Abstract
Cultivos de cardiomiocitos se pueden utilizar para estudiar la biología de los cardiomiocitos usando técnicas que son complementarios a los sistemas in vivo. Por ejemplo, la pureza y la accesibilidad de cultivo in vitro permite un control preciso sobre los análisis bioquímicos, imágenes en vivo, y electrofisiología. cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos ofrece acceso a los enfoques experimentales adicionales que no se pueden completar en cultivos de corto plazo. Por ejemplo, la investigación in vitro de desdiferenciación, ciclo celular de reentrada, y la división celular hasta el momento ha sido en gran parte restringido a los cardiomiocitos de rata, que parecen ser más robusto en cultivo a largo plazo. Sin embargo, la disponibilidad de un amplio conjunto de herramientas de líneas de ratones transgénicos modelos de enfermedad y bien desarrollados sistemas de ratón hacen atractiva para la investigación cardiaca. Aunque existen varios informes del aislamiento de los cardiomiocitos de ratón adulto, pocos estudios demuestran su cultivo a largo plazo. Se presenta aquí, es un método paso a paso para elel aislamiento y la cultura a largo plazo de los cardiomiocitos de ratones adultos. En primer lugar, retrógrada perfusión Langendorff se utiliza para digerir de manera eficiente el corazón con proteasas, seguido de purificación gravedad sedimentación. Después de un período de desdiferenciación después del aislamiento, las células se unen gradualmente a la cultura y pueden ser cultivadas durante semanas. lisado celular Adenovirus se utiliza para transducir eficientemente los cardiomiocitos aislados. Estos métodos proporcionan un potente sistema simple, modelo para estudiar la biología cardiaco.
Introduction
Cultivos de cardiomiocitos se utilizan con frecuencia para controlar el comportamiento celular en un entorno bien controlado in vitro. Por ejemplo, las propiedades de células morfológicas, eléctricos, bioquímicos o mecánicos pueden ser estudiados en sustratos de ingeniería, 1,2 en medios definidos, y en respuesta a fármacos de moléculas pequeñas, péptidos, regulación génica, 3 o estimulación eléctrica. 4 El contenido celular pueden también se controlan mediante co-cultivos definidos. 5 Estos experimentos in vitro son útiles en grandes pantallas de drogas o genéticos y complementan los métodos in vivo para diversos tipos de investigaciones relacionadas con la biología de los cardiomiocitos.
cultivo a largo plazo permite avenidas experimentales que requieren largos períodos de tiempo para lograr un cambio fenotípico. Un ejemplo oportuno es el de la proliferación de los cardiomiocitos de los mamíferos adultos, donde desdiferenciación, el ciclo celular de reentrada, y la división celular típicamente se estudiaron más de síVeral días a semanas 6,7. En este caso, el tiempo de cultivo extendido facilita la manipulación genética, 7,8 desdiferenciación funcional (por ejemplo, el desmontaje del sarcómero) 9 y desdiferenciación potencialmente transcripcional. 6 subsiguiente ciclo celular de reentrada y la división celular requiere períodos de cultivo aún más largos observar, sobre todo si múltiples rondas de división son el objetivo experimental. La importancia del ciclo celular de cardiomiocitos es central para varios trabajos científicos reciente de la clave en la regeneración del corazón, donde el desdiferenciación y proliferación de cardiomiocitos pre-existentes ha demostrado responsable de la regeneración del corazón en el pez cebra y ratones neonatales. 10-12 Por lo tanto, la posibilidad para estimular la desdiferenciación del ciclo celular y la reentrada en cardiomiocitos adultos de mamíferos sigue siendo una cuestión clave en la regeneración del corazón humano 13-15
E n experimentos in vitro que estudian el ciclo celular de los mamíferos cardiomiocitos han utilizado predominantemente fuentes de rata, debido a su relativa facilidad de cultivo a largo plazo en comparación con los modelos de ratón. 16 Sin embargo, los sistemas murinos ofrecen una rica fuente de herramientas transgénicas bien caracterizados y modelos de enfermedad que son útiles en tanto in vitro como in vivo protocolos. Por ejemplo, el trazado de linaje basado-Cre ha permitido la identificación de los cardiomiocitos pre-existentes como una fuente de regeneración de miocardio en el corazón neonatal de ratón in vivo. 12 Estudios in vitro de linaje de trazado de los cardiomiocitos de ratones neonatales han permitido el estudio de las interacciones con estroma células a través de co-cultivo con fibroblastos. 5 Sin embargo, debido a sus retos, existen pocos informes 17 del aislamiento y la cultura a largo plazo de los cardiomiocitos de ratones adultos. 18,19
El aislamiento de los cardiomiocitos viables de ratón adulto de cultivo a corto plazo solo se sabe que es una tarea difícil. este protocol proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo lograr los cardiomiocitos viables de ratones adultos que pueden ser utilizados tanto para corto plazo, así como las investigaciones a largo plazo. Cardiomiocitos aislados utilizando este protocolo pueden ser transducidas eficientemente con vectores adenovirales 20,21 y cultivadas durante semanas. Estos métodos proporcionan un potente sistema para estudiar la biología de los cardiomiocitos in vitro.
Los métodos descritos en este documento se basan en varios elementos de obras anteriores utilizando variaciones de la perfusión retrógrada Langendorff. 18,22 Aunque varios protocolos se han publicado sobre el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón para el cultivo a corto plazo y el estudio, la ventaja de 23-25 este protocolo es la capacidad de la cultura del cardiomiocitos aislados a largo plazo. Esto será útil en el estudio de los procesos celulares que implican la expresión de genes ectópico y que requieren períodos prolongados de tiempo, tales como en las estrategias de reprogramación celular.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de California, San Francisco.
NOTA: En pocas palabras, después de extraer el corazón desde el tórax del ratón, la perfusión retrógrada coronaria se utiliza para digerir eficientemente la matriz extracelular con colagenasa y proteasa XIV. Los ventrículos A continuación se aíslan, mecánicamente disociados y se filtra en una sola suspensión celular. sedimentación por gravedad se realiza para aislar los cardiomiocitos, que se separan de las células del estroma como fibroblastos y células endoteliales por su alta densidad. Los cardiomiocitos purificadas pueden ser cultivadas durante semanas de poliestireno recubiertas con laminina y transducidas con vectores de genes de adenovirus.
Aislamiento 1. cardiomiocitos
- Preparar Los tampones, la estación quirúrgica y el aparato de perfusión
- Preparar los tampones y medios de comunicación de acuerdo con la TabLe 1.
- Activar el baño de agua circulante, ajustar la temperatura de entrada de manera que la salida de la camisa de agua calentada alcanza una temperatura de 37 ° C.
- sistema de perfusión limpia mediante el lavado con etanol al 70%. A continuación, eliminar todos los restos de etanol a partir del sistema mediante el lavado con varios volúmenes de agua estéril.
- Cargar el sistema de perfusión con tampón de perfusión (Tabla 1). En primer lugar el agua de drenaje del sistema, a continuación, enjuagar con 2 volúmenes de tampón de perfusión. A continuación, llenar el espacio muerto con tampón de perfusión de tal forma que la columna interior de la camisa de calor está lleno de tampón de perfusión, pero la cámara de eliminación de burbujas está vacía.
CONSEJO: Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la línea por debajo de la cámara de eliminación de burbujas. Para eliminar las burbujas de recalcitrantes, involucrar a todas las llaves de paso y permitir que la presión se acumule dentro de la línea durante unos segundos. A continuación, suelte la llave de paso inferior, permitiendo que el tampón de perfusión de alta presión a chorro de la toma; el flujo rápido y Turbulence va ayudar a desalojar las burbujas que se capturan cerca de la salida de perfusión. - Preparar una jeringa con la aguja que se utiliza para la canulación aórtica. Adjuntar una aguja roma 18 G a una jeringuilla de 1 ml lleno de tampón de perfusión. Eliminar las burbujas de aire y fijar el conjunto de jeringa a un brazo del iluminador de disección miscroscope con cinta de laboratorio.
TIP: Para crear una aguja sin punta de una aguja biselada, transecto el eje de la aguja con un alicate. Entonces afinar la punta con una piedra de lijar hasta que la punta es plana.
NOTA: Para reducir el deslizamiento de la aorta de la aguja durante la canulación, raspar el eje de la aguja de la canulación usando una hoja de afeitar. Fije la aguja por el cubo y el eje superior, luego vio la maquinilla de afeitar de ida y vuelta perpendicular al eje largo del eje de la aguja mientras se gira hasta varias ranuras se han creado dentro de 1 cm de la punta del eje de la aguja. Cambiar a una nueva maquinilla de afeitar cuando la cuchilla está gastada. - Coloque una limpiaplaca de Petri debajo del microscopio de disección para contener el corazón durante la canulación. Coloque el brazo iluminador tal que la punta de la cánula se encuentra cerca del borde del campo de visión, pero no obstruir la disección. Asegúrese de que la punta de la cánula está por debajo del borde de la placa de Petri.
NOTA: Para ayudar a inmovilizar el corazón durante la disección, coloque una pequeña (~ de 5 - 7 cm 2) cuadrado de malla de 215 micras en la placa de Petri. Cuando el corazón se coloca en esta malla, se creará fricción para reducir el deslizamiento y la rotación del corazón durante la manipulación mecánica. - Lazo 2 de suturas con sueltos nudos simples dobles alrededor del cubo de la aguja de cánula para ser utilizado para la fijación de la aorta.
- La extracción y la canulación del corazón
- Administrar heparina (5 UI / g de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal. Esperar 20 min para permitir que la heparina circule al corazón.
- Anestesiar el ratón por inyección intraperitonealion de carbamato de etilo 20% (2 mg de acetato de carbamato / g de peso corporal). Observar de cerca hasta que el ratón está bajo anestesia profunda (aproximadamente de 3 - 5 min).
NOTA: La anestesia profunda se confirmó por la falta de tanto pizca dedo del pie y los reflejos corneales. Si el ratón no ha alcanzado la anestesia de profundidad por 8-10 min, a continuación, administrar una dosis adicional de carbamato de etilo. Aunque las respuestas individuales a la anestesia variarán entre los ratones, el hecho de entrar en la anestesia profunda primera dosificación puede indicar carbamato de etilo degradada, que puede impedir anestesia profunda, incluso después de la administración repetida. Para evitar la degradación, preparar una solución fresca de carbamato de etilo antes de cada uso. - Inmovilizar el ratón a la plataforma de la cirugía, asegurando cada extremidad con cinta quirúrgica. Desinfectar el área de la incisión con una generosa cantidad de etanol al 70%. Secar con un laboratorio de borrado.
- Levantar la piel con pinzas de tejido justo debajo del esternón. Hacer una incisión lateral con pequeñas tijeras, corte excelentes referenciasuf la piel y el abdomen.
- Utilice pinzas para levantar suavemente la caja torácica a través del esternón. El uso de pequeñas tijeras de disección, extender la incisión en forma de V hacia la axila. Cortar a través de la primera costilla y la punción de la membrana en cada lado.
- Continúe levantando la caja torácica con pinzas hemostáticas y el uso de pequeñas tijeras iris para seccionar completamente la membrana. Tenga cuidado de no perforar el corazón.
- Retraer la caja torácica rostral usando pinzas hemostáticas adjuntos y rápidamente sino que se extienden cuidadosamente la incisión en forma de V, cortando a través de la caja torácica hacia la axila en ambos lados. Retraer la sección central de la caja torácica totalmente, y establecerán las pinzas hemostáticas unidos a mantenerlo en su lugar.
- Retire el pericardio mediante unas pinzas finas.
- Mientras levanta suavemente el corazón utilizando pinzas curvas, seccionar las venas y arterias unidos al corazón. Colocar inmediatamente el corazón en tampón de perfusión enfriado con hielo para frenar la contracción muscular.
- Coloque el corazón en una placa de Petri bajoun microscopio de disección (lugar en un pequeño trozo de 215 micras de malla para ayudar a inmovilizar durante la disección). Recorte cualquier tejido no cardiaco usando el exceso de iris tijeras finas. Tenga cuidado al cortar cerca de la aorta.
- Seccionar la aorta cerca de la arteria brachioencephalic, y tener cuidado de no dejar burbujas o restos de tejidos entran en la abertura.
- Llene la placa de Petri que contiene el corazón con tampón de hielo frío de perfusión de tal forma que el nivel de líquido sube por encima de la abertura de la cánula. La vaina de la aorta en la cánula de tal manera que la punta está justo distal a la válvula aórtica.
TIP: Para reducir el riesgo de embolia gaseosa, presione ligeramente la jeringuilla en la cánula de antes de la canulación con el fin de eliminar posibles burbujas de aire que puedan haberse desarrollado en el extremo de la cánula. Además, mantener la punta de la cánula y la aorta debajo de la superficie de la solución para evitar la introducción de burbujas mientras que recubre los aorta. - Deslice una sutura previamente atado seda 7-0 abajoel eje de la aguja de la canulación y la posición justo por encima de la punta de la aguja. Apretar el nudo con unas pinzas finas. Repita este paso con una segunda sutura colocada justo encima de la primera.
NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja está todavía por encima de la válvula aórtica antes y después de apretar. - Presione lentamente la jeringa para expulsar 0,5 ml de tampón de perfusión a través de la vasculatura coronaria.
NOTA: Si la canulación fue exitoso, la sangre se visualizará de salir de la vasculatura coronaria y la puesta en común de las venas dorsales y arterias.
IMPORTANTE: El tiempo desde la apertura de la cavidad torácica (en particular, la perforación de la membrana) para perfusión inicial debe reducirse al mínimo para reducir la exposición hipóxica y maximizar la supervivencia y la salud de los cardiomiocitos aislados. Idealmente, esta vez debe ser inferior a 5 min.
- Perfusión
NOTA: La perfusión retrógradaaparato puede hacerse funcionar con comodidad en un ambiente limpio en un banco de laboratorio estándar o colocado en una campana de flujo laminar para maximizar la esterilidad. Sin embargo, después de la perfusión se ha completado, el trabajo debe ser realizado bajo flujo laminar para minimizar la contaminación.- Suavemente pero con firmeza quitar el cubo de la cánula de la jeringa (usando guantes estériles) por lentamente torcer hacia atrás y adelante. Mientras tira de la aguja de la canulación fuera de la jeringa, lentamente expulsar tampón de perfusión en el cubo de la aguja con el fin de evitar burbujas de aire durante la perfusión.
- Retire el tubo de recirculación de captura por debajo del orificio de salida de la perfusión y reemplazar con un vaso de precipitados de captura de residuos. Una el cubo de la aguja al adaptador luer que se fija a la puerta de salida de perfusión (Figuras 1, 2) en la camisa de agua, mientras que la bomba está en marcha en la posición más baja (15 rpm, ~ 6 ml / min).
CONSEJO: Al conectar el cubo de la aguja al adaptador luer, permita que el tampón de perfusión para con goteochufe para el líquido en el cubo de la aguja con el fin de evitar la introducción de burbujas. - Perfundir el corazón sin recirculación hasta 8 ml de tampón de perfusión han sido aspirado por el tubo de alimentación.
NOTA: El volumen de tampón de perfusión aspirado por el tubo de entrada en este paso asume un volumen muerto de 7 ml para el sistema de perfusión, dando un total de 15 ml de tampón de perfusión se bombea a través del corazón. - Retire el tubo de entrada del tampón de perfusión. permitir que el aire sea aspirado por la entrada a menos que el volumen muerto del sistema.
Nota: El volumen de aire aspirado en esta etapa debe ser ajustada para evitar que el aire entre en la vasculatura coronaria (véase la etapa 1.3.7). - Colocar el tubo de entrada en el tampón de digestión (Tabla 1), justo por encima de la parte inferior del tubo. Alimentan lentamente y permita que el tubo de entrada para aspirar un volumen suficiente para evitar el llenado excesivo del tubo.
- Visualizar y seguir la burbuja de aire entreel tampón de perfusión y el tampón de digestión a medida que viaja a través de la chaqueta de calor. Observe el nivel de tampón de perfusión en el centro de la chaqueta de calor comienzan a caer una vez que la burbuja de aire llega a la cámara-de burbujeo. Una vez que el tampón de digestión llega a la cámara-de burbujeo, el nivel de líquido en la camisa de calor permanecerá constante.
IMPORTANTE: Si el nivel de tampón de perfusión baja demasiado, cerrar la llave de paso de salida y abra la llave de paso de ventilación. Permita que el nivel se eleve a un nivel cómodo (3 - 5 pulgadas por encima de la puerta de salida). A continuación, detenga la bomba de perfusión y cerrar la llave de paso de ventilación. Abra la llave de paso de puerto de salida y reiniciar la bomba de perfusión. - Ver la solución que emerge del corazón. Cuando el último de la memoria intermedia de perfusión sale del corazón y el tampón de digestión comienza circula a través del corazón, se observó cambio de color de claro a marrón claro debido a la presencia de la colagenasa.
- Perfundir el corazón con tampón de digestiónaproximadamente el 10 - 15 min. El corazón comenzará a encorvarse como el colágeno se degrada y pierde soporte mecánico.
- La disociación mecánica y Purificación
- Retire el corazón de la cánula con unas pinzas y colocar en una placa de Petri seco. recortar rápidamente el tejido extra-ventricular utilizando tijeras iris finas. La transferencia de los ventrículos a un plato que contiene tampón de perfusión de Petri fresca para lavar. Mover la placa de Petri a una campana estéril y transferir los ventrículos a una placa petri fresco y seco.
- Recoger 7,5 ml de tampón de digestión de la chaqueta de fuego y añadir 2,8 l de 1 M de CaCl2, se mezcla por inversión. Añadir 2 - 3 ml de tampón de digestión con CaCl 2 a los ventrículos en la placa de Petri.
NOTA: La concentración de Ca2 + se eleva de 300 a 700 mu M - Triturar rápidamente el tejido ventricular con unas pinzas finas, por lo que la mayoría de las piezas son más pequeños que 1 mm 3. Añadir la siguening tampón de digestión de Ca 2+ complementado desde el paso 1.3.2 a los ventrículos disociadas en la placa de Petri y mezclar agitando suavemente.
- Coloque la placa de Petri en un incubador a 37 ° con 5% de CO 2. Agitar la placa de Petri cada 2 minutos hasta que los cardiomiocitos suficientes (ver nota más abajo) han sido liberados de los tejidos.
NOTA: Es posible que la duración de la incubación se ajuste para ajustar con precisión el grado de digestión de acuerdo a las necesidades del experimento. En general, los tiempos de incubación más largos aumentan el rendimiento y la pureza, pero pueden reducir la tasa de fijación de las células y la supervivencia. 5 - 10 min es generalmente suficiente para lograr un alto rendimiento (~ 5 - 10 x 10 5 células por corazón). - La transferencia de la placa de Petri de nuevo a una campana de flujo laminar. Usando una pipeta de transferencia cortar en un ángulo de 45 °, suavemente pipetear el tejido para disociar más.
- Utilizar guantes estériles para doblar la malla de 215 micras en un cono y mantenga durante un cónico de 50 ml. Pipetala suspensión de tejido disociado sobre la malla y permitir el filtrado se drene en la cónico de 50 ml. Use 7,5 ml de pre-calentado tampón de parada (Tabla 1) para lavar los cardiomiocitos de la placa de Petri a través de la malla, que combina con el primer filtrado.
NOTA: Ca 2+ se eleva a final de 1,1 mM y la final de FBS 2,5% en el tampón de detención neutraliza la actividad de proteasa. - Transferir la suspensión celular a un cónico de 15 ml y se deja reposar por gravedad durante 15 minutos.
- Retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia tal que sólo el 50 - 100 l de solución se mantiene por encima de las células. Añadir 10 ml de pre-calentado, medios de cultivo equilibrado (Tabla 1) y mezclar por inversión suave. Permitir que los cardiomiocitos se asienten por gravedad durante 15 minutos.
TIP: Para aumentar la pureza, repita el paso 1.4.8 como se desee. - Retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de tal manera que sólo 50 - 100 l Osolución f permanece por encima de las células.
2. La cultura de los cardiomiocitos
- Pre-capa de tejido tratadas con cultivo placas de Petri con laminina (10 mg / ml) y se almacena a 37 ° C durante 2 h antes de placas células. Justo antes de chapado, aspirar la solución de laminina de la placa de cultivo de tejidos. Lavar una vez con MEM o PBS, a continuación, aspirar líquido residual para eliminar la laminina no adsorbida.
- Agregar suficiente, medios de cultivo pre-calentado equilibrada para alcanzar la densidad celular deseada, mezclar suavemente por inversión. Plate deseada concentración de células en el recipiente de cultivo (típicamente 5 - 20 x 10 4 células / cm 2). Para evaluar el rendimiento de aislamiento de cardiomiocitos, contar las células a través de hemocitómetro o ensayo de la placa mediante la comprobación de la densidad con un microscopio. Un corazón de ratón adulto normalmente proporciona 0,5 - 1,0 x 10 6 células en esta etapa del protocolo.
TIP: Si está usando placas de 96 pocillos, use un micropip 1.000 lette con una punta de corte en un ángulo de 45 ° para minimizar el daño celular debido a la fuerza de cizallamiento. Coloque la punta de la pipeta de tal manera que está en contacto con la parte inferior del pozo durante la expulsión de la suspensión celular con el fin de minimizar la introducción de burbujas. - Mover la placa de cultivo celular con prontitud a una incubadora a 37 ° con 5% de CO2 y 95% de humedad. Cambiar los medios de comunicación, según sea necesario para evitar la acidificación: cada 1 - 5 días, dependiendo de la densidad celular. Minimizar la manipulación de la placa de cultivo durante los primeros 3 - 6 días para facilitar la fijación a la superficie de cultivo de células.
NOTA: Para minimizar la perturbación celular durante los cambios de los medios de comunicación cuando las células no se han unido totalmente, realice un cambio de medio de comunicación. aspirar lentamente los medios de comunicación mientras se mantiene la punta de la pipeta justo debajo de la superficie de los medios de comunicación. A continuación, añadir lentamente medios adicionales manteniendo la punta de la pipeta justo por encima de la superficie de los medios de comunicación contra la pared de la placa de cultivo. - Para evaluar la viabilidad de los cardiomiocitos, comprobarla morfología bajo microscopio de campo claro. Recién cardiomiocitos aislados mantienen una morfología más o menos en forma de barra con bordes claramente definidos bajo iluminación de campo claro (Figura 2).
NOTA: Confirmar la viabilidad mediante la tinción de las células con azul de tripano. - Para evaluar la pureza del aislamiento de los cardiomiocitos, comprobar la morfología de las células para identificar los cardiomiocitos. Tinción de los núcleos con Hoescht 33342 para identificar las células totales.
NOTA: Los cardiomiocitos se pueden identificar a partir de los no cardiomiocitos por su morfología característica (con forma de varilla) y el tamaño (aproximadamente 100 a 200 micras de longitud). Como alternativa, los cardiomiocitos aislados recientemente se mancha positiva para los marcadores-cardiomiocitos específicos, tales como alfa-actinina 26 (Figura 3 C, D) o troponina cardíaca T. 27
3. transducción génica con adenovirus
- Preparar lisado celular usando adenovirus m establecidoétodos. 21 transducir los cardiomiocitos utilizando lisado celular de células productoras de adenovirus 10. En el día 0 o el día 1 después del aislamiento, añadir con cuidado el lisado celular a los medios de comunicación que contiene los cardiomiocitos.
NOTA: Una preparación de adenovirus de alta titulación logrará una fuerte expresión en aproximadamente un 48 - 72 h. Ajuste la multiplicidad de infección para adaptarse al diseño experimental.
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Representative Results
Un adulto tipo salvaje ICR (CD1) corazón de ratón produce típicamente entre 500.000 y 1 millón de cardiomiocitos un éxito en el aislamiento. Inmediatamente después del aislamiento, las células mantienen una apariencia en su mayoría en forma de barra (Figura 3A) con sarcómeros intactos y se pueden utilizar para los estudios funcionales que implican la contractilidad de los cardiomiocitos. Un alto porcentaje de los cardiomiocitos en forma de barra (por encima del 90%) es una indicación de la perfusión y la digestión eficaz. Cardiomiocitos viables serán grandes (~ 100-200 micras de longitud) y parece que tienen una membrana externa aguda bajo campo claro de iluminación (Figura 3A). La inmunotinción para marcadores sarcoméricas-cardiomiocitos específico, tales como alfa-actinina, dará lugar a un patrón de bandas distinto sarcoméricas (Figura 3C). En conjunción con el análisis morfológico y la tinción nuclear con DAPI, la inmunotinción se puede utilizar para evaluar la pureza de los cardiomiocitos aislados. Fibrprovincias habrá pequeños y redondos justo después del aislamiento, pero se conecte de forma rápida y difundir fina en plástico de cultivo de células, lo que permite una fácil distinción de los cardiomiocitos.
Un bajo porcentaje de los cardiomiocitos en forma de barra es una indicación de un aislamiento sin éxito. Esto puede ser el resultado de un fallo para canular rápidamente la aorta después el corazón se extrae del animal. perfusión ineficaz, debido a una embolia gaseosa o canulación incorrectos por ejemplo, también puede afectar a la morfología y viabilidad de los cardiomiocitos.
Después de varios días en cultivo, los cardiomiocitos asumen una morfología redondeada (Figura 3B). Dentro de 1 - 2 semanas, los cardiomiocitos en vivo se adhieren al sustrato y comienzan difusión (Figura 3D, E). Las células muertas se pueden identificar por la inclusión de azul de tripano. Un aislamiento y cultivo exitoso producirán aproximadamente el 50% de cardio en directomiocitos después de 1 semana. La contaminación por los no cardiomiocitos, tales como los fibroblastos se traducirá en un alto porcentaje de estas células en cultivo posteriores debido a su potencial proliferativo. Esto se puede evitar mediante el aumento del número de sedimentaciones de gravedad y / o a través de pre-recubrimiento para aumentar la pureza. 28
La transducción con adenovirus se puede usar para lograr una fuerte expresión de genes dentro de 48 a 72 hr (Figura 3E). Adenovirus de serotipo 5 es eficiente en la transducción de cardiomiocitos de ratón adulto in vitro debido a la alta expresión del receptor de Coxackie-adenovirus, pero puede depender del tipo de material utilizado. 20
Figura 1. Aislamiento de cardiomiocitos Equipos e Instrumentación. (A) Los instrumentos quirúrgicos que se utilizan para extraer el ratóncorazón y canular la aorta, de arriba a abajo: pinzas hemostáticas, pinzas de tejido, pinzas curvas, Dumont # 5 pinzas finas, pequeñas tijeras de disección, iris finas tijeras, tijeras de compresión finas (b) El sistema de perfusión Langendorff utilizado para digerir el corazón de ratón. . tampones de perfusión se aspiran a través del tubo de entrada (1) por la bomba de perfusión (2) y a través del tubo de salida de la bomba (3) en el puerto de entrada de la camisa de agua caliente (4). Los tampones de perfusión son calentadas por la camisa de agua se calienta a medida que viajan a través del tubo de vidrio de espiral, la cámara de eliminación de burbujas, y luego fuera de la aguja de la canulación conectado al puerto de salida de perfusión (5), que está conectado por una llave de paso. El tubo cónico inferior retiene los tampones de perfusión, que se hace recircular a través del tubo de entrada. El puerto de presión (6), el puerto de cumplimiento (7) y de ventilación (8) permanecen cerradas durante la perfusión con el fin de mantener un caudal constante. La camisa de agua se calienta mediante un baño de agua circulante que entra a través THde entrada e camisa (9) y (10) orificios de salida. Un soporte de anillo se utiliza para mantener la camisa calentada el agua en posición vertical (pinzas de color rojo, negro de base por debajo de la rejilla tubo cónico de color púrpura). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Esquema general del sistema de perfusión. Partes importantes del aparato de perfusión se etiquetan como se indica en el manuscrito. La dirección del flujo de tampón de perfusión está indicado por las flechas. Tenga en cuenta la colocación de la cánula aórtica, la punta de la que debería ser visible a través de la aorta translúcida, lo que garantiza que se coloca encima de la válvula aórtica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. aislado Adultos ratón cardiomiocitos. Los cardiomiocitos se aislaron y se sembraron en laminina-Coated placas de 96 pocillos como se describe en el Protocolo en este documento. Cardiomiocitos recién aislados (A), se sembraron a aproximadamente 8.000 células / cm2. Tenga en cuenta que recién aisladas, cardiomiocitos viables aparecen aproximadamente en forma de barra con bordes afilados (punta de flecha blanca). Sin embargo, los cardiomiocitos que parecen tener una membrana externa difusa bajo campo claro están muertos. Durante los primeros días de cultivo, los cardiomiocitos asumen una forma redondeada (B). (C) La inmunotinción para alfa-actinina (verde) revela característico de bandas sarcoméricas en un cardiomiocitos en el post-d1 aislamiento. tinción nuclear (DAPI) se muestra en azul. Los mejores espectáculos de la región de zoom de imagen se indica en la imagen inferior. (D) (E) Campo claro y las imágenes epifluorescentes muestran los cardiomiocitos en el día 11 post-aislamiento transducidas con adenovirus con un reportero GFP bajo el control de un promotor de CMV ( un regalo de Robert Gerard en UT Southwestern). Las células se sembraron a aproximadamente 18.000 células / cm 2 y se transdujeron en día 0 usando una multiplicidad de infección de aproximadamente 800 unidades formadoras de placas (UFP) por célula. Las barras de escala:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón de aislamiento de los cardiomiocitos (CIB) | |||
| Añadir 900 ml de agua ultrapura a un vaso de precipitados limpio bajo magagitación nético. | |||
| Añadir los componentes del tampón en la tabla como se indica. | |||
| Componente | MW | Conc final (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58,44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74.55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268,07 | 0.33 | 0,088 |
| MgSO4 .7H 2 O | 246.48 | 0,5 | 0,123 |
| La taurina | 125.1 | 30 | 3.753 |
| BDM | 101.1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| Glucosa | 180.16 | 22 | 3.964 |
| Ajustar el pH del ingenioh 5 M de NaOH. | |||
| Ajuste el volumen a 1 l con agua ultrapura. | |||
| Filtro estéril w / 0,22 M filtro de vacío. | |||
| Añadir 0,5 l de 0,1 U / ml de insulina por litro de tampón de aislamiento de cardiomiocitos. | |||
| El tampón de perfusión | |||
| Componente | Final | Volumen (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mM | 0,2 | |
| Total | - | 200 | |
| tampón de digestión | |||
| Componente | Final | Cantidad | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1M) | 300M | 4.5 l | |
| proteasa XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| colagenasa II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Total | - | 15 ml | |
| tampón de parada | |||
| Componente | Final | Volumen (ml) | |
| El tampón de perfusión | 95% | 14.25 | |
| CaCl2 (1M) | 1,5 mM | 22.5 | |
| FBS | 5% | 0.75 | |
| Total | - | 15 ml | |
| Medios culturales | |||
| Componente | % final | Volumen (ml) | |
| medios MEM | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0,2 | |
| Total | 100% | 100 ml | |
| Permitir a los medios de cultivo se equilibre a 37 ° C, 5% de dióxido de carbono. | |||
Tabla 1: Soluciones y tampones.
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Discussion
El estado general de salud de los cardiomiocitos aislados depende de varios aspectos importantes de este protocolo. En primer lugar, el tiempo de la extracción del corazón a la perfusión es crítica y debe realizarse en 5 min o menos. La eliminación de calcio ayuda a disociar las interacciones célula-célula, pero puede tener un impacto negativo en la salud celular a largo plazo. 29-32 Por lo tanto, les resulta suficiente para eliminar el calcio durante los primeros pocos minutos de perfusión de EGTA (ácido etilen glicol) quelación, 22 pero rápidamente restauración de calcio durante la digestión y las etapas subsiguientes.
El uso de la proteasa XIV mejora en gran medida la eficiencia de la digestión en comparación con la colagenasa sola. Esto reduce inconsistencia debido a la variabilidad lote de colagenasa, 18,24 y aumenta la pureza de los cardiomiocitos, facilitando la separación durante la sedimentación por gravedad. Sin embargo, el exceso de la digestión será impedir la adhesión eficiente para el sustrato de cultivo, por lo que el equilibrio i finas requerido para optimizar el rendimiento de células y la pureza, mientras que el mantenimiento de la unión de células y la viabilidad. Por lo tanto, la concentración de proteasas y la duración de la digestión puede ser modificado para adaptarse a los objetivos experimentales. En general, un menor grado de digestión mejorará la unión y la supervivencia de los cardiomiocitos. El uso de la tripsina se ha informado en algunos protocolos de aislamiento de los cardiomiocitos. 18 Sin embargo, la adición de tripsina al cóctel proteasa usada aquí (colagenasa y XIV de la proteasa) reduce la viabilidad a largo plazo de los cardiomiocitos en cultivo, tal vez debido a un exceso de digestión o escisión de superficie esenciales y / o proteínas de la matriz extracelular.
La inclusión de monoxima butanedione (BDM) durante el aislamiento inhibe la contracción del músculo cardiaco, y por lo tanto reduce las consecuencias negativas debido a la contractura terminal, el gasto de energía, y la paradoja del calcio. 29,33 Sin embargo, en nuestra experiencia, la eliminación de BDM antes del cultivo acelera dedifferentiation y permite que las células se adaptan a la cultura en dos dimensiones.
Es importante señalar que las adaptaciones a largo plazo a la cultura 2-D puede afectar a los aspectos funcionales de los cardiomiocitos, tales como la contractilidad. Por lo tanto, la contractilidad y la electrofisiología experimentos deben llevarse a cabo poco después de aislamiento, cuando la organización del sarcómero nativa sigue intacta. Además, como con cualquier experimento in vitro, las células en cultivo están desprovistos de ciertas influencias extrínsecas presentes in vivo, tales como la señalización o humoral inmune. Por otro lado, co-cultivos definidos se pueden implementar para estudiar las interacciones entre los cardiomiocitos y otros tipos de células. 5,34 Además, el cultivo in vitro se pueden utilizar para estudiar el comportamiento de los cardiomiocitos con señales moleculares definidos en los medios de cultivo. Por lo tanto, los objetivos generales del experimento deben considerarse cuidadosamente y se pesaron en contra de las limitaciones y ventajas de este sistema de cultivo.
35 Cabe señalar que FBS y otros sueros de origen animal contienen componentes desconocidos que pueden afectar a la fisiología celular 36,37. a pesar de la presencia muy apreciada de los factores de crecimiento en FBS, 38 los cultivos de cardiomiocitos que aquí se presentan no proliferan. Más bien, el bloqueo del ciclo celular parece ser una característica persistente de los cardiomiocitos de ratón adulto ex vivo, mantenido desde su salida del ciclo celular durante el período perinatal del desarrollo. 12,39 Esta propiedad es de gran interés para el campo de la medicina regenerativa cardiaca, donde reversión de los cardiomiocitos de mamíferos adultos a un fenotipo proliferativo ha sido un objetivo muy perseguido. 3,26,40-42 en particular, todavía no está claro qué grado de desdiferenciación se requiere para cardiomiocitos para volver a entrar en el ciclo celular, pero el contribution de desdiferenciación a la regeneración en vertebrados inferiores está bien apoyado 43,44,10,11 Por otra parte, se observa cada vez más desdiferenciación en la proliferación de los cardiomiocitos y la regeneración del corazón en los sistemas de mamíferos, al menos en el plano funcional, incluyendo el desmontaje miofibrilar 6,12,9 Por lo tanto, el estado de diferenciación de los cardiomiocitos en cultivo se debe considerar cuidadosamente y se modula de acuerdo con las necesidades de los objetivos de la investigación. Como tal, las condiciones de cultivo potencialmente pueden modificarse adicionalmente para reducir la concentración de suero, uso de sustitutos de suero definidos o medio libre de suero. Por ejemplo, los cardiomiocitos de ratas adultas que exhiben sarcómeros organizados fueron cultivadas a largo plazo sin suero, pero los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, y triyodotironina se utilizaron en medios definidos. 45 Es concebible que las formulaciones de medios de comunicación similares, o potencialmente otro formulaciones tales como las adaptadas de Differentiprotocolos ación, 46 se pueden utilizar para mantener bien diferenciadas cardiomiocitos de ratón adulto en la cultura que muestran las estructuras sarcoméricas altamente organizadas. Las formulaciones alternativas también pueden ser desarrolladas para lograr otros fenotipos (tales como cardiomiocitos altamente diferenciados de-6) en función de las necesidades del experimento, pero serán necesarios nuevos trabajos.
El papel de los fibroblastos se ha implicado en el control del ciclo neonatal cardiomiocitos de ratón celular 5 y la diferenciación de los cardiomiocitos de ratones adultos (a través de la señalización de IL-6 hipertrófica) en cultivo a largo plazo. 19 Por lo tanto, el crecimiento de los fibroblastos en cultivo debe ser contabilizada en interpretaciones experimentales . El crecimiento de los fibroblastos en cultivo se puede controlar mediante la adición de crecimiento restricción de compuestos como el arabinósido de citosina 19 (AraC) o a través de pasos pre-chapado. 28 Sin embargo, también habrá AraC inhibir el crecimiento de los cardiomiocitos, de modo alternativométodos deben ser utilizados para controlar el crecimiento de los fibroblastos en estudios sobre el ciclo celular de cardiomiocitos. En el protocolo descrito aquí, la pureza inicial de cardiomiocitos se puede mejorar mediante la repetición de la etapa de sedimentación por gravedad (ver 1.4.8).
Los métodos de la presente memoria proporcionan un sistema in vitro que puede ser usado para estudiar la naturaleza de adulto bloqueo del ciclo celular de cardiomiocitos de mamífero. En contraste con las células primarias de otros organismos, como de rata o conejillo de indias, cardiomiocitos primarios de ratón ofrecen una gran cantidad de herramientas genéticas potentes y bien caracterizados, tales como el linaje basado-Cre rastreo modelos knock-in, 47 que pueden ser usados para facilidad identificar las células derivadas de los cardiomiocitos preexistentes. 12,48 Además, adultos primaria cardiomiocitos murinos han sido sometidos a las condiciones de desarrollo nativas que resultan en el bloqueo del ciclo celular, a diferencia de las líneas celulares y ES diferenciadas o células IPSC 46 que, a pesar de su convenience y adaptabilidad a las grandes pantallas de drogas, 2 pueden tener una utilidad limitada en los experimentos de sondeo de la naturaleza de la salida del ciclo celular de cardiomiocitos adultos.
Este protocolo describe un método fiable para aislar y cultivar los cardiomiocitos de ratón adulto. Varios métodos han demostrado previamente el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón para el estudio a corto plazo, pero hasta la fecha, existen pocos informes del cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos-ratón. 18,19 La capacidad de mantener los cardiomiocitos de ratón adulto en la cultura debería permitir el estudio in vitro de la biología de los cardiomiocitos en condiciones experimentales que requieren un examen a largo plazo. Por ejemplo, la expresión génica se puede manipular con vectores de adenovirus, que normalmente requieren unos pocos días para conseguir la expresión completa. cambios fenotípicos y análisis posteriores pueden requerir períodos de tiempo más largos, incluso en función de los objetivos experimentales. Los métodos presentados aquí permiten la cultura de cardiom ratón adultoyocytes durante varias semanas. Esto debería proporcionar un sistema de gran alcance para la investigación de las preguntas prudentes en la biología de los cardiomiocitos, tales como las relativas a la regulación del ciclo celular.
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Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por el Programa de Investigación Biomédica UCSF Avance (financiado en parte por la Fundación Sandler), el NIH Camino al Premio de la Independencia (R00HL114738), y la Fundación Edward Mallinckrodt Jr. JJ fue apoyado por una beca postdoctoral de los NIH (T32HL007731). Los autores son los únicos responsables de los contenidos de este trabajo, que no necesariamente representan la opinión oficial de los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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