Abstract
培養心筋細胞がインビボ系に相補的な技術を使用して心筋細胞生物学を研究するために使用することができます。例えば、 インビトロ培養の純度とアクセシビリティは、生化学分析、ライブイメージング、および電気生理学を細かく制御を可能にします。心筋細胞の長期培養は、短期培養で完了することができない追加の実験的アプローチへのアクセスを提供しています。例えば、脱分化、細胞周期の再進入、および細胞分裂のインビトロ研究は、これまで主として長期培養においてより堅牢であると思われるラット心筋細胞に限定されています。しかし、トランスジェニックマウス系統とよく発達した疾患モデルの豊富なツールセットの利用可能性は、心臓研究のためのマウスのシステムは魅力的です。いくつかの報告は、成体マウスの心筋細胞の単離の存在するが、いくつかの研究は、それらの長期培養を実証します。ここで紹介する、ステップ・バイ・ステップ方式であります単離および成体マウスの心筋細胞の長期培養。まず、逆行ランゲンドルフ灌流を効率的に重力沈降精製を行っプロテアーゼ、と心を消化するために使用されます。単離後脱分化の期間の後、細胞は徐々に培養に付着し週間培養することができます。アデノウイルスの細胞溶解物を効率的に単離された心筋細胞を形質導入するために使用されます。これらの方法は、心臓の生物学を研究するために、シンプルでありながら強力なモデルシステムを提供します。
Introduction
培養心筋細胞は、しばしば、インビトロで十分に制御された環境における細胞の挙動を監視するために使用されます。例えば、形態学的、電気的、生化学的、または機械的な電池特性は、定義された培地中で1,2、および小分子薬剤、ペプチド、遺伝子調節、3または電気的刺激に応答して操作された基板上に研究することができる。4細胞の含有量ができますまた、定義された共培養を使用して制御される。5これらのインビトロ実験は、大きな薬物または遺伝子スクリーニングにおいて有用であり、心筋細胞の生物学に関わる研究の様々なタイプのためのインビボの方法で補います。
長期培養は、表現型の変化を達成するために長時間を必要とする実験的な道を可能にします。タイムリーな例は、脱分化、細胞周期に再進入し、細胞分裂は、典型的には、それ自体の上に検討されている成体哺乳類の心筋細胞の増殖、のものです週にveral日。ここで6,7、延長培養時間は、遺伝子操作、7,8-機能脱分化（ 例えば、筋節解体）9と、潜在的に転写脱分化を促進する。6その後の細胞周期の再入国と細胞分裂がさらに長い培養期間を必要とします分裂複数回の実験の目標である場合は特に、観察しました。心筋細胞周期の重要性は、既存の心筋細胞の脱分化と増殖は、ゼブラフィッシュおよび新生児マウスにおける心臓の再生を担うことが示されている心臓再生における最近のいくつかの重要な科学的な作品、の中心である。10月12日このように、可能性哺乳類の成体の心筋細胞に脱分化、細胞周期の再入国を刺激することは、人間の心臓の再生13-15で重要な問題のまま
I nは 、哺乳動物の心臓の細胞周期を研究するインビトロ実験筋細胞は、主に起因するマウスモデルと比較して、長期培養のが比較的容易に、ラットのソースを使用していた。16しかし 、マウス系は両方のin vitroおよびin vivoで有用である十分に特徴付けられたトランスジェニックツールや疾患モデルの豊富なリソースを提供していますプロトコル。例えば、Creをベース系統のトレースは、in vivoでの新生児マウスの心臓に心筋を再生するソースとして既存の心筋細胞の同定を可能にした。系譜トレース新生児マウス心筋細胞のin vitro試験において 、12は間質との相互作用の検討を有効にしています線維芽細胞との共培養による細胞。5しかし、その課題に、17ほとんど報告が成体マウスの心筋細胞の単離および長期的な文化の存在。18,19
単独での短期培養のための実行可能な成体マウス心筋細胞の単離は困難な作業であることが知られています。このprotocオールは、短期および長期の調査の両方に使用することができる成体マウスから実行可能な心筋細胞を達成する方法について順を追って説明します。このプロトコルを使用して単離された心筋細胞を効率的にアデノウイルスベクター週間20,21培養で形質導入することができます。これらの方法には、in vitroで心筋細胞生物学を研究するための強力なシステムを提供します。
本明細書に記載の方法は、ランゲンドルフ逆行性灌流のバリエーションを使用して、以前の作品からいくつかの要素に基づいています。18,22、いくつかのプロトコルは、短期培養および研究のための成体マウスの心筋細胞の単離に公開されているが、23-25 利点のこのプロトコルは、培養する能力孤立した心筋細胞の長期的です。これは、異所性遺伝子発現に関与すると、携帯リプログラミング戦略のように長期間を要する細胞プロセスの研究に有用であろう。
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Protocol
ここで説明するすべての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校施設内動物の使用およびケア委員会によって承認されています。
注：簡単に言えば、マウスの胸部から心臓を取り出した後、冠動脈の逆行性灌流を効率的にコラゲナーゼおよびプロテアーゼXIVと細胞外マトリックスを消化するために使用されます。心室はその後、機械的に分離し、単一細胞懸濁液中にろ過、分離されています。重力沈降は、それらの高い密度によって、線維芽細胞および内皮細胞などの間質細胞から分離された心筋細胞を単離するために行われます。精製された心筋細胞は、ラミニン被覆ポリスチレン上の週間培養し、アデノウイルス遺伝子ベクターで形質導入することができます。
1.心筋細胞の単離
- バッファ、外科駅と灌流装置を準備します
- タブに応じて、バッファとメディアを準備しますル1。
- 、水浴循環をオンに加熱された水ジャケットの出力は37℃の温度に達するように、入力温度を設定します。
- 70％エタノールで洗浄することによりきれいな灌流システム。その後、滅菌水のいくつかのボリュームをフラッシュすることにより、システムからのエタノールのすべての痕跡を削除します。
- 潅流緩衝液（ 表1）で灌流システムをロードします。最初の潅流緩衝液の2倍量のフラッシュその後、システムから水を抜きます。次に熱ジャケットの内側の列は、灌流緩衝液で満たされるように、灌流緩衝液でデッドスペースを埋めるが、脱泡チャンバは空です。
ヒント：空気の泡が脱泡室の下の行に存在しないことを確認してください。 、反抗気泡を除去すべてのストップコックを従事し、圧力が数秒間ラインの内側に構築できるようにするには。その後、口から噴出する高圧灌流バッファを許可する、下位コックをリリース。急速な流れとturbulenceは、灌流出口付近キャッチされた気泡を取り除くのに役立ちます。 - 大動脈カニュレーションのために使用される針で注射器を準備します。灌流緩衝液を満たした1mlシリンジに18 Gブラント針を取り付けます。気泡を除去し、ラボテープで解剖miscroscope照明の一方の腕に注射器アセンブリを固定します。
ヒント：ベベル針から平滑末端の針を作成するには、ワイヤーカッターと針シャフトを横断します。先端が平らになるまで研磨石で先端を磨きます。
注：カミソリの刃を使用して、カニューレ挿入針のシャフトを粗く、カニュレーション中に針から大動脈の滑りを軽減するために。いくつかの溝は針シャフトの先端から1cm以内に作成されるまで回転させながらハブと上軸によって針を固定し、その後、針シャフトの長軸に対して垂直に前後にかみそりを見ました。刃が鈍くなったときに、新しいカミソリに切り替えます。 - クリーンを配置挿管の間に心臓が含まれるように、解剖顕微鏡下のペトリ皿。カニューレの先端が視野の端に近いですが、解剖を妨害されないような照明アームを配置します。カニューレの先端がペトリ皿の縁の下にあることを確認してください。
注： -ペトリ皿に215ミクロンメッシュの正方形の小（7センチメートル2〜5）を配置し、解剖の間に心臓を固定化するのに役立ちます。心臓がこのメッシュ上に配置されると、それはスライドさせ、機械的操作の間に心臓の回転減らすために摩擦を作成します。 - 大動脈の確保のために使用されるカニューレ針のハブの周りに緩い二重止め結びで2縫合糸を結びます。
- ハート抽出およびカニューレ挿入
- 腹腔内注射を介してヘパリン（5 IU / g体重）を投与します。ヘパリンは、心臓に循環させるためにできるように、20分を待ちます。
- 腹腔内注入によってマウスを麻酔20％エチルカルバメート（2 mgのエチルカルバメート/ g体重）のイオン。 （ - 5分約3）マウスは深い麻酔下になるまで、密接に確認します。
注：ディープ麻酔がつま先のピンチと角膜反射の両方の欠如によって確認されました。マウスは8で深い麻酔に達していない場合 - 10分間、次にエチルカルバメートの追加の用量を投与します。麻酔への個々の応答は、マウスの間で変化するが、障害があっても後の反復投与深い麻酔を排除することが劣化したカルバミン酸エチルを、示している可能性があり、最初の投与の際に深い麻酔を入力します。劣化を防ぐために、各使用前エチルカルバメートの新鮮な溶液を調製します。 - 外科手術用テープで各肢を固定することによって、手術台にマウスを固定化します。 70％エタノールのリベラルな量で切開領域を消毒します。パットは、ラボ・ワイプで乾燥させます。
- ちょうど胸骨下の組織鉗子で皮膚を持ち上げます。 thro切断、小さなハサミで横切開を作ります皮膚や腹部ぐふ。
- 優しく胸骨経由で胸郭を持ち上げるために止血剤を使用してください。小さな解剖ハサミを使用して、腋窩に向かってV字状に切開部を拡張します。第一リブを切断し、それぞれの側にダイアフラムを穿刺。
- 止血剤で胸郭を持ち上げて、完全にダイヤフラムを横断する小さな虹彩のはさみを使用し続けます。心臓に穴を開けないように注意してください。
- 添付の止血剤を使用して吻方胸郭を撤回し、迅速しかし慎重に両側の腋窩に向かって胸郭を切断することにより、V字状の切開を拡張します。完全に胸郭の中央部分を撤回し、所定の位置に保持するために取り付けられた止血剤を置きます。
- 細かい鉗子を使用して、心膜を削除します。
- 緩やかに湾曲鉗子を用いて心臓を持ち上げながら、心に添付静脈と動脈を横断。すぐに筋収縮を遅くする氷冷潅流緩衝液に心を置きます。
- ペトリ皿の下に心を置きます解剖顕微鏡（解剖中に固定化するのに役立つ215ミクロンメッシュの小片上の場所）。微細な虹彩のはさみを使用して、任意の過剰な非心臓組織をトリミングします。大動脈の近くにカットするときは注意してください。
- brachioencephalic動脈の近くに大動脈を横断し、気泡や組織破片が開口部を入力させないように注意してください。
- 液面がカニューレの開口部を超えて上昇するような氷冷灌流緩衝液で心臓を含むペトリ皿を埋めます。先端が大動脈弁のすぐ遠位であるように、カニューレ上に大動脈をシース。
TIP：ややカニューレの端部に開発している可能性の気泡を除去するために前のカニューレのカニューレのシリンジを押し、空気塞栓症の危険性を低減します。また、大動脈を外装しながら、気泡を導入することを避けるために、溶液の表面下にカニューレの先端と大動脈を保ちます。 - ダウン予め結んだ7-0絹縫合糸をスライドさせちょうど針の先端上記カニューレ挿入針と位置のシャフト。細かい鉗子で結び目を締めます。単に最初の上方に配置された第2の縫合糸を使用してこの手順を繰り返します。
注：針の先端が前と締めた後、大動脈弁の上にまだあることを確認してください。 - ゆっくり冠状脈管構造を通して灌流緩衝液0.5mlを取り出し、シリンジを押します。
注：カニュレーションが成功した場合、血液が冠血管系を残し、背静脈と動脈の外にプールして可視化されます。
重要：灌流を初期する（隔膜を穿刺特に、）胸腔の開口部からの時間は、低酸素暴露を低減し、孤立した心筋細胞の生存と健康を最大化するために最小化されるべきです。理想的には、この時間は5分未満でなければなりません。
- かん流
注：逆行性灌流装置は、好都合には、標準的な実験室のベンチにクリーンな環境で動作や無菌性を最大にするために、層流フード内に配置することができます。潅流が完了した後、しかし、研究は、汚染を最小限にするために、層流の下で行われるべきです。- 静かに、しかし確実にゆっくりと前後にねじることによって（滅菌手袋を使用して）注射器からカニューレハブを削除します。注射器の外カニューレ挿入針を引きながら、ゆっくり灌流中の気泡を防止するために、針ハブに潅流バッファを取り出します。
- 灌流出口ポート下から再循環キャッチチューブを外し、廃棄物のキャッチビーカーと交換してください。灌流出口に固定されているルアーアダプタに針ハブを取り付け（ 図1、図2）は、水ジャケットに、ポンプが最小設定で動作している間（15 RPMを~6 ml /分）。
ヒント：ルアーアダプタに針ハブを接続する場合、滴下灌流バッファがコンできるようにします気泡の導入を避けるために針ハブ内の液体にNECT。 - 潅流緩衝液8mlを入口ホースによって吸引されるまで、再循環せずに心臓を灌流。
注：このステップでは、入口ホースにより吸引灌流緩衝液の容量は、心臓を介してポンピング潅流緩衝液の15ミリリットルの合計を与え、潅流システムのための7ミリリットルのデッドボリュームを前提としています。 - 灌流バッファからインレットチューブを取り外します。空気は、システムのデッドボリューム未満のための入口により吸引することができます。
注：このステップで吸引した空気の体積は（ステップ1.3.7を参照）冠状血管系に入る空気を防ぐために調整されなければなりません。 - ただ、チューブの底の上に、消化緩衝液（ 表1）に入口チューブを置きます。ゆっくりフィードと入口管は、管を過剰充填を避けるために十分な量を吸引することができます。
- 視覚化との間に気泡をたどります潅流緩衝液および消化緩衝液、それは熱ジャケットを通って移動します。ヒートジャケット気泡が脱発泡室に達すると落下し始めるの中央に灌流バッファのレベルを確認します。消化緩衝液は、脱発泡室に達すると、加熱ジャケット内の液体のレベルは安定したままです。
重要：灌流バッファのレベルが低下しすぎると、出口コックを閉じ、ベントコックを開きます。 （ - 出口ポート上記5インチ3）レベルが快適なレベルに上昇することを可能にします。その後、灌流ポンプを停止し、ベントコックを閉じます。出口ポートのストップコックを開き、灌流ポンプを再起動します。 - 心臓から出てくるソリューションをご覧ください。潅流バッファの最後に心臓から離れて消化緩衝液は、心臓を循環開始すると、淡褐色の透明から色の変化は、コラゲナーゼの存在下に観察されます。
- 消化緩衝液で心臓を灌流15分 - 約10のために。心臓はコラーゲンが分解されると、それは機械的支持を失うとして前かがみ開始します。
- 機械的解離および精製
- 乾燥ペトリ皿中の鉗子と場所とのカニューレから心臓を取り出します。素早く細かいアイリスのはさみを使用して、余分な心室組織をトリミングします。洗浄する潅流緩衝液を含有する新鮮なペトリ皿に心室を転送します。無菌フードにペトリ皿を移動して、新鮮な、乾燥したペトリ皿に心室を転送します。
- ヒートジャケットから消化緩衝液の7.5ミリリットルを収集し、1 M CaCl 2を2.8μlを添加、反転により混合します。シャーレに心室にCaCl 2を消化バッファーの3ミリリットル- 2を追加します。
注： の Ca 2+の濃度は、300から700μMまで上昇させます - ほとんどの作品が1mm 3よりも小さくなるように迅速に、細かいピンセットで心室組織を粉砕します。残る追加シャーレ内の解離した心室へのステップ1.3.2からのCa 2+補足消化緩衝液をると穏やかに撹拌することによって混合します。
- 5％CO 2で37℃インキュベーターでペトリ皿を置きます。十分な心筋細胞は、（下記の注を参照）組織から解放されるまで、ペトリ皿ごとに2分を攪拌します。
注意：インキュベーションの長さは、実験の必要性に応じて微調整するために、消化の程度を調整する必要があるかもしれません。一般に、より長いインキュベーション時間は、収率および純度を増加させるが、細胞付着及び生存率を低減することができます。 5 - （ -心あたり10×10 5細胞〜5）10分は、高い歩留まりを達成するのに十分です。 - 層流フードに戻ってシャーレを転送します。 45°の角度でカットトランスファーピペットを使用して、静かにさらに解離する組織をピペット。
- コーンに215ミクロンメッシュを折り畳むと50ミリリットルの円錐の上に保持するために、滅菌手袋を使用してください。ピペットメッシュ上に解離した組織懸濁液、ろ液を50mlコニカルに排出することができます。最初の濾液と組み合わせることで、メッシュでペトリ皿から心筋細胞を洗浄するために予め温めておいた停止緩衝液（ 表1）の7.5ミリリットルを使用してください。
注： の Ca 2+の最終1.1 mmまで上昇させ、停止緩衝液中の最終2.5％FBS、プロテアーゼ活性を中和します。 - 15ミリリットルの円錐形に細胞懸濁液を移し、15分間重力によって解決することができます。
- 溶液100μl細胞を上回ったまま - 慎重にのみ50ようなトランスファーピペットで上清を除去します。予熱した、平衡化した培養培地（ 表1）の10ミリリットルを加え、穏やかに転倒混和します。心筋細胞を15分間重力によって解決することができます。
ヒント：所望のようにステップ1.4.8を繰り返し、純度を高めるために。 - 100μlのO - 慎重にトランスファーピペットようにだけ50で上清を除去F溶液は、細胞の上に残ります。
2.心筋細胞培養
- プレコート組織培養処理ペトリ皿2時間ラミニン（10μg/ ml）および37℃での店舗との事前の細胞をプレーティングします。直前メッキ、組織培養プレートからラミニン溶液を吸引します。 MEMまたはPBSで1回洗浄し、非吸着ラミニンを除去するために、残液を吸引します。
- 静かに転倒混和し、平衡化した培養培地は、所望の細胞密度を達成するために、予め温め十分を追加します。 （ - 20×10 4細胞/ cm 2、典型的には5）プレートを培養容器への細胞の濃度を所望します。心筋細胞分離の収率を評価するために、顕微鏡下で密度をチェックすることにより、血球計またはテストプレートを介して細胞を数えます。プロトコルのこの段階で1.0×10 6細胞-成体マウスの心臓は、典型的には0.5を提供します。
ヒント：96ウェルプレートを使用している場合は、千μlのmicropipを使用せん断力による細胞の損傷を最小限にするために45°の角度で先端カットとETTE。これは、気泡の導入を最小限にするために、細胞懸濁液の吐出時、ウェルの底に触れているように、ピペットチップを置きます。 - 5％CO 2および95％湿度で37℃のインキュベーターに速やかに細胞培養皿を動かします。酸性化を防止するために、必要に応じてメディアを変更します。すべての1から5日間は細胞密度に依存。細胞培養表面への付着を容易にするために、6日 - 最初の3時の培養皿の取り扱いを最小限に抑えます。
注：細胞が完全に取り付けられていない場合、半培地交換を行い、メディアの変更時にセルの乱れを最小限に抑えるため。ただ、メディアの表面の下にピペットチップを保持したまま、ゆっくりとメディアを吸引除去します。そして、ゆっくりと培養皿の壁にちょうど媒体の表面上にピペットチップを保持することによって、追加のメディアを追加。 - 心筋細胞の生存率を評価するには、チェック明視野顕微鏡下で形態学。新たに単離した心筋細胞は、明視野照明下シャープ、明確なエッジ（ 図2）とおおよそ棒状の形態を維持します。
注：トリパンブルーで細胞を染色することによって生存率を確認します。 - 心筋細胞の単離の純度を評価するために、心筋細胞を識別するために、細胞形態を確認してください。総細胞を同定するためにヘキスト33342で核を染色。
注：心筋細胞は、それらの特徴的な形態（棒状）により非心筋細胞から識別することができ、サイズ（約100から200ミクロンの長さで）。また、新たに単離された心筋細胞は、例えばα-アクチニン26（ 図3C、D）または心筋トロポニンTを27として、心筋細胞特異的マーカーに対する陽性に染色されます
アデノウイルスと3遺伝子導入
- 確立されたMを使用してアデノウイルスの細胞溶解物を調製しethods 21アデノウイルスプロデューサー細胞10の細胞溶解物を使用して心筋細胞に形質導入します。単離後0日または1日目に、慎重に心筋細胞を含む培地に細胞溶解物を追加します。
注： - 72時間高力価のアデノウイルス調製物は約48で強い発現を達成します。実験計画に合わせて、感染の多重度を調整します。
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Representative Results
野生型大人のICR（CD1）マウスの心臓は、一般的に成功したアイソレーション〜500,000百万〜1心筋細胞が得られます。すぐに分離した後、細胞は無傷のサルコメアとほとんど棒状の外観（ 図3A）を維持し、心筋収縮を伴う機能的研究のために使用することができます。 （90％以上）の棒状の心筋細胞の高い割合は、効果的な灌流および消化の指標です。生存可能な心筋細胞が大きくなる（〜100 -長さが200μm）とし、明視野照明（ 図3A）の下でシャープな外膜を持っているように見えます。例えばα-アクチニンなどの心筋細胞特異的筋節マーカーのための免疫染色、明確なサルコメアバンドパターン（ 図3C）になります。 DAPIで形態素解析及び核染色と組み合わせて、免疫染色は、単離された心筋細胞の純度を評価するために使用することができます。 FIBRoblastsだけ分離した後、小さくて丸いですが、すぐに付着し、細胞培養プラスチック上に薄い広げ、このように心筋細胞から容易に区別を可能にします。
棒状心筋細胞の低い割合は失敗分離の指標です。これは、心臓が動物から抽出された後すぐに、大動脈にカニューレを挿入するために、障害に起因することができます。非効率的な灌流は、空気塞栓症または例えば、誤ったカニュレーションのために、また、心筋細胞の形態および生存率に影響を与えることができます。
文化の中で、数日後、心筋細胞は丸い形態（ 図3B）を想定します。 1以内- 2週間、ライブ心筋細胞は、基板に付着した （ 図3D、E）を拡散始めます。死んだ細胞は、トリパンブルーを含めることによって同定することができます。成功した分離と文化が生きて心肺約50％が得られます1週間後の筋細胞。線維芽細胞などの非心筋細胞による汚染は、それらの増殖能に、後の培養におけるこれらの細胞の割合が高いことになります。これは、純度を高めるために、および/ またはプレめっきを介して重力sedimentationsの数を増加させることによって回避することができる。28
72時間（ 図3E） -アデノウイルスで形質導入48内の強力な遺伝子発現を達成するために使用することができます。アデノウイルス血清型5が原因coxackieアデノウイルス受容体の高発現にin vitroで成体マウスの心筋細胞を形質導入で効率的ですが、使用するメディアの種類に依存してもよい。20
図1. 心筋細胞分離装置および計測。マウスを抽出するために使用される（A）手術器具心臓と上から下へ、大動脈にカニューレを挿入：止血、組織鉗子、湾曲鉗子、デュモン＃5細かい鉗子、小さな切開はさみ、細かいアイリスはさみ、ファインスクイーズハサミ（B）マウス心臓を消化するために使用さランゲンドルフ灌流システム。 。潅流緩衝液は、灌流ポンプにより入口管（1）を介して吸引されている（2）及び温水ジャケットの入口ポートにポンプ出口管（3）〜（4）。潅流バッファは、それらが螺旋ガラス管、脱泡チャンバを通って移動するにつれて温水ジャケットによって暖められ、その後ストップコックによって接続された灌流出口ポート（5）に取り付けられたカニューレ挿入針から外れています。以下のコニカルチューブは、入口管を通して再循環さ灌流バッファを、キャッチ。圧力ポート（6）、コンプライアンスポート（7）及び（8）一定の流量を維持するために灌流の間閉じたまま通気。ウォータージャケットは番目から入射循環水浴によって加熱されますEジャケット入口（9）と出口（10）ポート。リングスタンドは、垂直位置（赤クランプ、紫色のコニカルチューブラック下の黒ベース）に加熱された水ジャケットを保持するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.灌流システムの回路図の概要。原稿にいう灌流装置の重要な部分が標識されている。灌流緩衝液の流れの方向は矢印で示されています。大動脈カニューレの位置に注意し、先端が半透明、大動脈を通して見えるはず、それは大動脈弁の上方に配置されている保証されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 成体マウスの心筋細胞を単離しました。心筋細胞は 8,000細胞/ cm 2 プロトコルここで説明したように（A）。ラミニン被覆96ウェルプレート上に孤立し、播種した新しく単離した心筋細胞、播種し、約。新たに単離し、生存可能な心筋細胞は約現れる鋭いエッジ（白矢印）で棒状のことに注意してください。しかし、明視野下での拡散外膜を有すると思われる心筋細胞は死んでいます。培養の最初の数日間の間に、心筋細胞は丸みを帯びた形状（B）を前提としています。（C）αアクチニンの免疫染色（緑）は、D1単離後に心筋細胞に特徴的な筋節バンディングを明らかにする。青色で表示核染色（DAPI）。上部示すように、下側画像に概説領域の画像をズーム（D） 。（E）明視野および落射蛍光画像UT南西にあるロバート・ジェラードからの贈り物）。細胞は、約18,000細胞/ cm 2を播種し、細胞当たり約800プラーク形成単位（PFU）の感染多重度を用いて、0日目に形質導入しました。スケールバー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 心筋細胞の単離緩衝液（CIB） | |||
| マグの下できれいなビーカーに超純水900ミリリットルを追加します。磁攪拌。 | |||
| 示されているように、テーブル内のバッファコンポーネントを追加します。 | |||
| 成分 | MW | 最終濃度（mM）の | 1×（G / L） |
| NaClを | 58.44 | 120 | 7.013 |
| 塩化カリウム | 74.55 | 5.4 | 0.403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268.07 | 0.33 | 0.088 |
| MgSO 4・7H 2 O | 246.48 | 0.5 | 0.123 |
| タウリン | 125.1 | 30 | 3.753 |
| BDM | 101.1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238.3 | 25 | 5.958 |
| グルコース | 180.16 | 22 | 3.964 |
| pH値のウィットを調整しますH 5 M NaOHで。 | |||
| 超純水で1リットルにボリュームを調整します。 | |||
| 滅菌フィルターワット/ 0.22μM真空フィルター。 | |||
| 心筋細胞の単離緩衝液1リットル当たり0.1 U / mlのインスリンの0.5μlを添加します。 | |||
| 潅流緩衝液 | |||
| 成分 | 最後の | 容量（ml） | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA（0.4M） | 0.4 mMの | 0.2 | |
| 合計 | - | 200 | |
| 消化緩衝液 | |||
| 成分 | 最後の | 量 | |
| CIB | - | 15ミリリットル | |
| 塩化カルシウム（1M） | 300μM | 4.5μlの | |
| プロテアーゼXIV | 0.2 mg / mlで | 3ミリグラム | |
| コラゲナーゼII | 2.4 mg / mlで | 36 mgの | |
| 合計 | - | 15ミリリットル | |
| 停止緩衝液 | |||
| 成分 | 最後の | 容量（ml） | |
| 潅流緩衝液 | 95％ | 14.25 | |
| 塩化カルシウム（1M） | 1.5 mMの | 22.5 | |
| FBS | 5％ | 0.75 | |
| 合計 | - | 15ミリリットル | |
| 培地 | |||
| 成分 | 最後の ％ | 容量（ml） | |
| MEM培地 | 90％ | 90 | |
| FBS | 10％ | 10 | |
| Primocin | 0.2％ | 0.2 | |
| 合計 | 100％ | 100ミリリットル | |
| 培地を37℃、5％二酸化炭素で平衡化することを可能にします。 | |||
表1： ソリューションおよびバッファ。
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Discussion
孤立した心筋細胞の全体的な健康状態は、このプロトコルのいくつかの重要な側面に依存します。まず、灌流に対する心臓の抽出から時間が重要であり、5分以内に行われるべきです。カルシウムの除去は、細胞間相互作用を解離するのに役立ちますが、負の細胞の健康、長期的に影響を与える可能性がある。29-32したがって、我々はそれが十分なEGTA（エチレングリコール四酢酸）キレート化により、灌流の最初の数分の間にカルシウムを除去するために見つけます、 22しかし、すぐに消化し 、その後の工程中にカルシウムを復元します。
プロテアーゼXIVの使用が大幅に単独のコラゲナーゼに比べて消化効率を向上させることができます。これは、原因コラゲナーゼバッチ変動に18,24の矛盾を低減し、重力沈降の間の分離を容易にすることによって、心筋細胞の純度を増加させます。それにもかかわらず、過剰消化培養基板への効率的なアタッチメントので、微妙なバランスの私を防ぐことができます細胞接着及び生存能力を維持しながら、細胞収率および純度を最適化するために必要なのです。したがって、プロテアーゼ消化の長さの濃度は、実験の目的に合わせて変更することができます。一般的には、消化の少ない程度は、心筋細胞の付着と生存率を向上させます。トリプシンの使用は、いくつかの心筋細胞の単離プロトコルで報告されている。18しかし、ここで使用するプロテアーゼカクテルにトリプシンの添加（コラゲナーゼおよびプロテアーゼXIV）は、おそらく過剰消化または切断に、培養中の心筋細胞の長期生存率を低下させます本質的な表面及び/又は細胞外マトリックスタンパク質。
単離の間ブタンジオンモノオキシム（BDM）を含めることは、心臓の筋肉の収縮を抑制し、ひいては端子拘縮、エネルギー消費、およびカルシウムパラドックスによる負の影響を軽減します。29,33しかし、我々の経験では、培養前BDMの除去はdedifferentiatioを促進nおよび細胞は2次元での文化に適応することができます。
2-D培養物への長期適応は、収縮性などの心筋細胞の機能的側面に影響を与える可能性があることに留意することが重要です。ネイティブサルコメア組織は無傷のままである場合にこのように、収縮性および電気生理学実験は、単離後すぐに実行する必要があります。さらに、任意のインビトロの実験と同様に、培養中の細胞は、体液性または免疫シグナル伝達などの生体内に存在する特定の外因の影響、を欠いています。一方、定義された共培養は、心筋細胞および他の細胞型との間の相互作用を研究するために実施することができる。5,34また、 インビトロ培養において培地中で規定された分子信号と心筋細胞の挙動を研究するために使用することができます。したがって、実験の全体的な目標は、慎重に検討し、この培養系の限界と利点を比較検討する必要があります。
。35 FBSおよび他の動物由来の血清は、細胞生理に影響を与える可能性が未知の成分を含むことに留意すべきです。36,37 FBSにおける成長因子のよく感謝存在にもかかわらず、ここで提示38心筋細胞培養物は増殖しません。むしろ、細胞周期のブロックは、ex vivoで 、開発の周産期の間にそれらの細胞周期の出口から維持。12,39このプロパティは、心臓再生医療の分野の主要な関心事である成体マウスの心筋細胞の永続的なプロパティであると思われます増殖性の表現型への哺乳類成体心筋細胞の復帰が3,26,40-42は注目すべきことに、心筋細胞が細胞周期を再入力するために必要とされるどの程度脱分化現在不明である。重く追求目標であったが、contributioました下等脊椎動物における再生への脱分化のnはよくさらに43,44,10,11に支持されて、脱分化はますます筋原繊維分解6,12,9を含む、少なくとも機能レベルで、哺乳動物系で心筋細胞の増殖と心臓再生に観察されていますしたがって、培養中の心筋細胞の分化の状態を注意深く研究目標のニーズに応じて考慮され、変調されるべきです。このように、培養条件は、潜在的にさらに血清濃度、使用定義された血清代替物または無血清培地を減少させるために修飾することができます。例えば、整理サルコメアを示す成体ラット心筋細胞は、血清なしで長期培養したが、例えば、線維芽細胞増殖因子などの増殖因子、上皮成長因子、およびトリヨードチロニンは、規定培地で使用した。45これは、同様の培地処方物、または潜在的に他のことが考えられますこのようなdifferentiから適合させたものとして製剤エーションプロトコル、46は高い組織サルコメア構造を示す、培養中の十分に分化成体マウス心筋細胞を維持するために使用されてもよいです。代替の処方物はまた、実験の必要性に応じて（例えば、高度に脱分化した心筋細胞のような）他の表現型6を達成するために開発され得るが、さらなる作業が必要となります。
線維芽細胞の役割は、新生児マウス心筋細胞周期5および長期培養中（肥大IL6シグナル伝達を介した）成体マウスの心筋細胞分化の制御に関与している。19したがって、培養中の線維芽細胞の成長は実験的な解釈で考慮されるべきです。培養中の線維芽細胞の増殖は、プレめっき工程を経て、シトシンアラビノシド19（のAraC）等の化合物を制限増殖を添加することによって制御することができる。28ただし 、のAraCもそう代替、心筋細胞の増殖を阻害します方法は、心筋細胞の細胞周期に関する研究において線維芽細胞の増殖を制御するために使用されるべきです。ここで説明するプロトコルでは、初期の心筋細胞の純度は、重力沈降工程を繰り返すことにより向上させることができる（1.4.8を参照）。
本明細書の方法は、成体哺乳類の心筋細胞周期遮断の性質を研究するために使用することができるインビトロシステムを提供します。例えば、ラットやモルモットなどの他の生物由来の初代細胞とは対照的に、マウスの主心筋細胞は、ノックインモデルのトレースなどのCreベースの系統などの強力な、よく特徴付けられた遺伝子ツールの富を提供し、47に容易に使用することができます既存の心筋細胞に由来する細胞を同定する。12,48はまた、主要な成体マウス心筋細胞46は、それらconvenienにもかかわらず、その細胞株および分化したES又はIPSC細胞とは異なり、細胞周期の遮断をもたらす天然発生の条件に供されています大きな薬物スクリーニングのCEおよび適応は、2、成人心筋細胞周期の出口の性質をプロービング実験で限られた有用性を有し得ます。
このプロトコルは、信頼性の高い単離するための方法および培養成体マウスの心筋細胞を概説します。いくつかの方法が以前に短期留学のための成体マウスの心筋細胞の単離を実証しているが、現在までに、いくつかの報告は、成人マウス心筋細胞の長期培養の存在。18,19培養中の成体マウスの心筋細胞を維持する能力を有効にする必要があります長期的な検査を必要とする実験条件下で心筋細胞生物学のin vitro研究。例えば、遺伝子発現は、典型的には、完全な発現を達成するために数日を必要とするアデノウイルスベクターを使用して操作することができます。その後の表現型の変化と分析は、実験の目的に応じて時間のさらに長い期間が必要な場合があります。ここで紹介する方法は、成体マウスcardiomの文化を許します数週間yocytes。これは、細胞周期の調節に関係するもののような心筋細胞生物学の慎重な質問、の調査のための強力なシステムを提供する必要があります。
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Acknowledgments
このプロジェクトは、（サンドラー財団によって部分的に資金提供）画期的な生物医学研究のためのUCSFプログラム、独立賞にNIH経路（R00HL114738）、およびエドワード・マリンクロット・ジュニア財団によって資金を供給されました。 JJは、NIH（T32HL007731）からポスドクフェローシップによってサポートされていました。著者は、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。この作品の内容について、単独で責任を負うものとします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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