Abstract
Kultivierten Kardiomyozyten können verwendet werden , cardiomyocyte biology studieren Techniken , die zur in vivo - Systeme ergänzen. So ermöglicht beispielsweise die Reinheit und Zugänglichkeit der in vitro Kultur feine Kontrolle über biochemische Analysen, Echtzeit- Bildgebung und Elektrophysiologie. Langzeitkultur von Kardiomyozyten bietet Zugang zu zusätzlichen experimentellen Ansätzen, die in kurzen Zeitkulturen werden nicht abgeschlossen. Beispielsweise die in vitro Untersuchung der Entdifferenzierung, Zellzyklus - Wiedereintritt und die Zellteilung bisher weitgehend auf Ratten - Kardiomyozyten beschränkt, die in Langzeitkultur robuster zu sein scheinen. Allerdings machen die Verfügbarkeit einer umfassenden Werkzeugpalette von transgenen Mauslinien und gut entwickelten Krankheitsmodelle Maus Systeme attraktiv für Herzforschung. Obwohl mehrere Berichte von Kardiomyozyten Isolation erwachsenen Maus vorhanden sind, zeigen einige Studien ihre langfristige Kultur. Der hier präsentierte, ist ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für dieIsolation und langfristige Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten. Zunächst wird retrograden Langendorff-Perfusion verwendet effizient das Herz mit Proteasen zu verdauen, durch die Schwerkraft Sedimentation Reinigung gefolgt. Nach einer Zeit der Entdifferenzierung nach der Isolierung haften die Zellen allmählich auf die Kultur und für Wochen kultiviert werden. Adenovirus Zelllysat wird verwendet, um effizient die isolierten Cardiomyocyten transduzieren. Diese Methoden bieten eine einfache, aber leistungsfähige Modellsystem Herz Biologie zu studieren.
Introduction
Kultivierten Kardiomyozyten werden häufig zur Überwachung des Zellverhaltens in einer gut kontrollierten Umgebung in vitro verwendet. Beispielsweise morphologischen, elektrischen, biochemischer oder mechanische Zelleigenschaften auf Substraten konstruiert, 1,2 in definierten Medien, und in Reaktion auf niedermolekularer Wirkstoffe, Peptide, Genregulation, 3 oder elektrische Stimulation untersucht. 4 Die zelluläre Inhalt kann auch definiert Kokulturen gesteuert werden. 5 Diese in vitro - Experimente in großem Medikament oder genetischen Screens nützlich sind , und in vivo - Verfahren für verschiedene Arten von Untersuchungen ergänzen cardiomyocyte biology beteiligt sind .
Die langfristige Kultur ermöglicht experimentelle Wege, die Zeit erfordert ein erweitertes phänotypische Veränderungen zu erreichen. Ein aktuelles Beispiel ist die von erwachsenen Säugetieren Kardiomyozyten Proliferation, wo Entdifferenzierung, Zellzyklus-Wiedereintritt und die Zellteilung wird in der Regel untersucht über seVeral Tage bis Wochen. 6,7 Hier erleichtert die erweiterte Kulturzeit genetische Manipulation, 7,8 funktionellen Entdifferenzierung (zB sarcomeric Demontage) 9 und möglicherweise Transkriptions Entdifferenzierung. 6 Nachfolgende Zellzyklus Wiedereintritt und die Zellteilung benötigt noch längere Kulturzeiten , vor allem, wenn mehrere Runden der Division sind die experimentellen Ziel zu beobachten. Die Bedeutung der Kardiomyozyten Zellzyklus ist von zentraler Bedeutung für mehrere aktuelle Schlüssel wissenschaftlichen Arbeiten in Herzregeneration, wo der Entdifferenzierung und Proliferation von bereits bestehenden Kardiomyozyten hat für Herzregeneration in Zebrabärbling und neugeborenen Mäusen verantwortlich gezeigt. 10-12 Somit ist die Möglichkeit , Entdifferenzierung und Zellzyklus - Wiedereintritt in Säuger adulten Kardiomyozyten bleibt eine zentrale Frage in der menschlichen Herzregeneration zu stimulieren 13-15
I n - vitro - Experimente in den Zellzyklus von Säugetier-Cardio - StudiumMyocyten haben überwiegend Rattenquellen verwendet, die aufgrund ihrer relativen Leichtigkeit der Langzeitkultur im Vergleich zu Mausmodellen. 16 jedoch murinen Systemen eine reiche Quelle von gut charakterisierten transgenen Werkzeuge und Krankheitsmodelle bieten, die sowohl in in vitro und in vivo nützlich sind , Protokolle. Beispielsweise Cre-basierten lineage Verfolgung hat die Identifizierung von vorbestehenden Kardiomyozyten als Quelle von regenerierenden Myokard in der neonatalen Mäuseherzen in vivo aktiviert. 12 In - vitro - Studien von Lineage-verfolgt neonatalen Maus Kardiomyozyten aktiviert haben die Untersuchung von Wechselwirkungen mit stromal Zellen durch Kokultur mit Fibroblasten. 5 jedoch aufgrund seiner Herausforderungen bestehen 17 wenige Berichte über die Isolierung und die langfristige Kultur von erwachsenen Maus Kardiomyozyten. 18,19
Die Isolierung von lebensfähigen adulten Maus Kardiomyozyten für kurzfristige Kultur allein bekannt ist eine herausfordernde Aufgabe. Diese Protocol liefert eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie rentabel Kardiomyozyten von erwachsenen Mäusen zu erreichen, die für sowohl kurzfristige als auch langfristige Untersuchungen verwendet werden kann. Kardiomyozyten mit diesem Protokoll isoliert effizient mit adenoviralen Vektoren 20,21 und kultiviert Wochen transduziert werden. Diese Methoden stellen ein leistungsfähiges System Kardiomyozyten Biologie in vitro zu studieren.
Die hier beschriebenen Verfahren basieren auf mehreren Elementen aus früheren Arbeiten Variationen der Langendorff - Perfusion unter Verwendung von retrograden. 18,22 Obwohl mehrere Protokolle auf der Isolierung von erwachsenen Maus Kardiomyozyten für kurzfristige Kultur und Studie 23-25 der Vorteil veröffentlicht Dieses Protokoll ist die Fähigkeit, die isolierte Kardiomyozyten langfristig Kultur. Dies wird bei der Untersuchung von zellulären Prozessen beteiligt ektopische Genexpression und erfordern längere Zeit, beispielsweise in zellularen Umprogrammierung Strategien nützlich sein.
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Protocol
Alle Verfahren hier skizziert wurden von der Institutional Animal Benutzung und Pflege Ausschuss an der University of California, San Francisco genehmigt.
HINWEIS: Kurz nachdem das Herz aus dem Maus - Thorax, koronare Retroperfusion verwendet wird Extraktion effizient die extrazelluläre Matrix mit Kollagenase und Protease XIV zu verdauen. Die Ventrikel werden dann isoliert, mechanisch dissoziiert und in eine Einzelzellsuspension filtriert. Schwerkraftsedimentation durchgeführt wird Kardiomyozyten, die getrennt sind von Stromazellen, wie Fibroblasten und Endothelzellen durch ihre hohe Dichte zu isolieren. Die gereinigten Kardiomyozyten können für Wochen auf Laminin beschichteten Polystyrol und transduziert mit Adenovirus Genvektoren kultiviert werden.
1. Cardiomyocyte Isolation
- Bereiten Sie Puffer, OP - Station und Perfusionsgerät
- Bereiten Sie Puffern und Medien gemäß Table 1.
- Schalten Sie zirkulierendes Wasserbad, eingestellt Eingangstemperatur so, dass die Ausgabe von erhitztem Wassermantel mit einer Temperatur von 37 ° C erreicht.
- Saubere Perfusionssystem nach mit 70% Ethanol gespült. Dann entfernen Sie alle Spuren von Ethanol aus dem System durch mit mehreren Volumina von sterilem Wasser gespült wird.
- Legen Sie das Perfusionssystem mit Perfusions - Puffer (Tabelle 1). Erste Ablaufwasser aus dem System, dann mit 2 Volumina Perfusionspuffer spülen. Füllen Sie dann den toten Raum mit Perfusionspuffer, so dass die innere Säule des Wärmejacke mit Perfusionspuffer gefüllt ist, aber die Blasenfreimachungsmittel Kammer ist leer.
TIPP: Achten Sie darauf , keine Luftblasen vorhanden sind , in der Zeile unter der Blasenfreimachungsmittel Kammer. Zum Entfernen von widerspenstigen Blasen, greifen alle Absperrhähne und erlauben Druck aufzubauen innerhalb der Linie für ein paar Sekunden. Dann lassen Sie die untere Absperrhahn, so dass die Hochdruck-Perfusion Puffer Strahl aus der Steckdose; die schnelle Strömung und Turbulence helfen Blasen entfernen, die in der Nähe der Perfusions-Ausgang gefangen werden. - Bereiten Sie eine Spritze mit Nadel werden für Aorten-Kanülierung verwendet. Bringen Sie eine 18 G stumpfe Nadel in eine 1-ml-Spritze mit Perfusions-Puffer gefüllt. Entfernen Sie Luftblasen und fixieren Sie die Spritzeneinheit an einem Arm des Sezieren miscroscope Illuminator mit Labor-Band.
TIPP: Um eine stumpfe dige Nadel aus einer abgeschrägten Nadel, transect die Nadelwelle mit Drahtschneider erstellen. Dann schärfen die Spitze mit einem Schleifstein, bis die Spitze flach ist.
Hinweis: Die Verwendung einer Rasierklinge , um ein Verrutschen der Aorta von der Nadel während der Kanülierung reduzieren, die Welle der Kanülierung Nadel aufrauen. Sichern die Nadel durch die Nabe und die obere Welle, sah dann das Rasiermesser hin und her senkrecht zur Längsachse des Nadelschafts während des Drehens bis mehrere Nuten haben, innerhalb von 1 cm von der Spitze der Nadelschaft geschaffen. Wechseln Sie zu einem neuen Rasierapparat, wenn die Klinge stumpf wird. - Ein sauberesPetrischale unter dem Binokular das Herz während der Kanülierung zu enthalten. Positionieren Sie den Illuminator Arm, so dass die Spitze der Kanüle ist in der Nähe der Kante des Sichtfeldes, aber nicht die Dissektion zu behindern. Sicherstellen, dass die Spitze der Kanüle unter dem Rand der Petrischale ist.
HINWEIS: Um zu helfen , das Herz bei der Präparation zu immobilisieren, legen Sie eine kleine (~ 5 bis 7 cm 2) Quadrat von 215 Mikron Maschen in der Petrischale. Wenn das Herz auf dieser Masche gelegt wird, wird es Reibung erzeugen während der mechanischen Manipulation des Herzens zu reduzieren, Gleit- und Drehbewegung. - Tie 2 Nähte mit losen Doppelüberhandknoten um die Nabe der Kanülennadel zur Befestigung der Aorta eingesetzt werden.
- Herz - Extraktion und Kanülierung
- Verabreichen Heparin (5 IU / g Körpergewicht) über intraperitoneale Injektion. Warten 20 min das Heparin zu erlauben, an das Herz zu zirkulieren.
- Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Injection von 20% Ethylcarbamat (2 mg Ethylcarbamat / g Körpergewicht). Beachten Sie unbedingt, bis die Maus unter tiefer Narkose (ca. 3-5 min).
HINWEIS: Tiefe der Anästhesie wird durch einen Mangel an beiden toe Prise und Corneareflexe bestätigt. Wenn die Maus nicht durch 8 erreicht tiefe Narkose hat - 10 min, dann eine zusätzliche Dosis von Ethylcarbamat verabreichen. Obwohl individuelle Reaktionen auf die Anästhesie zwischen Mäusen variieren, zum Scheitern tiefe Narkose bei der ersten Dosierung eintreten kann abgebaut Ethylcarbamatgehalts zeigen, die tiefe Narkose auch nach wiederholter Gabe entgegenstehen kann. Um Abbau zu verhindern, bereiten eine frische Lösung von Ethylcarbamat vor jedem Gebrauch. - Unbeweglichkeitseffekt die Maus in die Chirurgie-Plattform von jeder dieser Teile mit chirurgischen Band zu sichern. Desinfizieren Sie den Schnittbereich mit einer liberalen Menge von 70% Ethanol. Pat trocken mit einem Labor-wischen.
- Heben Sie die Haut mit einer Pinzette Gewebe direkt unterhalb des Brustbeins. Machen Sie einen seitlichen Schnitt mit einer kleinen Schere, Schneiden throigitt die Haut und Bauch.
- Verwenden Sie hemostats vorsichtig auf die Brustkorbs über das Brustbein anheben. Mit Hilfe von kleinen Dissektion Schere, erweitern den Einschnitt in einer V-Form in Richtung der Achselhöhlen. Schneiden durch die erste Rippe und durchstechen die Membran auf jeder Seite.
- Weiter den Brustkorb mit hemostats und verwenden kleine Iris Schere zu heben, um vollständig die Membran transect. Achten Sie darauf, nicht das Herz zu durchbohren.
- Ziehen Sie die ribcage rostral angebracht hemostats verwenden und schnell, aber sorgfältig die V-förmige Einschnitt erstrecken sich auf beiden Seiten durch den Brustkorb in Richtung der Achselhöhle durch Schneiden. Ziehen Sie den mittleren Abschnitt des Brustkorbs voll und legte sich die angeschlossenen hemostats in Position zu halten.
- Entfernen Sie den Herzbeutel mit einer feinen Pinzette.
- Während sanft das Herz mit einer gebogenen Pinzette heben, transect die Venen und an das Herz befestigt Arterien. Ab sofort legen Sie das Herz in eiskaltem Perfusionspuffer Muskelkontraktion zu verlangsamen.
- Legen Sie das Herz in einer Petrischale unterein Präpariermikroskop (Platz auf einem kleinen Stück von 215 & mgr; m-Mesh bei der Präparation zu helfen, zu immobilisieren). Trim überschüssige nicht-Herzgewebe mit feinen Iris Schere. Vorsicht, wenn Sie in der Nähe der Aorta zu schneiden.
- TRANSECT die Aorta in der Nähe der brachioencephalic Arterie, und darauf achten, nicht zu lassen, Blasen oder Gewebedebris die Öffnung ein.
- Füllen Sie die Petrischale das Herz mit eiskaltem Perfusionspuffer, so dass der Flüssigkeitspegel steigt über die Öffnung der Kanüle enthält. Ummanteln die Aorta auf die Kanüle, so dass die Spitze auf die Aortenklappe gerade distal ist.
TIP: Um die Gefahr der Luftembolie zu verringern, leicht die Spritze an der Kanüle drücken vor Kanülierung, um mögliche Luftblasen zu entfernen , die am Ende der Kanüle entwickelt haben. Darüber hinaus halten die Spitze der Kanüle und die Aorta unter der Oberfläche der Lösung zu vermeiden, Blasen einzuführen, während die Aorta Ummantelung. - Schieben Sie eine vorgebundene 7-0 Seidennaht nach untender Schaft der Nadel und Kanülierung Position gerade über der Spitze der Nadel. Ziehen Sie den Knoten mit einer feinen Pinzette. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer zweiten Naht knapp über dem ersten platziert.
HINWEIS: Sicherstellen , dass die Spitze der Nadel noch oberhalb der Aortenklappe ist vor und nach dem Anziehen. - Langsam drücken Sie die Spritze 0,5 ml Perfusionspuffer durch die Koronargefäße auszuwerfen.
HINWEIS: Wenn die Kanülierung erfolgreich war, wird Blut sichtbar gemacht werden , um die Koronargefäße zu verlassen und aus den dorsalen Venen und Arterien Pooling.
WICHTIG: Die Zeit von der Öffnung der Brusthöhle (insbesondere die Membran Punktierung) Perfusion Erstausbildung sollte hypoxischen Exposition und maximieren das Überleben und die Gesundheit der isolierten Kardiomyozyten zu reduzieren , minimiert werden. Idealerweise sollte diese Zeit weniger als 5 min.
- Perfusions
HINWEIS: Die RetroperfusionVorrichtung bequem in einer sauberen Umgebung auf einem Standard-Labortisch betrieben werden oder in einer laminaren Strömungshaube platziert Sterilität zu maximieren. Doch nach Perfusion abgeschlossen ist, Arbeit sollte unter laminaren Strömung durchgeführt werden, um Verunreinigungen zu minimieren.- Sanft, aber bestimmt die Kanüle Nabe von der Spritze (mit sterilen Handschuhen) entfernen sich langsam durch hin und her drehen. Während die Kanülierung Nadel Abziehen der Spritze langsam Perfusionspuffer in die Nadel-Hub, um Luftblasen während der Perfusion zu verhindern auszuwerfen.
- Entfernen Sie die Umlauffangrohr von unterhalb der Perfusions-Auslassanschluss und ersetzen mit einem Abfallfangbecher. Bringen Sie die Nadelnabe an den Luer - Adapter, der mit dem Perfusionssystem Auslaöffnung befestigt ist (1, 2) an dem Wassermantel, während die Pumpe bei der niedrigsten Einstellung ausgeführt (15 RPM, ~ 6 ml / min).
TIPP: Wenn die Nadel - Hub an den Luer - Adapter verbinden, lassen Sie den tropf Perfusionspuffer conNECT auf die Flüssigkeit in der Nadelnabe, um die Einführung Blasen zu vermeiden. - Perfuse das Herz ohne Rezirkulation bis 8 ml Perfusionspuffer haben durch den Zulaufschlauch abgesaugt worden.
HINWEIS: Das Volumen des Perfusionspuffer durch den Einlassschlauch in diesem Schritt abgesaugt nimmt ein Totvolumen von 7 ml für das Perfusionssystem, insgesamt 15 ml Perfusionspuffer durch das Herz gepumpt geben. - Entfernen Sie das Einlassrohr aus dem Perfusions-Puffer. Damit die Luft durch den Einlass angesaugt werden, um weniger als das Totvolumen des Systems.
ANMERKUNG: Das Volumen der Luft in diesem Schritt abgesaugt müssen die Koronargefäße Luft zu verhindern eingestellt werden eindringt (siehe Schritt 1.3.7). - Platzieren Sie die Einlassröhre in den Verdauungspuffer (Tabelle 1), knapp über dem Boden des Röhrchens. Ziehen Sie langsam und lassen Sie das Einlassrohr genug Volumen zu aspirieren zu vermeiden, dass die Rohrfüllung.
- Visualisieren und folgen der Luftblase zwischendie Perfusionspuffer und die Verdauungspuffer, wie es durch den Wärmemantel bewegt. Beachten Sie die Höhe der Perfusions-Puffer in der Mitte des Wärmejacke beginnen zu fallen, sobald die Luftblase, die de-Blasenkammer erreicht. Sobald der Verdauungspuffer die de-Blasenkammer erreicht, wird der Pegel der Flüssigkeit in dem Wärmemantel stabil bleiben.
WICHTIG: Wenn der Pegel des Perfusionspuffer zu niedrig ist , die Austrittshahn schließen und den Ablasshahn öffnen. Lassen Sie die Ebene auf ein angenehmes Niveau zu steigen (3-5 Zoll über dem Auslass-Port). Dann stoppen Sie die Transfusionspumpe und schließen Sie die Entlüftungshahn. Öffnen Sie den Auslassanschluss Absperrhahn und starten Sie den Perfusions-Pumpe. - Sehen Sie sich die Lösung aus dem Herzen entstehen. Als der letzte der Perfusionspuffer beginnt das Herz und die Verdauungspuffer verlässt durch das Herz zirkuliert, bis hellbraune Farbe Änderung wird klar aufgrund der Anwesenheit von Kollagenase beobachtet werden.
- Perfuse das Herz mit Verdauungspufferfür ca. 10 bis 15 min. Das Herz wird slouching beginnen, wie das Kollagen abgebaut wird und es verliert mechanische Unterstützung.
- Mechanische Distanzierung und Reinigung
- Entfernen Sie das Herz aus der Kanüle mit einer Pinzette und in einem trockenen Petrischale. Schnell schneiden extra ventrikuläre Gewebe feine Iris Schere. Übertragen Sie die Ventrikel auf eine frische Petrischale mit Perfusionspuffer zu waschen. Bewegen Sie die Petrischale in eine sterile Haube und übertragen Sie die Ventrikel zu einem frischen, trockenen Petrischale.
- Sammeln 7,5 ml Verdauungspuffer aus dem Wärmemantel und fügen 2,8 ul 1 M CaCl 2, durch Umdrehen mischen. Hinzufügen von 2 bis 3 ml Verdauungspuffer mit CaCl 2 zu den Ventrikeln in der Petrischale.
HINWEIS: Die Konzentration von Ca 2+ 300-700 uM angehoben - Schnell verreiben die ventrikuläre Gewebe mit feinen Pinzetten, so dass die meisten Stücke sind kleiner als 1 mm 3. In die bleibenCa 2+ ing ergänzt Verdauungspuffer von Schritt 1.3.2 an die dissoziierten Ventrikel in der Petrischale und mischen durch vorsichtiges Schütteln.
- Platzieren der Petrischale in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2. Man schüttelt die Petrischale alle 2 Minuten, bis eine ausreichende Kardiomyozyten (siehe Anmerkung unten) wurden aus dem Gewebe freigesetzt worden.
HINWEIS: Die Länge der Inkubation müssen möglicherweise nach Feinabstimmung der Grad der Verdauung eingestellt werden , um den Bedürfnissen des Experiments. Im Allgemeinen erhöhen längere Inkubationszeiten Ausbeute und Reinheit, kann jedoch die Rate der Zellhaftung und das Überleben zu reduzieren. 5 - 10 min im allgemeinen ausreichend ist , um eine hohe Ausbeute (~ 5-10 x 10 5 Zellen pro Herz) zu erreichen. - Übertragen Sie die Petrischale zurück in eine Laminarströmungsabzug. Mit Hilfe einer Transferpipette in einem 45 ° Winkel geschnitten, sanft das Gewebe Pipette weiter zu distanzieren.
- Verwenden Sie sterile Handschuhe, um die 215 & mgr; m-Mesh in einen Kegel zu falten und eine 50 ml konischen halten über. Pipettedas dissoziierte Gewebesuspension auf das Sieb und lassen Sie das Filtrat in das 50 ml konischen abzulassen. Verwenden 7,5 ml vorgewärmtes Anschlagpuffer (Tabelle 1) , um die Kardiomyozyten aus der Petrischale durch das Sieb zu waschen, mit dem ersten Filtrat zu kombinieren.
HINWEIS: Ca 2+ zu final 1.1 mM erhöht wird und die endgültige 2,5% FBS in dem Pufferanschlag neutralisiert Protease - Aktivität. - Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches und ermöglichen es durch die Schwerkraft für 15 Minuten absetzen.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Transferpipette, so dass nur 50 bis 100 & mgr; l der Lösung über den Zellen bleibt. 10 ml vorgewärmten, ins Gleichgewicht gebracht Kulturmedien (Tabelle 1) und durch vorsichtiges Umdrehen mischen. Lassen Sie die Kardiomyozyten für 15 Minuten durch die Schwerkraft zu regeln.
TIPP: Zur Erhöhung der Reinheit, wiederholen Sie Schritt 1.4.8 nach Wunsch. - Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Transferpipette, so dass nur 50 bis 100 & mgr; l of Lösung bleibt über den Zellen.
2. Cardiomyocyte Kultur
- Pre-Coat Gewebekultur-behandelte Petrischalen mit Laminin (10 ug / ml) und lagern bei 37 ° C für 2 Stunden vor dem Beschichten Zellen. Unmittelbar vor dem Plattieren von der Gewebekulturplatte, die Laminin Lösung anzusaugen. Waschen Sie einmal mit MEM oder PBS, dann absaugen Restflüssigkeit nicht adsorbierte Laminin zu entfernen.
- Fügen Sie genug vorgewärmt, ins Gleichgewicht gebracht Kulturmedien, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen, mischen durch vorsichtiges Umdrehen. Platte gewünschte Konzentration der Zellen in dem Kulturgefäß (typischerweise 5 bis 20 x 10 4 Zellen / cm 2). Um die Ausbeute an Kardiomyozyten Isolation beurteilen zu können, zählen die Zellen über Hemacytometer oder Testplatte, die durch die Dichte unter einem Mikroskop überprüft. Ein erwachsenes Maus Herz stellt typischerweise 0,5 bis 1,0 x 10 6 Zellen in diesem Stadium des Protokolls.
TIPP: Wenn 96 - Well - Platten verwenden, verwenden Sie eine 1000 ul micropipette mit einem im 45 ° -Winkel geschnitten Spitze durch eine Zellschädigung zu minimieren Scherkraft. Platzieren Sie die Pipettenspitze, so dass sie den Boden des Bohrlochs während des Auswerfens der Zellsuspension berühren, um zu minimieren Einführung von Blasen. - Bewegen , um die Zellkulturschale prompt auf einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Ändern Sie bei Bedarf Medien ein Versauerung zu verhindern: alle 1-5 Tage, je nach Zelldichte. Minimieren Handhabung der Kulturschale in den ersten 3 bis 6 Tage, um die Befestigung an der Zellkulturoberfläche zu erleichtern.
HINWEIS: Um die Zellstörung während Medienwechsel zu minimieren , wenn die Zellen noch nicht vollständig eine Halbmedienwechsel angebracht ist , durchführen. aspirieren langsam die Medien, während die Pipettenspitze knapp unter der Oberfläche der Medien zu halten. Dann langsam zusätzliche Medien hinzufügen, indem Sie die Pipettenspitze knapp über der Oberfläche der Medien gegen die Wand der Kulturschale zu halten. - Um die Lebensfähigkeit von Kardiomyozyten beurteilen zu können, prüfendie Morphologie unter Hellfeldmikroskopie. Frisch isolierte Kardiomyozyten halten eine etwa stabförmige Morphologie mit scharfen, ausgeprägten Kanten unter Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 2).
HINWEIS: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit von Zellen mit Trypanblau Färbung. - Um die Reinheit der Kardiomyozyten Isolation beurteilen zu können, überprüfen Sie die Zellmorphologie Kardiomyozyten identifizieren. Stain die Kerne mit Hoechst 33342 auf insgesamt Zellen zu identifizieren.
HINWEIS: Kardiomyozyten können aus nicht-Kardiomyozyten durch ihre charakteristische Morphologie (stabförmige) und Größe (etwa 100 bis 200 & mgr; m in der Länge) identifiziert werden. Alternativ frisch isolierten Herzmuskelzellen für Kardiomyozyten-spezifische Marker positiv färben, wie alpha-Actinin 26 (3C, D) oder kardiales Troponin T. 27
3. Gene Transduction mit Adenoviren
- Bereiten Sie Adenovirus Zelllysat mit etablierten mETHODEN. 21 transduzieren die Kardiomyozyten mit Zelllysat von Adenovirus Produzentenzellen 10. Am Tag 0 oder Tag 1 nach der Isolierung vorsichtig das Zelllysat zu den Medien fügen Sie die Kardiomyozyten enthält.
HINWEIS: Ein hoher Titer Adenoviruszubereitung erreichen wird eine starke Expression in etwa 48 bis 72 Stunden. Stellen Sie die Vielzahl der Infektion des experimentellen Design zu entsprechen.
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Representative Results
Ein Wildtyp erwachsenen ICR (CD1) Maus Herz ergibt typischerweise 500.000 bis 1 Million Kardiomyozyten aus einer erfolgreichen Isolierung. Unmittelbar nach der Isolierung behalten die Zellen , die ein meist stabförmiges Aussehen (3A) mit intaktem Sarkomeren und kann für funktionelle Studien verwendet werden cardiomyocyte Kontraktilität beteiligt sind . Ein hoher Prozentsatz der stabförmigen Kardiomyozyten (über 90%) ist ein Hinweis auf wirksame Perfusion und Verdauung. Tragfähige Kardiomyozyten wird groß sein (~ 100-200 & mgr; m in der Länge) und scheinen eine scharfe äußere Membran unter Hellfeldbeleuchtung (3A) zu haben. Immunofärbung für Kardiomyozyten-spezifische sarcomeric Marker, wie alpha-Actinin, wird in einem deutlichen sarcomeric Bandenmuster (3C) führen. In Verbindung mit morphologischen Analyse und Kernfärbung mit DAPI kann Immunofärbung verwendet werden, um die Reinheit der isolierten Kardiomyocyten zu beurteilen. Fibroblasts wird nur nach der Isolierung klein und rund, aber wird schnell befestigen und dünn auf die Zellkultur-Plastik verteilt, so dass eine leichte Unterscheidung von Kardiomyozyten ermöglicht.
Ein geringer Prozentsatz von stäbchenförmigen Kardiomyozyten ist ein Hinweis auf eine erfolglose Isolation. Dies kann von einem Ausfall führen schnell die Aorta kanülieren nach das Herz aus dem Tier gewonnen wird. Ineffizienten Perfusion aufgrund von Luftembolien oder falsche Kanülierung kann beispielsweise auch die Morphologie und Lebensfähigkeit der Kardiomyocyten beeinflussen.
Nach mehreren Tagen in Kultur nehmen die Kardiomyozyten eine abgerundete Morphologie (3B). Innerhalb von 1 - 2 Wochen, befestigen Live - Kardiomyozyten auf das Substrat und beginnen Verbreitung (3D, E). Tote Zellen können durch Trypanblau-Aufnahme identifiziert werden. Eine erfolgreiche Isolierung und Kultur werden etwa 50% leben Cardio-AusbeuteMyozyten nach 1 Woche. Verunreinigungen durch nicht-Kardiomyozyten, wie Fibroblasten in einem hohen Prozentsatz dieser späteren Zellen in Kultur aufgrund ihrer proliferative Potential führen. Dies kann durch Erhöhung der Anzahl der Schwerkraft Sedimentationen und / oder durch Vorgalvanisierung vermieden werden , um die Reinheit zu erhöhen. 28
Transduction mit Adenovirus verwendet werden starke Genexpression innerhalb von 48 zu erreichen - 72 Stunden (Abbildung 3E). Adenovirus - Serotyp 5 ist effizient bei erwachsenen Maus Kardiomyozyten in vitro Transduktion aufgrund der hohen Expression des coxackie-Adenovirus - Rezeptor, kann jedoch von der Art der verwendeten Medien ab. 20
Abbildung 1. Cardiomyocyte Isolation Ausrüstung und Instrumentierung. (A) Chirurgische Instrumente verwendet , um die Maus zu extrahierenHerz und kanülieren die Aorta, von oben nach unten: hemostats, Gewebe Zange, einer gebogenen Pinzette, Dumont # 5 feinen Pinzette, kleine Dissektionsscheren, schöne Iris Schere, feine Schere Schere (B) Das System Langendorff - Perfusion verwendet , um die Maus Herz zu verdauen. . Perfusions-Puffer werden durch das Einlaßrohr (1) durch die Transfusionspumpe (2) und durch den Pumpenauslaß Rohr (3) in die Einlassöffnung auf der beheizten Wassermantel (4) abgesaugt. Die Perfusion Puffer werden durch die erwärmte Wassermantel erwärmt, während sie durch die spiralförmige Glasröhre reisen, die Blasenentfernungskammer und dann aus der Kanülierung Nadel an der Perfusion Auslassanschluss (5) befestigt, die durch einen Absperrhahn verbunden ist. Das konische Rohr unterhalb fängt die Perfusion Puffer, die durch das Einlassrohr rezirkuliert werden. Der Druckanschluss (6), Compliance-Port (7) und die Entlüftungs (8) bleiben während der Perfusion geschlossen, um eine konstante Strömungsgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten. Der Wassermantel wird durch ein zirkulierendes Wasserbad Eingabe durch Th erwärmte Manteleinlass (9) und Auslaß (10) Anschlüsse. Ein Ringständer wird verwendet , um die erhitzte Wassermantel in einer vertikalen Position (rote Klammern, schwarze Basis unter dem lila konischen Röhrchen Rack) zu halten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Übersicht über Perfusionssystem. Wichtige Teile der Perfusionsgerät Beschriftet werden als gemäß dem Manuskript. Die Strömungsrichtung des Perfusions - Puffer wird durch Pfeile angezeigt. Beachten Sie die Positionierung der Aortenkanüle, dessen Spitze durch die transluzente Aorta sichtbar sein soll, sicherstellen , dass er über der Aortenklappe platziert ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. erwachsenen Maus Kardiomyozyten isoliert. Kardiomyozyten wurden isoliert und Vorab - Platzierung auf Laminin beschichteten 96 - Well - Platten , wie im Protokoll beschrieben. (A) Frisch isolierte Kardiomyozyten, entkernt bei etwa 8000 Zellen / cm 2. Beachten Sie, dass frisch isolierten, durchführbare Kardiomyozyten erscheinen etwa stabförmig mit scharfen Kanten (weißer Pfeil). Allerdings Kardiomyozyten, die eine diffuse äußere Membran unter Hell- zu haben scheinen sind tot. In den ersten Tagen der Kultur nehmen die Kardiomyozyten eine abgerundete Form (B). (C) Immunostaining für alpha-Actinin (grün) zeigt charakteristische sarcomeric Banding in einem Kardiomyozyten bei d1 post-Isolierung. Kernfärbung (DAPI) in blau dargestellt. Top zeigt eine vergrößerte Bild skizzierte Region in unteren Bild. (D) (E) Hellfeld- und epifluoreszenten Bilder mit Adenovirus transduziert Kardiomyozyten am Tag 11 nach der Trennung zeigen eine GFP - Reporter unter der Kontrolle eines CMV - Promotor ( ein Geschenk von Robert Gerard am UT Southwestern). Die Zellen wurden bei etwa 18.000 Zellen / cm 2 und wurden transduziert am Tag 0 mit einer Multiplizität der Infektion von etwa 800 plaquebildenden Einheiten (PFU) pro Zelle beimpft. Maßstabsbalken:. 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Cardiomyocyte Isolationspuffer (CIB) | |||
| In 900 ml Reinstwasser in einen sauberen Becher unter magmagnetisches Rühren. | |||
| Fügen Sie die Pufferkomponenten wie in der Tabelle angegeben. | |||
| Komponente | MW | Endkonz (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58,44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74,55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268,07 | 0,33 | 0,088 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 246,48 | 0,5 | 0,123 |
| Taurin | 125,1 | 30 | 3,753 |
| BDM | 101,1 | 10 | 1,011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| Glucose | 180,16 | 22 | 3,964 |
| Stellen Sie den pH-Witzh 5 M NaOH. | |||
| Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L mit Reinstwasser. | |||
| Sterilfilter w / 0,22 uM Vakuumfilter. | |||
| In 0,5 ul 0,1 U / ml Insulin pro Liter Kardiomyozyten Isolationspuffer. | |||
| Perfusions - Puffer | |||
| Komponente | Finale | Volumen (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mM | 0,2 | |
| Gesamt | - | 200 | |
| Verdauungspuffer | |||
| Komponente | Finale | Menge | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1M) | 300uM | 4,5 ul | |
| Protease XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| Kollagenase II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Gesamt | - | 15 ml | |
| Anschlagpuffer | |||
| Komponente | Finale | Volumen (ml) | |
| Perfusions-Puffer | 95% | 14,25 | |
| CaCl2 (1M) | 1,5 mM | 22.5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Gesamt | - | 15 ml | |
| Kulturmedien | |||
| Komponente | Schluss% | Volumen (ml) | |
| MEM Medien | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0,2 | |
| Gesamt | 100% | 100 ml | |
| Erlauben Kulturmedien bei 37 ° C, 5% Kohlendioxid äquilibriert. | |||
Tabelle 1: Lösungen und Puffer.
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Discussion
Der allgemeine Gesundheitszustand der isolierten Kardiomyozyten, hängt von mehreren wichtigen Aspekten dieses Protokolls. Erstens ist die Zeit, von der Herz Extraktion Perfusion kritisch und sollte in 5 min oder weniger durchgeführt werden. Entfernung von Calcium hilft Wechselwirkungen Zell-Zell - zu dissoziieren, aber kann sich negativ auf die Gesundheit Zelllangzeitwirkung. 29-32 Somit finden wir es ausreichend durch EGTA (Ethylenglykol - tetraessigsäure) Chelatbildung Calcium während der ersten paar Minuten der Perfusion zu entfernen, 22 aber schnell Kalzium während der Verdauung und den nachfolgenden Schritten wiederherstellen.
Die Verwendung von Protease XIV verbessert die Verdauung Effizienz im Vergleich allein Kollagenase. Dies reduziert die Inkonsistenz aufgrund Kollagenase Batch - Variabilität, 18,24 und erhöht die Reinheit der Kardiomyozyten durch die Trennung während Schwerkraftsedimentation erleichtern. Dennoch über Verdauung wird eine effiziente Bindung an das Kultursubstrat zu verhindern, so eine feine Balance iZellausbeute und Reinheit zu optimieren, ist erforderlich, während die Zellanheftung Aufrechterhaltung und Lebensfähigkeit. Somit kann die Konzentration von Proteasen und Länge der Verdauung modifiziert werden, um die experimentellen Ziele anzupassen. Im allgemeinen wird ein geringer Grad der Verdauung verbessern die Anhaftung und das Überleben der Kardiomyozyten. Die Verwendung von Trypsin wurde in einigen Kardiomyozyten Isolation Protokolle berichtet. 18 Die Zugabe von Trypsin auf der Cocktail - Protease verwendet hier (Kollagenase und Protease XIV) reduziert die langfristige Lebensfähigkeit der Kardiomyozyten in Kultur, vielleicht aufgrund von Über Verdauung oder Spaltung ätherischer Oberfläche und / oder extrazellulären Matrixproteinen.
Die Einbeziehung von butan Monoxim (BDM) bei der Isolierung der Herzmuskelkontraktion hemmt und reduziert somit negative Auswirkungen aufgrund Terminal Kontraktur, Energieaufwand, und das Calcium Paradoxon. 29,33 Doch in unserer Erfahrung, die Entfernung von BDM vor der Kultur beschleunigt dedifferentiation und ermöglicht den Zellen, der Kultur in zwei Dimensionen anzupassen.
Es ist wichtig, dass die langfristigen Anpassungen an 2-D-Kultur zu beachten, können funktionelle Aspekte der Kardiomyozyten, wie Kontraktilität beeinflussen. So Kontraktilität und Elektro Experimente sollten bald nach der Isolierung durchgeführt werden, wenn einheimische sarcomeric Organisation noch intakt ist. Ferner kann , wie mit jedem in vitro Experiment wurden die Zellen in Kultur sind frei von bestimmten extrinsischen Einflüsse in vivo, wie humoral immune oder Signalisierung. Auf der anderen Seite, definiert Kokulturen können die Wechselwirkungen zwischen Kardiomyozyten und anderen Zelltypen zu untersuchen implementiert werden. 5,34 Zusätzlich können in - vitro - Kultur verwendet werden cardiomyocyte Verhalten mit definierten molekularen Signale in den Kulturmedien zu studieren. Somit sollten die Gesamtziele des Experiments sorgfältig geprüft und gegen die Einschränkungen und Vorteile dieser Kultursystem gewogen.
35 Es sollte beachtet werden , dass FBS und anderen Tieren stammenden Seren enthalten unbekannte Komponenten , die die zelluläre Physiologie beeinflussen können von Wachstumsfaktoren in FBS. 36,37 Trotz 38 der gut geschätzt Anwesenheit hier präsentierten die Kardiomyozyten Kulturen nicht vermehren. Vielmehr scheint der Zellzyklus - Block eine persistente Eigenschaft der erwachsenen Maus Kardiomyozyten ex vivo, gehalten von ihren Zellzyklus - Ausgang während der perinatalen Periode der Entwicklung zu sein. 12,39 Diese Eigenschaft ist von großem Interesse für den Bereich der Herz der regenerativen Medizin, wo Reversion von erwachsenen Säugerkardiomyocyten zu einem proliferativen Phänotyp hat Ziel ein stark verfolgt. 3,26,40-42 Bemerkenswert ist , es noch unklar ist Entdifferenzierung , welchen Grad erforderlich ist , für Kardiomyozyten in den Zellzyklus erneut eingeben, aber die contribution der Entdifferenzierung der Regeneration in niederen Wirbeltieren ist gut 43,44,10,11 Des Weiteren unterstützt wird Entdifferenzierung zunehmend in Kardiomyozyten Proliferation und Herzregeneration in Säugetiersystemen beobachtet werden, ist zumindest auf funktionaler Ebene, einschließlich myofibrilläre Demontage 6,12,9 somit sollte der Zustand der Differenzierung von Kardiomyozyten in Kultur sorgfältig nach der Forschungsziele an die Bedürfnisse betrachtet und moduliert werden. Als solche können die Kultivierungsbedingungen modifiziert werden, möglicherweise weitere Serumkonzentration, Verwendung definiert Serumersatzstoffe oder serumfreien Medien zu reduzieren. Zum Beispiel waren Kardiomyozyten erwachsenen Ratte zeigen organisierten Sarkomeren kultiviert Langzeit ohne Serum, sondern Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten - Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor und Trijodthyronin wurden in definierten Medien. 45 Es ist denkbar , daß ähnliche Medienformulierungen, oder möglicherweise andere Formulierungen, wie die von differenti angepaßtation Protokolle, 46 können auch differenzierte erwachsenen Maus Kardiomyozyten in Kultur zu halten verwendet werden , die hochorganisierten sarcomeric Strukturen anzuzeigen. Alternative Formulierungen können auch zu erreichen , andere Phänotypen (wie hoch dedifferenzierten Kardiomyozyten) 6 je nach den Bedürfnissen des Experiments entwickelt werden, aber die weitere Arbeit erforderlich.
Die Rolle der Fibroblasten wurde in der Kontrolle von neonatalen Maus cardiomyocyte Zellzyklus 5 und adulten Maus cardiomyocyte Differenzierung (durch hypertrophe IL6 - Signalisierung) in Langzeitkultur gebracht. 19. Daher sollte das Wachstum von Fibroblasten in Kultur in experimentellen Auslegungen berücksichtigt werden . Das Wachstum von Fibroblasten in Kultur können durch Zugabe von Wachstums gesteuert werden , um Verbindungen wie Cytosinarabinosid Einschränkung 19 (AraC) oder durch Vorgalvanisierung Schritte. 28 jedoch AraC wird auch das Wachstum von Kardiomyozyten hemmen, so alternativeVerfahren sollte das Wachstum von Fibroblasten in Studien über die Kardiomyozyten Zellzyklus zu steuern, verwendet werden. In dem Protokoll hier anfänglichen Kardiomyozyten Reinheit beschrieben wurde, kann durch Wiederholung des Schwerkraftsedimentation Schritt verbessert werden (siehe 1.4.8).
Die Verfahren , die hierin stellen eine in vitro - System , das verwendet werden kann , die Art von erwachsenen Säugetieren cardiomyocyte Zellzyklus - Blockade zu studieren. Im Gegensatz zu den primären Zellen aus anderen Organismen, wie Ratte oder Meerschweinchen, bieten primäre Maus Kardiomyozyten eine Fülle von leistungsfähigen und gut charakterisierte genetische Werkzeuge, wie Cre-basierte Linie Tracing - Knock-in - Modelle, 47 , die verwendet werden können , leicht zu Identifizierung von bereits vorhandenen Kardiomyozyten abgeleiteten Zellen. 12,48 Zusätzlich wurden primäre erwachsenen Maus - Kardiomyozyten zu den nativen Entwicklungsbedingungen unterworfen worden , die, im Gegensatz zu Zelllinien und differenzierte ES oder iPS - Zellen 46, die trotz ihrer convenien in Zellzyklus - Blockade führence und Anpassungsfähigkeit an die große Drogen - Bildschirme können 2 haben begrenztem Nutzen in Experimenten , die die Natur der erwachsenen Kardiomyozyten Zellzyklus Ausgang Sondieren.
Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultur erwachsenen Maus Kardiomyozyten. Mehrere Methoden haben bisher gezeigt , die Isolierung von adulten Maus Kardiomyozyten für Kurzzeitstudie, aber bisher nur wenige Berichte existieren von der Langzeitkultur von Erwachsenen-Maus - Kardiomyozyten. 18,19 Die Fähigkeit erwachsenen Maus Kardiomyozyten in Kultur zu halten ermöglichen sollte , die in - vitro - Studie von Kardiomyozyten Biologie unter experimentellen Bedingungen langfristige Prüfung erforderlich ist . Zum Beispiel kann die Genexpression unter Verwendung von Adenovirus-Vektoren manipuliert werden, die in der Regel einige Tage erfordern vollen Ausdruck zu erreichen. Anschließenden phänotypischen Veränderungen und Analyse kann sogar längere Zeiträume je nach Versuchs Ziele erfordern. Die hier vorgestellten Methoden erlauben die Kultur der erwachsenen Maus cardiomyocytes für mehrere Wochen. Dies sollte ein leistungsfähiges System für die Untersuchung der vorsichtigen Fragen in Kardiomyozyten Biologie, wie sie im Zusammenhang mit der Zellzyklusregulation sorgen.
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Acknowledgments
Dieses Projekt wurde für Durchbruch biomedizinische Forschung von der UCSF-Programm finanziert werden (finanziert zum Teil von der Sandler-Stiftung), der NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) und der Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ wurde durch ein Postdoc-Stipendium von der NIH (T32HL007731) unterstützt. Die Autoren sind allein verantwortlich für den Inhalt dieser Arbeit, die nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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