Abstract
Odlade kardiomyocyter kan användas för att studera cardiomyocyte biologi med användning av tekniker som är komplementära till in vivo-system. Till exempel möjliggör renhet och tillgänglighet av in vitro-kultur fin kontroll över biokemiska analyser, levande avbildning och elektrofysiologi. Långvarig odling av kardiomyocyter ger tillgång till ytterligare experimentella metoder som inte kan slutföras i kortsiktiga kulturer. Till exempel, utredningen av dedifferentiering, cellcykel återinträde, och celldelning in vitro hittills i stort sett begränsade till råttkardiomyocyter, som verkar vara mer robust i långtidsodling. Men det finns en rik verktygslåda av transgen mus linjer och välutvecklade sjukdomsmodeller gör mus system attraktivt för hjärtforskning. Trots att flera rapporter finns om vuxna möss cardiomyocyte isolering, några studier visar deras långsiktiga kultur. Presenteras här, är en steg-för-steg-metod förisolering och långsiktig odling av vuxen mus cardiomyocytes. Först retrograd Langendorff perfusion användas för att effektivt smälta hjärtat med proteaser, följt av gravitationssedimente rening. Efter en period av dedifferentiering efter isolering, cellerna successivt fästa till odlingen och kan odlas i flera veckor. Adenovirus cellysat används för att på ett effektivt sätt omvandla de isolerade cardiomyocytes. Dessa metoder ger en enkel, men ändå kraftfullt modellsystem för att studera hjärt biologi.
Introduction
Odlade kardiomyocyter används ofta för att övervaka cellens beteende i en väl kontrollerad miljö in vitro. Till exempel, kan morfologiska, elektriska, biokemiska eller mekaniska cellegenskaper studeras på manipulerade substrat, 1,2 i definierade medier, och som svar på småmolekylära läkemedel, peptider, genreglering, 3 eller elektrisk stimulering. 4 Det cellulära innehållet kan även styras med definierade co-kulturer. 5 Dessa in vitro-försök är användbara i stora läkemedel eller genetiska skärmar och kompletterar in vivo-metoder för olika typer av undersökningar med cardiomyocyte biologi.
Långvarig odling möjliggör experimentella vägar som kräver längre tid för att uppnå fenotypisk förändring. Ett aktuellt exempel är att vuxna däggdjur cardiomyocyte spridning, där dedifferentiering, cellcykel återinträde, och celldelning normalt studeras över sigVeral dagar till veckor. 6,7 Här underlättar den förlängda odlingstiden genetisk manipulation, 7,8 funktionell dedifferentiering (t.ex. sarcomeric demontering) 9 och eventuellt transkriptions dedifferentiering. 6 Efterföljande cellcykel återinträde och celldelning kräver ännu längre odlingsperioder att observera, särskilt om flera omgångar av division är den experimentella målet. Vikten av cardiomyocyte cellcykeln är central för flera nya viktiga vetenskapliga arbeten i hjärtat förnyelse, där dedifferentiering och spridning av befintliga kardiomyocyter har visat ansvarig för hjärt förnyelse i zebrafisk och neonatala möss. 10-12 således möjligheten att stimulera dedifferentiering och cellcykel återinträde i däggdjurs vuxna cardiomyocytes fortfarande en viktig fråga i människohjärtat regenere 13-15
I n vitro-experiment som studerar cellcykeln av däggdjurs hjärtmyocyter har främst används råttkällor på grund av sin relativa enkelhet av långtidsodling jämfört med musmodeller. 16 emellertid murina system erbjuder en rik resurs välkarakteriserade transgena verktyg och sjukdomsmodeller som är användbara i både in vitro och in vivo protokoll. Till exempel har Cre-baserade härstamning spårning möjliggjorde identifiering av befintliga kardiomyocyter som en källa att regenerera hjärtmuskeln i neonatal mus hjärtat in vivo. 12 In vitro-studier av Lineage-spårade neonatal mus cardiomyocytes har gjort det möjligt att undersöka interaktioner med stromal celler genom samodling med fibroblaster. 5 på grund av dess utmaningar existerar för isolering och långsiktig odling av vuxen mus cardiomyocytes 17 fåtal rapporter. 18,19
Isolering av livskraftiga vuxen mus kardiomyocyter för enbart kortsiktiga kultur är känd för att vara en utmanande uppgift. denna protocol ger steg-för-steg-instruktioner om hur man kan uppnå livskraftiga hjärtmuskelceller från vuxna möss som kan användas för både kortsiktiga och långsiktiga undersökningar. Kardiomyocyter isolerade med hjälp av detta protokoll kan effektivt omvandlas med adenovirusvektorer 20,21 och odlade i flera veckor. Dessa metoder ger ett kraftfullt system för att studera cardiomyocyte biologi in vitro.
De metoder som beskrivs här baseras på flera element från tidigare arbeten med hjälp av varianter av Langendorff retrograd perfusion. 18,22 Även om flera protokoll har publicerats på isolering av vuxna mus cardiomyocytes för kortsiktiga kultur och studera, 23-25 fördelen med detta protokoll är förmågan att odla isolerade kardiomyocyter långsiktigt. Detta kommer att vara användbara vid studium av cellulära processer som involverar ektopisk genuttryck och kräver långa tidsperioder, såsom i cellulära omprogrammering strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Användning och skötsel kommittén vid University of California, San Francisco.
OBSERVERA: I korthet efter extraktion av hjärtat från musen thorax, är koronar retrograd perfusion användas för att effektivt smälta den extracellulära matrisen med kollagenas och proteas XIV. Ventriklarna isoleras sedan, dissocierades mekaniskt och filtrerades in i en enkelcellsuspension. Gravitationssedimentering utförs för att isolera kardiomyocyter, som är separerade från stromaceller såsom fibroblaster och endotelceller genom sin höga densitet. De renade cardiomyocytes kan odlas i veckor på laminin-belagda polystyren och transducerades med adenovirus genvektorer.
1. cardiomyocyte Isolering
- Förbered buffertar, Surgical Station och perfusionsapparat
- Förbered buffertar och medier enligt Table 1.
- Slå på cirkulerande vattenbad, inställt temperaturingång, så att produktionen av uppvärmd vattenmanteln når en temperatur av 37 C.
- Ren perfusionssystemet genom spolning med 70% etanol. Ta sedan bort alla spår av etanol från systemet genom spolning med flera volymer sterilt vatten.
- Ladda perfusionssystemet med perfusionsbuffert (tabell 1). Första avloppsvattnet från systemet, spola sedan med 2 volymer perfusion buffert. Fyll sedan dödutrymmet med perfusionsbuffert så att den inre kolumnen i värmemantel fylles med perfusionsbuffert, men avbubbling kammaren är tom.
TIPS: Se till att inga luftbubblor finns i raden under avbubbling kammaren. För att ta bort motsträviga bubblor, engagera alla kranar och låt trycket att bygga upp innanför linjen för några sekunder. Släpp sedan den nedre kranen, så att högtrycks perfusion buffert till jet från utloppet; den snabba flödet och turbulence hjälper rubba bubblor som fångas nära perfusion utlopp. - Förbered en spruta med nål som ska användas för aortakanyle. Bifoga en 18 G trubbig nål till en 1 ml spruta fylld med perfusions-buffert. Ta bort luftbubblor och fixera sprutenheten till en arm av dissekera mikroskop belysningen med lab tejp.
TIPS: Om du vill skapa en trubbig nål från en avfasad nål, transekt nålaxeln med avbitare. Sedan vässa spetsen med en slip sten tills spetsen är platt.
OBS: För att minska glidning av aorta från nålen under kanyle, rugga skaftet på kanyl nål med ett rakblad. Säkra nålen genom navet och övre axeln, såg sedan rakhyveln fram och tillbaka vinkelrätt mot den långa axeln av nålaxeln medan den roterar förrän flera spår har skapats inom 1 cm från spetsen på nålaxeln. Byta till en ny rakhyvel när bladet blir slö. - Placera en renpetriskål under dissekera mikroskop för att innehålla hjärtat under kanyle. Positionera belysningsarmen så att spetsen av kanylen är nära kanten av synfältet, men inte hindrar dissekering. Säkerställa kanylens spets ligger under kanten på petriskål.
OBS: För att immobilisera hjärtat under dissektion, placera en liten (~ 5-7 cm 2) kvadraten på 215 mikron mesh i petriskålen. När hjärtat är placerad på denna mesh, kommer det att skapa friktion för att reducera glidning och rotation av hjärtat under mekanisk manipulation. - Tie 2 suturer med lösa dubbla överhandsknop runt navet av kanylen nålen som skall användas för fastsättning av aorta.
- Hjärta Extraction och Kanyle
- Administrera heparin (5 lE / g kroppsvikt) via intraperitoneal injektion. Vänta 20 min för att medge att heparin att cirkulera till hjärtat.
- Söva musen genom intraperitoneal injicerajon av 20% etyl-karbamat (2 mg etylkarbamat / g kroppsvikt). Observera noga tills musen är under djup anestesi (ca 3-5 min).
OBS: Deep anestesi bekräftas av en brist på både tå nypa och hornhinnan reflexer. Om musen inte har nått djupa anestesi med 8 - 10 min, sedan administrera en ytterligare dos av etylkarbamat. Även enskilda svar på anestesi varierar mellan möss, underlåtenhet att ange djup anestesi vid första doserings kan tyda på försämrad etylkarbamat, som kan hindra djupa anestesi även efter upprepad dosering. För att förhindra nedbrytning, förbereda en färsk lösning av etylkarbamat före varje användning. - Immobilisera musen till operation plattform genom att säkra varje lem med kirurgtejp. Desinficera snittet området med en liberal mängd 70% etanol. Klappa torrt med en labb torka.
- Lyft huden med vävnads pincett strax under bröstbenet. Göra ett lateralt snitt med en liten sax, skära through huden och buken.
- Använd peanger att försiktigt lyfta bröstkorgen via bröstbenet. Med små dissektion sax förlänga snitt i en V-form mot armhålan. Skär igenom det första revbenet och punktera membranet på varje sida.
- Fortsätt att lyfta bröstkorgen med peanger och använda små iris sax för att helt transekt membranet. Se till att inte punktera hjärtat.
- Dra in bröstkorgen rostrally med hjälp av bifogade peanger och snabbt men försiktigt förlänga V-form snitt genom att skära genom bröstkorgen mot armhålorna på båda sidor. Dra in den mellersta delen av bröstkorgen helt och fastställa de bifogade peanger att hålla på plats.
- Ta hjärtsäcken med fin pincett.
- Medan försiktigt lyfta hjärtat med hjälp av böjda pincett, transekt vener och artärer kopplade till hjärtat. Placera omedelbart hjärtat i iskall perfusion buffert för att bromsa muskelsammandragning.
- Placera hjärtat i en petriskål enligten dissektion mikroskop (plats på en liten bit av 215 um mesh för att immobilisera under dissektion). Trimma eventuellt överskott icke-hjärtvävnad med fina iris sax. Var försiktig när du klipper nära aorta.
- Transekt aorta nära brachioencephalic artär, och se till att inte låta bubblor eller vävnadsrester in i öppningen.
- Fylla petriskål innehållande hjärtat med iskall perfusionsbuffert sådant att vätskenivån stiger över öppningen av kanylen. Skidan aortan på kanylen så att spetsen är precis distalt till aortaklaffen.
TIPS: För att minska risken för luftemboli, något tryck sprutan på kanylen före kanyle för att avlägsna eventuella luftbubblor som kan ha utvecklats i slutet av kanylen. Dessutom hålla spetsen på kanylen och aorta under ytan av lösningen för att undvika att införa bubblor medan inkapsling av den aorta. - Skjut en pre-bundna 7-0 siden sutur nerskaftet på kanyle nål och position precis ovanför spetsen av nålen. Dra åt knuten med fin pincett. Upprepa detta steg med en andra sutur placerad strax ovanför den första.
OBS: Se till att nålspetsen är fortfarande över aortaklaffen före och efter åtdragning. - Tryck långsamt sprutan för att mata ut 0,5 ml av perfusion buffert genom kranskärlen.
OBS: Om kanyle var framgångsrik, kommer blod att visualiseras lämnar kranskärlen och sammanslagning av de rygg vener och artärer.
VIKTIGT: Tiden från öppnandet av brösthålan (i synnerhet punktera membranet) initial perfusion bör minimeras för att minska hypoxisk exponering och maximera överlevnad och hälsa isolerade cardiomyocytes. Helst bör denna tid vara mindre än fem minuter.
- perfusion
OBS: Den retrograd perfusionapparaten kan manövreras bekvämt i en ren miljö på en standardlaboratoriebänk eller placeras i en huv med laminärt flöde för att maximera sterilitet. Men efter perfusion är klar arbete bör utföras under laminärt flöde för att minimera kontaminering.- Försiktigt men bestämt bort kanylen navet från sprutan (med sterila handskar) genom att långsamt vrida fram och tillbaka. Medan kanyle nål att dra bort av sprutan, sakta mata perfusionsbuffert in i nålnavet i syfte att förhindra att luftbubblor under perfusionen.
- Ta bort recirkulerande fånga röret underifrån perfusion utloppsöppningen och ersätta med en avfalls fångst bägare. Fäster nålhållaren till luer-adapter som är fäst vid perfusion utloppsport (figurerna 1, 2) på vattenmanteln, medan pumpen körs vid den lägsta inställningen (15 varv per minut, ~ 6 ml / min).
TIPS: När du ansluter nålnavet till luer-adaptern, låta droppande perfusion buffert för att luraanslut till vätskan i nålnavet i syfte att undvika att införa bubblor. - BEGJUTA hjärtat utan recirkulation till 8 ml perfusionsbuffert har aspire av tilloppsslangen.
OBS: Volymen av perfusion buffert aspire av inloppsslangen i detta steg förutsätter en död volym av 7 ml för perfusion system, vilket ger totalt 15 ml perfusion buffert pumpas genom hjärtat. - Ta bort inloppsröret från perfusionsbuffert. Tillåta luft att sugas genom inloppet för mindre än den döda volymen hos systemet.
OBS: Den volym luft sugs i detta steg måste justeras för att förhindra att luft kommer in i kranskärlen (se steg 1.3.7). - Placera inloppsröret in i digereringsbuffert (tabell 1), strax ovanför botten av röret. Mata långsamt och låta inloppsröret för att suga tillräckligt med volym för att undvika överfyllning av röret.
- Visualisera och följ luftbubbla mellanperfusionen buffert och digereringsbuffert när den färdas genom värmemanteln. Observera nivån av perfusionsbuffert i centrum av värmemantel börjar sjunka när luftbubblan når de-bubblande kammaren. När matsmältningen buffert når de-bubblande kammaren, kommer vätskenivån i värmejacka förbli stabil.
VIKTIGT: Om nivån av perfusion buffert sjunker för lågt, stänger utloppskranen och öppna ventilen kranen. Låt nivå att stiga till en bekväm nivå (3 - 5 inches ovanför utloppet). Sedan stoppa perfusion pumpen och stänga ventilen kranen. Öppna utloppsöppningen kranen och starta om perfusion pumpen. - Titta på lösningen som kommer ut från hjärtat. Som den sista av den perfusionsbuffert lämnar hjärtat och uppslutningsbufferten börjar cirkulerar genom hjärtat, kommer färgändring från klart till ljusbrun observeras på grund av närvaron av kollagenas.
- BEGJUTA hjärtat med matsmältningen buffertcirka 10 - 15 min. Hjärtat börjar slouching såsom kollagen nedbrytes och den förlorar mekaniskt stöd.
- Mekanisk Dissociation och rening
- Ta hjärtat från kanylen med pincett och lägg i en torr petriskål. Snabbt trimma extra kammar vävnad med fina iris sax. Överför kamrarna till en ny petriskål innehållande perfusion buffert för att tvätta. Flytta petriskål till en steril huva och överföra ventriklarna till en frisk, torr petriskål.
- Samla 7,5 ml matsmältningen buffert från värmen jacka och tillsätt 2,8 pl 1 M CaCl2, blanda genom inversion. Tillsätt 2 - 3 ml av digereringsbuffert med CaCl2 till kamrarna i petriskålen.
OBS: Koncentrationen av Ca 2 + höjs från 300 till 700 | iM - Snabbt mal sönder kammarvävnad med fin pincett, så att de flesta bitarna är mindre än 1 mm 3. Tillsätt kvaring Ca2 + kompletterat matsmältningen buffert från steg 1.3.2 till dissocierade kamrarna i petriskålen och blanda genom försiktig omrörning.
- Placera petriskålen i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Skaka petriskålen varje 2 min tills tillräckliga cardiomyocytes (se OBS nedan) har släppts från vävnaden.
OBS: Längden på inkuberingen kan behöva justeras för att finjustera utrötningsgraden enligt behoven av försöket. I allmänhet ökar längre inkubationstider utbyte och renhet, men kan minska graden av cellvidhäftning och överlevnad. 5 - 10 min är i allmänhet tillräcklig för att uppnå en hög avkastning (~ 5 - 10 x 10 5 celler per hjärta). - Överför petriskål tillbaka till ett dragskåp med laminärt flöde. Med hjälp av en överföringspipett skär vid en 45 ° vinkel, försiktigt pipettera vävnaden att ytterligare avstånd.
- Använd sterila handskar för att vika 215 um mesh till en kon och hålla över en 50 ml konisk. Pipettden dissocierade vävnaden suspension på mesh och tillåter filtratet att rinna in i 50 ml koniska. Använd 7,5 ml förvärmd stoppbuffert (tabell 1) för att tvätta de kardiomyocyter från petriskålen genom nätet, som kombinerar med det första filtratet.
OBS: Ca 2 + höjs till slutlig 1,1 mM och den slutliga 2,5% FBS i stoppbuffert neutraliserar proteasaktivitet. - Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt och låt klarna av tyngdkraften i 15 min.
- Försiktigt bort supernatanten med en pipett så att endast 50 - 100 pl lösning förblir ovanför cellerna. Tillsätt 10 ml förvärmda, jämviktad odlingsmedium (tabell 1) och blanda genom att vända försiktigt. Låt cardiomyocytes sedimentera genom gravitation under 15 minuter.
TIPS: För att öka renheten, upprepa steg 1.4.8 om så önskas. - Försiktigt bort supernatanten med en pipett så att endast 50 - 100 ^ of lösningen förblir ovanför cellerna.
2. cardiomyocyte Kultur
- Förbeläggning vävnadskultur-behandlade petriskålar med laminin (10 | j, g / ml) och förvaras vid 37 ° C under 2 h före utstrykning av celler. Strax före utstrykning, aspirera laminin lösning från vävnadsodlingsplattan. Tvätta en gång med MEM eller PBS, sedan aspirera restvätska för att avlägsna icke-adsorberat laminin.
- Tillsätt tillräckligt förvärmas, jämviktad odlingsmedier för att uppnå önskad celldensitet, blanda genom att vända försiktigt. Platta önskade koncentrationen av celler in i odlingskärlet (typiskt 5 - 20 x 10 4 celler / cm 2). För att bedöma utbytet av cardiomyocyte isolering, räkna cellerna via hemacytometer eller testplatta genom att kontrollera densitet under ett mikroskop. En vuxen mus hjärta ger typiskt 0,5 - 1,0 x 10 6 celler i detta skede av protokollet.
TIPS: Om du använder 96 brunnar, använder en 1000 ul micropipette med en spets skuret i en 45 ° vinkel för att minimera cellskada på grund av tvärkraft. Placera pipettspetsen så att den vidrör botten av brunnen under utstötningen av cellsuspension för att minimera införandet av bubblor. - Flytta cellkulturskål omgående till en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och 95% fuktighet. Ändra media som behövs för att förhindra försurning: varje 1 - 5 dagar beroende på celldensitet. Minimera hanteringen av odlingsskålen under de första 3 - 6 dagar för att underlätta fastsättning på cellodlingsytan.
OBS: För att minimera cell störningar under medie förändringar när cellerna inte till fullo har fäst, utföra en halv-media förändring. Långsamt suga ut mediet och samtidigt hålla pipettspetsen strax under ytan av medierna. Sedan långsamt tillsätta ytterligare medier genom att hålla pipettspetsen precis ovanför ytan av mediet mot väggen av odlingsskålen. - För att bedöma lönsamheten av kardiomyocyter, kontrolleramorfologin enligt bright mikroskopi. Färskt isolerade cardiomyocytes upprätthålla en ungefär stavformad morfologi med skarpa, tydliga kanter enligt bright belysning (Figur 2).
OBS: Kontrollera livskraft genom färgning av cellerna med trypanblått. - För att bedöma renheten av cardiomyocyte isolering, kontrollera cellmorfologi att identifiera hjärtmuskelceller. Färga kärnor med Hoescht 33342 för att identifiera totala celler.
OBS: Cardiomyocytes kan identifieras från icke-kardiomyocyter genom deras karakteristiska morfologi (stavformad) och storlek (ca 100 till 200 ^ m i längd). Alternativt kommer nyisolerade kardiomyocyter färgas positivt för cardiomyocyte specifika markörer, såsom alfa-actinin 26 (figur 3C, D) eller cardiac troponin T. 27
3. Gene Transduktion med Adenovirus
- Förbered adenovirus cellysatet med hjälp av etablerade metoder. 21 transducera de kardiomyocyter som använder cell-lysat från adenovirus framställningsceller 10. På dag 0 eller dag 1 efter isolering, tillsätt försiktigt cellysatet till media som innehåller cardiomyocytes.
OBS: En hög titer adenovirus beredning kommer att uppnå starkt uttryck i ungefär 48-72 timmar. Justera infektionsmultiplicitet för att passa den experimentella designen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vild typ vuxen ICR (CD1) mus hjärta ger typiskt 500.000 till 1 miljon cardiomyocytes från en lyckad isolering. Omedelbart efter isolering cellerna bibehålla en mestadels stavformade utseende (figur 3A) med intakta sarkomerer och kan användas för funktionella studier med cardiomyocyte kontraktilitet. En stor andel av stavformade cardiomyocytes (över 90%) är en indikation på effektiv perfusion och matsmältning. Viabla kardiomyocyter kommer att vara stor (~ 100-200 ^ m i längd) och verkar ha en skarp yttre membran under bright belysning (figur 3A). Immunfärgning för cardiomyocyte specifika sarcomeric markörer, såsom alfa-actinin, kommer att resultera i en distinkt sarcomeric bandmönster (fig 3C). I samband med morfologisk analys och nukleär färgning med DAPI, kan immunfärgning användas för att bedöma renheten av de isolerade cardiomyocytes. FIBRoblaster kommer att vara små och runda strax efter isolering, men kommer snabbt fästa och sprida tunn på cellodlings plast, vilket möjliggör enkel åtskillnad från kardiomyocyter.
En låg andel av stavformade kardiomyocyter är en indikation på en misslyckad isolering. Detta kan vara resultatet av ett misslyckande att snabbt kanylera aorta efter det att hjärtat tas ut från djuret. Ineffektiv perfusion, på grund av luftemboli eller felaktig kanyl till exempel, kan också påverka morfologi och livskraft cardiomyocytes.
Efter flera dagar i kultur, de cardiomyocytes antar en rundad morfologi (Figur 3B). Inom 1 - 2 veckor, levande cardiomyocytes fäster vid substratet och börja sprida sig (Figur 3D, E). Döda celler kan identifieras genom trypanblått integration. En framgångsrik isolering och kultur kommer att ge ungefär 50% levande cardiomyocyter efter en vecka. Kontaminering av icke-kardiomyocyter, såsom fibroblaster kommer att resultera i en hög procentandel av dessa celler senare i odling på grund av deras proliferativa potential. Detta kan undvikas genom att öka antalet av gravitations sediment och / eller genom för-plätering för att öka renheten. 28
Transduktion med adenovirus kan användas för att uppnå en stark genuttryck inom 48-72 h (figur 3E). Adenovirus serotyp 5 är effektiv vid transduktion vuxen mus kardiomyocyter in vitro på grund av den höga uttryck av coxackie-adenovirus receptor, men kan bero på vilken typ av media som används. 20
Figur 1. cardiomyocyte Isolering utrustning och instrumentering. (A) Kirurgiska instrument som används för att extrahera mushjärta och cannulate aorta, från topp till botten: peanger, vävnads pincett, böjda pincett, Dumont # 5 fin pincett, små dissekera sax, fina iris sax, fina kläm sax (B) Langendorff perfusion som används för att smälta musen hjärta. . Perfusion buffertar sugs genom inloppsröret (1) genom perfusion pumpen (2) och genom pumputloppsröret (3) in i inloppsporten på den uppvärmda vattenmanteln (4). De perfusion buffertar värmas av den uppvärmda vattenmantel som de färdas genom spiral glasrör, den avbubbling kammaren, och sedan ut ur den kanyle nål fäst vid perfusion utloppsporten (5), som är ansluten med en avstängningskran. Det koniska röret nedan fångar perfusion buffertar, som åter cirkuleras genom inloppsröret. Tryckporten (6), compliance-port (7) och lufta (8) förblir stängd under perfusion i syfte att upprätthålla en konstant flödeshastighet. Vattenmanteln värms upp av en cirkulerande vattenbad som kommer in genom the jacka inlopp (9) och utlopp (10) portar. En ring stativ används för att hålla den uppvärmda vatten jacka i vertikalt läge (röda klämmor, svart bas under den lila koniska rör rack). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk översikt av Perfusion System. Viktiga delar av Perfusion Apparater märks i enlighet med manuskriptet. Är strömningsriktning perfusion buffert indikeras med pilar. Notera placeringen av aortakanylen bör vars spets vara synlig genom den genomskinliga aorta, se till att den är placerad ovanför aortaklaffen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Isolerad vuxen mus Cardiomyocytes. Kardiomyocyter isolerades och sås på laminin-plattor med 96 brunnar som beskrivs i protokollet Häri. (A) Nyligen isolerade kardiomyocyter, seedade på ca 8000 celler / cm2. Observera att nyligen isolerade, livskraftiga cardiomyocytes visas ungefär stavformade med skarpa kanter (vit pil). Men kardiomyocyter som verkar ha en diffus yttre membran under bright är döda. Under de första dagarna av kultur, cardiomyocytes antar en rundad form (B). (C) Immunfärgning för alfa-actinin (grön) visar karakteristiska sarcomeric band i en cardiomyocyte på d1 efter isolering. Kärn fläck (DAPI) visas i blått. Topp visar zoomas bilden av skiss region i sämre bild. (D) (E) Brightfield och epifluorescent bilder visar kardiomyocyter vid dag 11 post-isolering transducerad med adenovirus som bär en GFP reporter under kontroll av en CMV-promotor ( en gåva från Robert Gerard vid Southwestern). Celler såddes vid ca 18.000 celler / cm 2 och transducerades på dag 0 med användning av en infektionsmultiplicitet av cirka 800 plackbildande enheter (PFU) per cell. Skala barer. 50 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
| Cardiomyocyte isoleringsbuffert (CIB) | |||
| Lägg 900 ml ultrarent vatten till en ren bägare enligt magmagnetisk omröring. | |||
| Tillsätt buffertkomponenter i tabellen som anges. | |||
| Komponent | MW | Slutlig Konc (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58,44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74,55 | 5,4 | 0,403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268,07 | 0,33 | 0,088 |
| MgSO 4 .7H 2 O | 246,48 | 0,5 | 0,123 |
| taurin | 125,1 | 30 | 3,753 |
| BDM | 101,1 | 10 | 1,011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| Glukos | 180,16 | 22 | 3,964 |
| Justera pH with 5 M NaOH. | |||
| Justera volymen till 1 L med ultrarent vatten. | |||
| Sterilt filter w / 0,22 | iM vakuumfilter. | |||
| Tillsätt 0,5 pl av 0,1 U / ml insulin per liter cardiomyocyte isoleringsbuffert. | |||
| perfusionsbuffert | |||
| Komponent | Slutlig | Volym (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mM | 0,2 | |
| Total | - | 200 | |
| digereringsbuffert | |||
| Komponent | Slutlig | Belopp | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1M) | 300iM | 4,5 | il | |
| Protease XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| kollagenas II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Total | - | 15 ml | |
| stoppbuffert | |||
| Komponent | Slutlig | Volym (ml) | |
| perfusionsbuffert | 95% | 14,25 | |
| CaCl2 (1M) | 1,5 mM | 22,5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Total | - | 15 ml | |
| odlingsmedia | |||
| Komponent | slutlig% | Volym (ml) | |
| MEM-medium | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0,2 | |
| Total | 100% | 100 ml | |
| Tillåta odlingsmedia till jämvikt vid 37 ° C, 5% koldioxid. | |||
Tabell 1: Lösningar och buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den allmänna hälsan hos de isolerade kardiomyocyter beror på flera viktiga aspekter av detta protokoll. Först, tiden från hjärtat utvinning till perfusion är kritisk och bör utföras i 5 min eller mindre. Borttagning av kalcium bidrar till att dissociera cell-cell interaktioner, men kan negativt påverka cell hälsa på lång sikt. 29-32 Därför finner vi det tillräckligt att avlägsna kalcium under de första minuterna av perfusion med EGTA (etylenglykol-tetraättiksyra) kelatering, 22 men snabbt återställa kalcium under matsmältningen och efterföljande steg.
Användningen av proteas XIV avsevärt förbättrar matsmältningen effektivitet jämfört med kollagenas ensam. Detta minskar inkonsekvens på grund av kollagenas parti variabilitet 18,24 och ökar renheten hos kardiomyocyter genom att underlätta separation under gravitationssedimentering. Ändå över matsmältningen hindrar effektiv fastsättning odlingssubstratet, så en fin balans is krävs för att optimera cell utbytet och renheten samtidigt cellvidfästning och livskraft upprätthålls. Sålunda kan koncentrationen av proteaser och längden på matsmältningen modifieras för att passa de experimentella mål. I allmänhet kommer en lägre grad av spjälkning förhöja fastsättning och överlevnad av kardiomyocyter. Användning av trypsin har rapporterats i vissa cardiomyocyte isoleringsprotokoll. 18 Tillsats av trypsin till proteas cocktail som används här (kollagenas och proteas XIV) minskar på lång sikt av kardiomyocyter i kultur, kanske på grund av över digestion eller klyvning av väsentlig yta och / eller extracellulära matrisproteiner.
Införandet av butandion monoxim (BDM) under isolering hämmar hjärtmuskelsammandragning, och därmed minskar negativa konsekvenser på grund av terminal kontraktur, energiförbrukning, och kalciumparadoxen. 29,33 Men i vår erfarenhet, avlägsnande av BDM före kultur påskyndar dedifferentiation och tillåter cellerna att anpassa sig till kulturen i två dimensioner.
Det är viktigt att notera att långsiktiga anpassningar till 2-D kultur kan påverka funktionella aspekter av cardiomyocytes, såsom kontraktilitet. Därför bör kontraktilitet och elektrofysiologi experiment utförs strax efter isolering, när infödda sarcomeric organisation är fortfarande intakt. Såsom med någon in vitro experiment, de celler i kultur saknar vissa yttre influenser närvarande in vivo, såsom humoral eller immun signalering. Å andra sidan, kan definierade samodlingar genomföras för att studera interaktioner mellan kardiomyocyter och andra celltyper. 5,34 Dessutom odling in vitro kan användas för att studera cardiomyocyte beteende med definierade molekylära signaler i odlingsmedia. Därför bör de övergripande målen för försöket övervägas noga och vägas mot de begränsningar och fördelar med denna kultursystem.
35 Det bör noteras att FBS och andra djur som härrör sera innehåller okända komponenter som kan påverka cellulär fysiologi . 36,37 Trots väl uppskattat närvaro av tillväxtfaktorer i FBS, gör 38 de cardiomyocyte kulturer som presenteras här inte föröka sig. Snarare verkar cellcykeln blocket att vara en ihållande egenskap hos vuxen mus cardiomyocytes ex vivo, upprätthålls från deras cellcykeln utgång under den perinatala perioden av utveckling. 12,39 Denna egenskap av stort intresse för området hjärt regenerativ medicin, där återgång av vuxna cardiomyocytes däggdjurs en proliferativ fenotyp har varit en kraftigt eftersträvas mål. 3,26,40-42 Noterbart är det för närvarande oklart vilken grad dedifferentiering krävs för kardiomyocyter att återinträda i cellcykeln, men contribution dedifferentiering regenerering i lägre ryggradsdjur är väl stöds 43,44,10,11 Vidare dedifferentiering alltmer observeras i cardiomyocyte spridning och hjärt förnyelse i däggdjurssystem, åtminstone på funktionell nivå, inklusive myofibrillar demontering 6,12,9 Därför bör tillståndet för differentiering av hjärtmuskelceller i kultur övervägas noga och modulerad i enlighet med de behov som forskningsmål. Som sådana kan de odlingsbetingelser potentiellt modifieras ytterligare för att minska serumkoncentrationen, använda definierade substitut serum eller serumfria medier. Exempelvis vuxen råttkardiomyocyter uppvisar organiserade sarkomerer odlades långsiktigt utan serum, men tillväxtfaktorer, såsom fibroblast-tillväxtfaktor, epidermal tillväxtfaktor, och trijodtyronin användes i definierade medier. 45 Det är tänkbart att liknande medieformuleringar, eller potentiellt andra formuleringar, såsom de som är anpassade från differentiation protokoll kan 46 användas för att upprätthålla väl differentierade vuxen mus kardiomyocyter i kultur som visar högt organiserade sarcomeric strukturer. Alternativa formuleringar kan också utvecklas för att uppnå andra fenotyper (t.ex. mycket de differentierade cardiomyocytes) 6 beroende på behoven hos försöket, men ytterligare arbete kommer att krävas.
Rollen av fibroblaster har varit inblandad i kontrollen av neonatal mus cardiomyocyte cellcykeln 5 och vuxen mus cardiomyocyte differentiering (genom hypertrofisk IL6 signalering) i långtidsodling. 19 Därför bör tillväxten av fibroblaster i kultur redovisas i experimentella tolkningar . Tillväxten av fibroblaster i odling kan regleras genom tillsats av tillväxt begränsa föreningar såsom cytosinarabinosid 19 (AraC) eller genom för-plating steg. 28 kommer dock AraC också hämma tillväxten av kardiomyocyter, så alternativmetoder bör användas för att kontrollera tillväxten av fibroblaster i undersökningar rörande cardiomyocyte cellcykeln. I det protokoll som beskrivs här, kan initial cardiomyocyte renhet förbättras genom att upprepa allvaret sedimenteringssteg (se 1.4.8).
Metoderna tillhandahålla häri en in vitro-system som kan användas för att studera arten av vuxna däggdjur cardiomyocyte cellcykelblockad. I motsats till primära celler från andra organismer, såsom råtta eller marsvin, primära mus kardiomyocyter erbjuder en mängd kraftfulla och väl karakteriserade genetiska verktyg, såsom Cre-baserade härstamning spårning knock-in-modeller, 47 som kan användas för att enkelt identifiera celler som härrör från redan existerande hjärtmuskelceller. 12,48 Dessutom har primär vuxna murina kardiomyocyter utsatts för de infödda utvecklings tillstånd som resulterar i cellcykelblockad, till skillnad från cellinjer och differentierade ES eller IPSC celler 46 som, trots sin convenience och anpassningsförmåga till stora läkemedels skärmar, 2 kan ha begränsad användbarhet i experiment sondera naturen av vuxna cardiomyocyte cellcykel exit.
Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för att isolera och kultur vuxen mus cardiomyocytes. Flera metoder har tidigare visat isolering av vuxna mus cardiomyocytes för korttidsstudie, men hittills finns det få rapporter om långvarig odling av vuxen-mus cardiomyocytes. 18,19 Förmågan att upprätthålla vuxen mus kardiomyocyter i kultur bör göra det möjligt studien in vitro av cardiomyocyte biologi under experimentella betingelser som kräver långsiktig undersökning. Till exempel kan genuttryck kan manipuleras med hjälp av adenovirusvektorer, som normalt kräver ett par dagar för att uppnå full uttryck. Senare fenotypiska förändringar och analys kan kräva ännu längre tid beroende på experimentella mål. De metoder som presenteras här tillåter odling av vuxen mus cardiomyocytes i flera veckor. Detta bör ge ett kraftfullt system för utredning av försiktiga frågor i cardiomyocyte biologi, såsom de som hänför sig till cellcykelreglering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Projektet har finansierats av UCSF Program för Genombrott biomedicinsk forskning (finansieras delvis av Sandler Foundation), NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) och Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ stöddes av en postdoktorsstipendium från NIH (T32HL007731). Författarna är ensam ansvarig för innehållet i detta arbete, vilket inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
