BDM avant la culture accélère dedifferentiation et permet aux cellules d'adaptation à la culture en deux dimensions.
Il est important de noter que les adaptations à long terme à la culture 2-D peut affecter les aspects fonctionnels des cardiomyocytes, comme la contractilité. Ainsi, les expériences de contractilité et d'électrophysiologie doivent être effectuées peu de temps après l'isolement, lorsque l'organisation sarcomère native est toujours intacte. En outre, comme pour toute expérience in vitro, les cellules en culture sont dépourvues de certaines influences extrinsèques présentes in vivo, telles que la signalisation immunitaire humorale ou. D'autre part, les co-cultures définies peuvent être mises en œuvre pour étudier les interactions entre les cardiomyocytes et d' autres types de cellules. 5,34 En outre, la culture in vitro peut être utilisé pour étudier le comportement des cardiomyocytes avec des signaux moléculaires définis dans les milieux de culture. Ainsi, les objectifs généraux de l'expérience devraient être soigneusement examinés et évalués par rapport aux limitations et avantages de ce système de culture.
35 Il convient de noter que de FBS et d' autres sérums d'origine animale contiennent des composants inconnus qui peuvent affecter la physiologie cellulaire . 36,37 Malgré la présence très appréciée des facteurs de croissance dans FBS, 38 les cultures de cardiomyocytes présentées ici ne prolifèrent pas. Au contraire, le bloc du cycle cellulaire semble être une propriété persistante de cardiomyocytes de souris adultes ex vivo, maintenue depuis leur sortie du cycle cellulaire pendant la période périnatale du développement. 12,39 Cette propriété est d' un intérêt majeur dans le domaine de la médecine régénérative cardiaque, où réversion de cardiomyocytes de mammifères adultes à un phénotype prolifératif a été un objectif fortement poursuivi. 3,26,40-42 Notamment, il est actuellement difficile de ce dédifférenciation degré requis pour cardiomyocytes de réintégrer le cycle cellulaire, mais le contribution de dédifférenciation à la régénération chez les vertébrés inférieurs est bien soutenu 43,44,10,11 En outre, la dédifférenciation est de plus en plus observé dans la prolifération des cardiomyocytes et la régénération cardiaque dans les systèmes de mammifères, au moins au niveau fonctionnel, y compris le démontage myofibrillaire 6,12,9 Ainsi, l'état de différenciation des cardiomyocytes en culture doit être soigneusement examiné et modulé en fonction des besoins des objectifs de recherche. Par conséquent, les conditions de culture peuvent éventuellement être en outre modifiés pour réduire la concentration du sérum, l'utilisation de substituts du sérum définies ou des milieux sans sérum. Par exemple, les cardiomyocytes de rats adultes présentant des sarcomères organisés étaient à long terme de culture sans sérum, mais les facteurs de croissance tels que le facteur de croissance des fibroblastes, le facteur de croissance épidermique, et la triiodothyronine ont été utilisés dans des milieux définis. 45 On peut concevoir que des formulations de milieux similaires, ou potentiellement d' autres formulations telles que celles qui sont adaptées de differentiprotocoles ation, 46 peuvent être utilisés pour maintenir les cardiomyocytes de souris adultes bien différenciées dans la culture qui affichent des structures sarcomériques hautement organisées. D' autres formulations peuvent également être développés pour atteindre d' autres phénotypes (tels que des cardiomyocytes hautement différenciés de 6) en fonction des besoins de l'expérience, mais des travaux supplémentaires seront nécessaires.
Le rôle des fibroblastes a été impliquée dans le contrôle du cycle de cardiomyocytes de souris néonatale cellulaire 5 et la différenciation des cardiomyocytes de souris adultes (via la signalisation IL6 hypertrophique) dans la culture à long terme. 19 Par conséquent, la croissance des fibroblastes en culture doivent être comptabilisés dans les interprétations expérimentales . La croissance des fibroblastes en culture peut être contrôlée par l' addition de composés comme limitant la croissance cytarabine 19 (AraC) , soit par étapes de pré-placage. 28 Cependant, AraC sera également inhiber la croissance des cardiomyocytes, de façon subsidiaireméthodes doivent être utilisées pour contrôler la croissance des fibroblastes dans les études portant sur le cycle cellulaire de cardiomyocytes. Dans le protocole décrit ici, la pureté des cardiomyocytes initiale peut être améliorée en répétant l'étape de sédimentation par gravité (voir 1.4.8).
Les présents procédés fournissent un système in vitro qui peuvent être utilisés pour étudier la nature du mammifère adulte blocage du cycle cellulaire de cardiomyocytes. Contrairement aux cellules primaires provenant d' autres organismes, tels que le rat ou le cochon de Guinée, les cardiomyocytes primaires de souris offrent une multitude d'outils génétiques puissants et bien caractérisés, tels que la lignée à base de Cre traçage des modèles knock-in, 47 qui peuvent être utilisés pour facilement identifier les cellules dérivées de cardiomyocytes préexistantes. 12,48 en outre, les adultes cardiomyocytes primaires de souris ont été soumises à des conditions de développement natives qui entraînent le blocage du cycle cellulaire, à la différence des lignées cellulaires et des cellules ES différenciées ou iPSC 46 qui, malgré leur convenience et l' adaptabilité à de grands écrans de médicaments, 2 peuvent avoir une utilité limitée dans des expériences de sondage de la nature de la sortie du cycle cellulaire de cardiomyocytes adultes.
Ce protocole décrit une méthode fiable pour isoler et culture cardiomyocytes de souris adulte. Plusieurs méthodes ont déjà démontré l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes pour étude à court terme, mais à ce jour, peu de rapports existent de la culture à long terme des cardiomyocytes adultes souris 18,19. La capacité de maintenir cardiomyocytes de souris adulte dans la culture devrait permettre l'étude in vitro de cardiomyocytes biologie dans des conditions expérimentales nécessitant un examen à long terme. Par exemple, l'expression du gène peut être manipulé à l'aide des vecteurs adénoviraux, qui nécessitent généralement quelques jours pour atteindre la pleine expression. changements phénotypiques ultérieurs et l'analyse peuvent nécessiter des périodes encore plus longues en fonction des objectifs expérimentaux. Les méthodes présentées ici permettent la culture de cardiom de la souris adulteyocytes pendant plusieurs semaines. Cela devrait fournir un système puissant pour l'étude de questions prudentes dans la biologie des cardiomyocytes, telles que celles relatives à la régulation du cycle cellulaire.
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Acknowledgments
Ce projet a été financé par le Programme UCSF pour Breakthrough Biomedical Research (financé en partie par la Fondation Sandler), le NIH Pathway to Award Indépendance (R00HL114738), et la Fondation Edward Mallinckrodt Jr.. JJ a été soutenue par une bourse postdoctorale du NIH (T32HL007731). Les auteurs sont seuls responsables du contenu de ce travail, qui ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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